Espectrofotometría y Colorimetría

Determinación de la concentración de solutos

Dr.  Pedro  Domínguez  Luengo  

Departamento  de  Bioquímica  y  Biología  Molecular  
 Espectro de radiaciones electromagnéticas
La longitud de onda λ permite hacer una clasificación de las radiaciones del
espectro electromagnético. Éste presenta un rango continuo de variación, por lo
que las λ que definen los límites de cada región corresponden a valores orientativos,
y puede haber radiaciones con todas las λ posibles

más menos
energía energía

Energía asociada a la radiación: E = h f = h · c / λ

h: cte. de Planck f: frecuencia (hercios o ciclos/seg)
c: velocidad de la luz λ: longitud de onda

Intensidad, I: cantidad de energía que atraviesa

la unidad de área, perpendicular a la dirección de
propagación, por unidad de tiempo Dos ondas e.m. con la misma λ
pero distinta intensidad
 Absorción de la radiación UV-visible por la materia
Cuando la radiación electromagnética atraviesa una materia o medio, parte puede
ser absorbida y parte reflejada. Si es reflejada puede sufrir dispersión, refracción o
difracción. Cuando hay absorción, a veces tiene lugar una emisión posterior, que
provoca fluorescencia o fosforescencia
Un átomo o una molécula no pueden absorber radiación con cualquier valor de
energía, sino que los valores capaces de ser absorbidos están determinados por las
características atómicas y moleculares
Si a las moléculas de un medio llega una radiación Transición
cuya λ e intensidad I0 implican una energía ΔE con ΔE = h · c / λ electrónica
E*
un valor equivalente a la diferencia entre dos niveles
electrónicos (basal E0 y excitado E*), se produce E0
absorción y tendrá lugar una transición electrónica
de las moléculas entre ellos. En estos casos, la
intensidad de la radiación I tras atravesar el medio
es menor que la intensidad incidente I0. Se dice que
el medio tiene cromóforos
También hay fenómenos de absorción de energía
de menor cuantía, debidos a transiciones entre
niveles vibracionales o a oscilaciones moleculares

Espectroscopías: técnicas de análisis molecular basadas en el estudio de

las interacciones entre las radiaciones electromagnéticas y las moléculas
 Ecuación de Lambert-Beer
La espectrofotometría es la medición de la cantidad de energía radiante que absorbe
un sistema químico en función de la longitud de onda. Para medir esta absorción en la
región UV-visible-IR del espectro se usan los espectrofotómetros

Cubeta con una concentración c

de sustancia absorbente

En los estudios espectrofotométricos no se mide directamente la luz absorbida, sino

magnitudes basadas en las intensidades de la luz incidente I0 y transmitida I, como la
Absorbancia (A o Abs) y la Transmitancia (T), ambas adimensionales:
A = log ( I0 / I ) T = ( I / I0 ) 100 A = log 1 / T
Según la Ley y ecuación de Lambert-Beer: A=ε·c·l
La absorbancia es directamente proporcional a la concentración de soluto c y al
espesor del medio l (o camino óptico). Por tanto, si conocemos el factor ε, con un camino
óptico constante, la medida de A se puede usar para hacer medidas de concentración
El coeficiente de extinción molar ε se define como la Abs de una disolución 1 M de
un soluto para un paso óptico de 1 cm, a la longitud de onda que se esté midiendo. Los
espectrofotómetros permiten medir Abs y T a diferentes longitudes de onda
 Absorbancia y Transmitancia
Variación de la Absorbancia y la Transmitancia en función de la concentración

La absorbancia varía de forma

directamente proporcional a la
concentración de soluto
La transmitancia varía de A=εcl T = 10 – ε c l
forma exponencial inversa en
función de la concentración de
soluto

Carácter aditivo de la Absorbancia

La absorbancia de una disolución
es la suma de las absorbancias de
sus componentes
Ello permite descontar la
contribución del disolvente al
realizar la medida experimental de
la Abs de un soluto en disolución
De la misma forma, permite medir
la Abs de un solo compuesto en una
mezcla que contiene varios, gracias
al uso del llamado tubo blanco
 Aplicaciones de la espectrometría de absorción
a las biomoléculas

•  Espectroscopía de absorción UV-visible y espectrofotometrías de ácidos

nucleicos y proteínas
•  Colorimetrías: análisis de concentraciones con cromóforos coloreados
- Cálculo de la concentración de proteína a partir de medidas de absorbancia
•  Turbidimetrías
- Medida de la concentración de células de un cultivo
•  Ensayos enzimáticos
- Medida de la velocidad de una reacción catalizada por un enzima
•  Enzimoinmunoensayo (ELISA)
- Reacción colorimétrica para detectar inmunocomplejos antígeno-anticuerpo
 Espectroscopía de absorción de biomoléculas
Las proteínas, los carbohidratos y los ácidos nucleicos son moléculas complejas
que pueden absorber radiación a lo largo de un amplio intervalo del espectro, es decir
de una amplia gama de niveles de energía
Así, muchas biomoléculas pueden absorber energía de baja intensidad y experimentar
diferentes tipos de vibraciones y oscilaciones moleculares. Por ello la espectroscopía
infrarroja puede proporcionar información sobre su estructura molecular
Aunque la mayoría no absorben luz visible en cantidades significativas, hay algunas
proteínas coloreadas porque tienen grupos prostéticos (como el hemo) o iones
metálicos (como Cu o Zn), que les confieren absorción en el rango visible

La espectroscopía de absorción UV-visible se

puede aplicar para la detección y cuantificación
de ácidos nucleicos y proteínas, registrando su
absorbancia a 260 ó 280 nm, respectivamente
Los ácidos nucleicos absorben en la zona del
UV gracias a sus bases nitrogenadas, con una
λmax a 260 nm. Así, la medida de la A260 se usa
para medir la concentración de DNA y de RNA

1 U Abs260 = 50 µg DNA / ml
1 U Abs260 = 40 µg RNA / ml
Espectros de absorción de ácidos
nucleicos y proteínas en el UV próximo
 Espectrofotometría de ácidos nucleicos
Curva de
Además, las medidas de A260 se pueden usar para
desnaturalización
estudiar la desnaturalización de los ácidos nucleicos, de un DNA ante
o sus interacciones con proteínas u otros ligandos temperaturas ssDNA  
crecientes
Si se representa la A260 de una disolución de un DNA
en función de la temperatura se ve una curva sigmoidal
A temperatura baja está como DNA de doble hélice o
dsDNA, y el apilamiento de las bases en su interior
provoca una disminución de su capacidad de absorción dsDNA  
Al aumentar la temperatura, el DNA se va abriendo o
desnaturalizando, dando hebras sencillas o ssDNA.
Por ello desaparece el bloqueo de la absorción por las
bases y aumenta la A260: es el efecto hipercrómico
La temperatura de fusión o melting Tm es el punto
medio en la desnaturalización del dsDNA a ssDNA. Es
característico para cada molécula de DNA porque su
valor depende de su composición en bases: a mayor
contenido de G+C, más alta es su Tm
La Tm también aumenta con la fuerza iónica o
concentración salina
Ambas características tienen repercusiones de gran
interés a nivel biológico y técnico
Tm (ºC)
 Espectrofotometría de proteínas
Cromóforos proteicos

Aminoácidos Grupos
aromáticos prostéticos

Enlace
peptídico

UV lejano UV próximo Visible

La región de mayor absorción por las proteínas es el intervalo 180-220 nm, debido a
las transiciones electrónicas que provoca la absorción de energía por los enlaces
peptídicos. Sin embargo, esta zona no se suele usar para realizar medidas, porque
hay muchos otros compuestos biológicos que también absorben en ella
En el intervalo de 230-300 nm hay absorción por los grupos aromáticos de Trp, Tyr
y Phe. Por ello, para medir la concentración proteica normalmente se suele usar la
A280, ya que a esa λ no absorben otros compuestos. Aunque varía con las proteínas
porque depende de su composición en aminoácidos, aproximadamente:
1 U A280 ≈ 1 mg de proteína / ml
Como mencionamos, algunas proteínas tienen grupos prostéticos o iones metálicos,
que suelen presentar absorción en la zona del visible, con λmax características de cada
uno a las que se pueden medir y estudiar las proteínas correspondientes
 Colorimetría. Determinación de la concentración de proteína
Además de la medida directa, la concentración de proteína se puede medir mediante
métodos colorimétricos basados en la generación de cromóforos por un método
químico. En general, estos métodos dan mayor especificidad y sensibilidad
 Recta (o curva) patrón
Cuando no se conoce o no es aplicable el coeficiente de extinción molar ε, que
permite correlacionar absorbancia y concentración, hay que realizar una recta de
calibrado o recta patrón para cada experimento
Esta permite calcular la correlación entre cantidad de proteína y absorbancia, y
por tanto calcular la concentración de una muestra problema de Abs conocida

A510

y = 0,0034 x
0,24 = 0,0034 x
x = 0,24 / 0,0034 = 70 µg de proteína
en el tubo problema
Proteína (µg)

Una vez conocida la cantidad de proteína en la muestra problema, la dividimos por

el volumen de la misma añadido al tubo de ensayo, para calcular su concentración
 Turbidimetrías
Un turbidímetro mide la turbidez de una muestra, que se debe a la presencia de
partículas sólidas en suspensión en una solución. Éstas absorben o dispersan la
luz, provocando una absorbancia aparente. Como en este caso no se mide solo
absorción de luz, se suele hablar de densidad óptica (OD)
Un ejemplo clásico es la medida de la A600 para estimar la concentración o densidad
de bacterias en un cultivo, que suele ser un parámetro experimental de interés para
medir su tasa o estado de crecimiento

OD600
 Ensayos enzimáticos
Consisten en realizar una medida de la velocidad inicial
V0 de una reacción enzimática mediante la medida del

V0 nM/seg
aumento de la absorbancia del producto de la reacción en
función del tiempo, que es proporcional a su aumento de
concentración. Se puede hacer usando productos
coloreados, fluorescentes o luminiscentes
Cuando la concentración de sustrato es saturante, V0 es
proporcional a la cantidad o concentración de enzima
[E] µM

Sustratos cromogénicos
Lo más habitual es usar un sustrato cromogénico sintético que no absorbe luz de una λ
determinada, y que el enzima transforma en un producto que sí la absorbe
Entre los sistemas cromogénicos más
empleados están los que usan el para-
nitrofenol o la para-nitroanilina como
producto final coloreado, que tienen un No absorbe a 410 nm Absorbe
a 410 nm
máximo de absorción a 405-410 nm
Para ello se sintetiza un sustrato en el
que el cromógeno esté unido a un radical Tripsina
molecular susceptible de ser atacado
por el enzima que se desea medir. Esa Nα-Benzoil-L-Arginina p-Nitroanilida Nα-Benzoil-L-Arginina p-Nitroanilina
unión provoca que el reactivo no absorba
 Ensayos enzimáticos

Muchas reacciones usan el par NAD+/NADH, y se

puede medir su velocidad en función del cambio en
A340, donde solo absorbe el NADH

Absorbancia
lactato deshidrogenasa:
piruvato + NADH + H+ ↔ lactato + NAD+
Además, estos enzimas y reacciones se pueden
emplear para medir otras reacciones acopladas a
ellas a través de un intermediario común
Por ejemplo, la medida de alanina aminotransferasa
se puede acoplar a la lactato deshidrogenasa a través
del piruvato, poniendo todos los reactivos y enzimas
en el mismo tubo
alanina aminotransferasa:
alanina + α-cetoglutarato ↔ piruvato + glutamato
lactato deshidrogenasa:
piruvato + NADH + H+ ↔ lactato + NAD+

actividad de la alanina aminotransferasa  aparición piruvato 

 reacción con NADH  bajada en A340

Así se puede medir la actividad de la alanina aminotransferasa midiendo la A340

 Inmunodetección de proteínas por ELISA
(Enzyme-linked immunosorbent assay)
Hay distintas variantes de ELISA, en función del tipo de análisis que se haga.

Lavar Lavar Lavar

Pocillo recubierto La proteína se une Un segundo anticuerpo Un sustrato es convertido

de anticuerpos a su anticuerpo unido a un enzima se une por el enzima en un
contra la proteína a la proteína inmovilizada producto coloreado, cuyo
de interés nivel es proporcional al de
proteína inicial
Placa y espectrofotómetro para medidas de ELISA

La absorbancia en cada pocillo es

proporcional a la cantidad de proteína
presente, que se puede medir usando como
referencia una recta patrón o de calibrado