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UNIVERSIDAD DISTRITAL FRANCISCO JOSE DE CALDAS LABORATORIO DE BIOQUÍMICA GUIA Nº 7 AISLAMIENTO Y CUANTIFICACIÓN DE GLUCÓGENO

PROFESORA: ADIS AYALA FAJARDO

OBJETIVOS

1. Extraer del tejido hepático o muscular el carbohidrato de reserva más importante en los mamíferos y otros organismos.

2. Aplicar la hidrólisis del glucógeno como técnica in Vitro para obtener glucosa.

3. Cuantificar por el método de Antrona el glucógeno extraído de diferentes muestras biológicas y una muestra problema.

4. Determinar el porcentaje de glucógeno presente en tejido hepático y muscular para diferentes muestras biológicas.

5. Establecer que defectos enzimáticos producen valores aumentados o disminuidos de Glucógeno.

PREPARACIÓN PREVIA

1. Repase el proceso de la glucogenólisis y glucogénesis.

2. Lea el fundamento y el procedimiento de la practica.

INTRODUCCIÓN

El glucógeno es un homopolisacárido y fue aislado del hígado por primera vez por Claude Bernard en 1856. Se ha encontrado en bacterias, algas, levaduras y también existe en animales inferiores como las ostras y mejillones dándoles a estos alimentos una mayor consistencia y valor gastronómico.

El glucógeno es la reserva esencial de glucosa en los animales superiores; se sintetiza en todos los tejidos animales, pero en mayor proporción en el citoplasma del hepatocito y miocito por la acción de dos enzimas la glicógeno sintasa y la glucosil α (46) transferasa sobre un precursor de glucógeno (conformado por 8 residuos de glucosa) que esta unido a una proteína llamada glucogenina. La glicógeno sintasa permite la unión secuencial de unidades de α D-glucosa provenientes de la UDP glucosa mediante enlaces lineales α (14) y la glucosil α (46) transferasa forma puntos de ramificación por la transferencia de 7 residuos de una rama interna hacia otra posición en la misma cadena o hacia otra cadena de glucógeno generando la unión de dos residuos de glucosa con enlace α (16), esto hace que la estructura presente un aspecto arborescente como la amilopectina. Las ramificaciones le dan al glucógeno un carácter compacto permitiéndole ocupar una menor cantidad de espacio, como también permiten una alta solubilidad e incremento de los extremos no reductores [1].

El peso molecular del glucógeno varía según su origen; es del orden de 1 a 5 x106, el hígado resulta de la condensación de 30.000 unidades de glucosa. Su estructura molecular le confiere propiedades que se pueden utilizar para aislarlo eficientemente, purificarlo y cuantificarlo mediante técnicas específicas.

PRINCIPIO Para el análisis cuantitativo del glucógeno; el tejido es sometido a hidrólisis ácida con HCl para liberar moléculas de glucógeno. El rompimiento del tejido también libera proteínas y otras sustancias que son

precipitadas por el ácido tricloroacético y el proceso de centrifugación. Las unidades de glucógeno liberadas

por el proceso de hidrólisis son solubles en el sobrenadante y son precipitadas al incubar éste con etanol en frío. El glucógeno recuperado es hidrolizado para producir unidades de glucosa que en presencia de ácido sulfúrico se deshidratan para producir furfurales que reaccionan con la Antrona generando un aumento de la absorbancia que se lee a 625 nm contra una curva de calibración construida con estándares de glucógeno de

8 mg % -2 mg %.

MATERIAL DE PRUEBA

Hígado y músculo frescos (Estudiantes)

Ostras crudas. (Estudiantes)

PROCEDIMIENTO

PRIMERA PARTE EXTRACCIÓN DE GLUCÓGENO POR HIDRÓLISIS ACIDA:

1. Rotule el tubo y la tapa de 4 tubos falcon de 15 ml y pese dos de estos con ayuda de un beaker o espuma según sea el caso y guárdelos para el paso 10. Registre su peso en Tabla 1 análisis cuantitativo Anexo 7.

2. Con ayuda de guantes y un bisturí corte un fragmento de la parte interna del tejido, asegurándose de no tomar adipositos ni membranas.

3. Pese en balanza analítica entre 0.5- 1 g de tejido o una cuarta parte del tejido disponible y registre el valor en la Tabla 1 análisis cuantitativo Anexo 7.

4. Homogenice en un mortero cada tejido con 0.5 g de arena lavada autoclavada mas 1 ml de ácido clorhídrico 6 N hasta obtener una pasta de consistencia suave. Tenga cuidado de no esparcir el tejido por todo el mortero, porque perderá tejido y por lo tanto analito.

5. Agregue 1 ml de solución salina fisiológica 0.85 % p/v.

6. Adicione 2.5 ml de TCA al 10% (p/v) y transfiera la mayor parte del tejido macerado a un tubo de 15 ml.

7. Adicione 2.5 ml de TCA al 10% (p/v) y recupere la mayor parte del tejido remanente que queda en el mortero y la mano.

8. Equilibre y centrifugue por 6 minutos a 4.000 r.p.m.

9. Tome el sobrenadante con ayuda de una micropipeta y pase a los tubos de 15 ml que pesó y rotuló en el numeral 1.

10. Agregue 2 ml de etanol absoluto y deje en nevera 12 horas a 4° C, compruebe que queden bien tapados cubra la tapa con papel parafilm o cristaflex y colóquelos en una gradilla, si no los va a procesar al día siguiente guárdelos a -20 °C hasta su uso.

PRIMERA PARTE EXTRACCIÓN DE GLUCÓGENO POR HIDRÓLISIS BASICA:

1. Rotule el tubo y la tapa de 4 tubos de 1.5 ml (dos para músculo y dos para hígado), pese dos de estos con ayuda de una espuma y guárdelos para el paso 5. Registre su peso en Tabla 2 análisis cuantitativo Anexo 7.

2. Corte un fragmento de la parte interna del tejido con ayuda de guantes y un bisturí, asegurándose de no tomar adipositos ni membranas para los diferentes tejidos y pese para cada uno entre 10- 60 mg en la balanza analítica sobre un papel aluminio. Registre el valor que tomó en la Tabla 2 del Anexo 7.

3.

Ponga cada uno de los tejidos en el tubo correspondiente que no peso, agregue 50 mg de arena lavada autoclavada mas 60 μl de KOH 6 N y homogenice el tejido con ayuda de una varilla de vidrio de punta roma hasta obtener una pasta de consistencia suave.

4. Agregue 600 µl de H2O fría, homogenice mediante agitación por vortex y centrifugue a 10.000 r.p.m por 2 min.

5. Recupere cada sobrenadante a los tubos que peso en el numeral 1 y adicione 200 µl de etanol al 80%. Asegúrese que estén bien tapados, cubra la tapa con papel parafilm o cristaflex y colóquelos en una gradilla, si no los va a procesar al día siguiente guárdelos a -20 °C hasta su uso.

SEGUNDA PARTE CUANTIFICACIÓN DE GLUCÓGENO :

1. Programe el baño de María hasta que alcance la temperatura de ebullición.

2. Centrifugue los tubos de 15 ml y 1.5 ml a 4000 r.p.m por 5 min a 4 ° C, si hay lípidos elimine la capa de grasa con ayuda de una micropipeta y vuelva a centrifugar. Asegúrese de que el pellet este fuertemente unido para no perderlo.

3. Descarte el sobrenadante por inversión rápida del tubo y coloque sobre el tubo invertido una tolla secante para eliminar la mayor cantidad de etanol posible.

4. Deje que cada muestra se evapore totalmente a temperatura ambiente en cámara de flujo laminar ó con corriente de aire y establezca el peso del pellet recuperado (glucógeno), determine el factor de dilución aproximado que debe aplicar para que las muestras entren en la curva de calibración (0.02 mg/ml-0.08 mg/ml), exprese el peso en mg /mL.

5. Resuspenda el precipitado en agua destilada mediante agitación por vortex y evite que queden grumos sin disolver, si el peso obtenido es húmedo divida por 3 ó aplique la siguiente relación verificando que su calculo entra en la curva de calibración, por ejemplo:

a. mg de Hígado /1-5 ml H2O

b. mg de Músculo / 0.5 -1 ml H2O

6. Tenga en cuenta la capacidad del baño de María antes de iniciar el procedimiento.

7. Encendida la cabina de extracción y dentro de ésta procese los estándares y las muestras de acuerdo a los volumenes indicados en Tabla 1 (para los espectrofotómetros análogo y digital). Trabaje la mitad del volumen para los colorímetros y el espectrofotómetro Perkin Elmer.

8. Realice el procedimiento en una secuencia rápida, tape la parte superior de cada tubo con papel parafilm o vinilpel y ábrale un pequeño orificio con un lápiz a cada uno. Esto se realiza para puedan salir los vapores del ácido y de impedir que en el proceso de incubación dentro del baño de María entren gotas de agua caliente producto de la condensación del vapor agua sobre el ácido y así evitar accidentes.

Tabla 1. Metodología para cuantificación de glucógeno.

     

Patrones Glucógeno

 

Muestras

Reactivo

Blanco

1

2

3

Músculo

Músculo

Hígado

2 mg/dl

4 mg/dl

8 mg/dl

1/5

1/25

1/200

Agua

0,6 ml

0.45

ml

0.3 ml

       

Patrón de

 

0.15

ml

0.3ml

0,6 ml

-

-

-

glucógeno 8

 

mg/ dL

Muestra H

           

0,6 ml

Muestra M

 

-

-

-

0,6 ml

0,6 ml

 

Antrona

2,4 ml

2,4 ml

2,4 ml

2,4 ml

2,4 ml

2,4 ml

2,4 ml

9. Incube en un baño de María en ebullición durante 10 minutos exactos.

10. Pare la reacción sumergiendo la base de los tubos en agua fría y lea contra el blanco de reactivos a 625 nm.

11. Descarte los residuos en el colector correspondiente, teniendo precaución de voltear la cara para evitar accidentes en sus ojos y rostro.

CALCULOS

1. Calcule los mg de glucógeno recuperado por los dos métodos de acuerdo a los datos que proceso en su Tabla 1 Anexo 7.

2. Registre los valores de la curva de calibración en la Tabla 2 Anexo 7 y estime los valores de intercepto, pendiente, coeficiente de correlación y la concentración de glucógeno en las muestras analizadas.

Tabla 2. Datos de la curva calibración de glucógeno y valores de glucógeno en muestras problema por el método de la antrona.

   

Volumen

       

Grupo

Glucógeno

mg

Resuspendido

ml

Fd

mg/dL

Abs

Concentración

mg/dL

Blanco reactivos

   

1 Estándar

2.5

   

2 Estándar

5

   

3 Estándar

10

   

4 Hígado

           

5 Musculo

           

6 Hígado Eppendorf

           

7 Musculo Eppendorf

           

a

           

b

           

r

           

3. Exponga el resultado en porcentaje de glucógeno por peso de tejido húmedo o seco según sea el caso.

INVESTIGACIÓN PARA SU ARTÍCULO

1. ¿Qué otras moléculas precipitan con TCA al 10%?

2. ¿De qué esta conformado el pellet que se descartó?

3. ¿Por qué el etanol precipita el glucógeno?

4. ¿Cuáles métodos colorimétricos se pueden utilizar para cuantificar el glucógeno?

5. ¿Qué diferencia(s) hay en la síntesis de glucógeno para plantas (amiloplastos) y bacterias?

6. ¿Cuál es el método mas avanzado para cuantificar glucógeno?

7. ¿Cuál es la composición y el mecanismo de acción del lugol para producir colores característicos con: el glucógeno, la amilosa, la amilopectina, la celulosa y el almidón? Elabore una tabla comparativa.

RESULTADOS

1. Describa las diferencias y semejanzas entre el almidón y el glucógeno mediante estructuras.

2. Determine que reacciones que se llevaron a cabo en la práctica.

3. Procese la Tabla 1- 2 del Anexo 7 para músculo e hígado y calcule el porcentaje de glucógeno hepático y muscular observado.

4. Anexe la curva de calibración e interpole las muestras analizadas, adjunte la Tabla 2 del Anexo 7 con la corrección por mínimos cuadrados (valores de coeficiente de correlación, pendiente e intercepto), factores de dilución que aplicó a sus muestras y despeje la concentración de estas de los datos obtenidos por corrección de mínimos cuadrados.

5. Determine el porcentaje de error de glucógeno en las diferentes muestras del valor obtenido al despejar su concentración en mg/dL de los datos obtenidos por mínimos cuadrados teniendo en cuenta que el porcentaje de glucógeno esperado en humanos para hígado es de 6% y para músculo

1-2%.

6. Discuta que ocurre a nivel metabólico con la cantidad de glucógeno hallado en las diferentes muestras biológicas analizadas.

7. Determine con los análisis cuantitativos si la muestra problema analizada es normal o hay un defecto enzimático, de ser así discuta a que problema(s) metabólico(s) podría corresponder y soporte sus hallazgos con un artículo.

8. Elabore una tabla que resuma las enfermedades que se originan por defectos en glucogénesis y glucogenólisis, esta debe describir la enzima deficiente; el tejido (hígado / músculo); características de la enfermedad; estructura del glucógeno normal, similar a almidón, amilopectina, dextrina, dextrina límite etc; concentración de glucógeno normal, aumentada, disminuida etc y tratamiento.

BIBLIOGRAFÍA

1. NELSON, D. L., & COX, M. M. (2000). Lehninger Principles of Biochemistry. New York: Worth Publishers 736-739.

BIBLIOGRAFÍA PARA CONSULTA

1. ALEMANY, M. Y FONT, S. Prácticas de Bioquímica. España: Alambra, 1983.

2. PLUMMER, R.D. Bioquímica Práctica. México: Mc Graw-Hill Latinoamérica, 1981.

3. RENDINA, G. Técnicas de Bioquímica Aplicada: México Interamericana, 1974.

4. WILBRAHAM, A.C. Y MATTA, M. S. Introducción a la Química Orgánica y Biológica. México:

Addison-Wesley. Iberoamericana, 1989.

5. WHITE, A. Y HANDLER, R. Principios de Bioquímica. Bogotá: Mc Graw-Hill, 1982.

ANEXO 7. Aislamiento y Cuantificación de Glucógeno

Tabla 1 Glucógeno recuperado por hidrólisis ácida, básica y sin hidrólisis

 

Cuantitativo

Cuantitativo

Cuantitativo

Cuantitativo

Cuantitativo

Cuantitativo

Cuantitativo

Cuantitativo

Cuantitativo

Cuantitativo

Hígado B

Hígado B

Hígado B

Hígado B

Hígado B

Musculo

Musculo

Musculo

Musculo

Musculo

Grupo

Peso mg tubo

Peso mg tubo 15

Peso mg glucógeno

mg glucógeno

%

Error

Peso mg tubo 15

Peso mg tubo 15 ml

Peso mg

mg glucógeno

%

Error

15 ml vacio

ml con

observado

esperados

 

ml

vacio

con glucógeno

glucógeno

esperados

 

glucógeno

 

observados

1

                   

2

                   

3

                   

4

                   

5

                   

6

                   

7

                   

8

                   
 

Cuantitativo

Cuantitativo

Cuantitativo

Cuantitativo

Cuantitativo

Cuantitativo

Cuantitativo

Cuantitativo

Cuantitativo

Cuantitativo

Hígado B

Hígado B

Hígado B

Hígado B

Hígado B

Musculo

Musculo

Musculo

Musculo

Musculo

Grupo

Peso mg tubo

Peso mg tubo

Peso mg glucógeno

mg glucógeno

%

Error

Peso mg tubo 1.5

Peso mg tubo 1.5 ml

Peso mg

mg glucógeno

%

Error

1.5 ml vacio

1.5 ml con

observado

esperados

 

ml

vacio

con glucógeno

glucógeno

esperados

 

glucógeno

 

observado

1

                   

2

                   

3

                   

4

                   

5

                   

6

                   

7

                   

8

                   
ANEXO 7. Aislamiento y Cuantificación de Glucógeno Tabla 2. Datos de la curva calibración de
ANEXO 7. Aislamiento y Cuantificación de Glucógeno
Tabla 2. Datos de la curva calibración de glucógeno y valores de glucógeno en muestras problema por el método de la antrona.
Volumen
Glucógeno
Concentración
Glucógeno
Volumen
Concentración
Grupo 1
Resuspendido
Fd
mg/dL
Abs
Grupo 2
Fd
mg/dL
Abs
mg
mg/dL
mg
Resuspendido ml
mg/dL
ml
Blanco reactivos
Blanco reactivos
− −
1 Estándar
2.5
1 Estándar
− 2.5
2 Estándar
5
2 Estándar
− 5
3 Estándar
10
3 Estándar
− 10
4 Hígado
4 Hígado
5 Musculo
5 Musculo
6 Hígado Eppendorf
6 Hígado Eppendorf
7 Musculo Eppendorf
7 Musculo Eppendorf
a
a
b
b
r
r
Volumen
Glucógeno
Concentración
Glucógeno
Volumen
Concentración
Grupo 3
Resuspendido
Fd
mg/dL
Abs
Grupo 4
Fd
mg/dL
Abs
mg
mg/dL
mg
Resuspendido ml
mg/dL
ml
Blanco reactivos
Blanco reactivos
− −
1 Estándar
2.5
1 Estándar
− 2.5
2 Estándar
5
2 Estándar
− 5
3 Estándar
10
3 Estándar
− 10
4 Hígado
4 Hígado
5 Musculo
5 Musculo
6 Hígado Eppendorf
6 Hígado Eppendorf
7 Musculo Eppendorf
7 Musculo Eppendorf
a
a
b
b
r
r
Volumen
Glucógeno
Concentración
Glucógeno
Volumen
Concentración
Grupo 5
Resuspendido
Fd
mg/dL
Abs
Grupo 6
Fd
mg/dL
Abs
mg
mg/dL
mg
Resuspendido ml
mg/dL
ml
Blanco reactivos
Blanco reactivos
− −
1 Estándar
2.5
1 Estándar
− 2.5
2 Estándar
5
2 Estándar
− 5
3 Estándar
10
3 Estándar
− 10
4 Hígado
4 Hígado
5 Musculo
5 Musculo
6 Hígado Eppendorf
6 Hígado Eppendorf
7 Musculo Eppendorf
7 Musculo Eppendorf
a
a
b
b
r
r

Peso tejido Hígado y Musculo Esquelético

 

Cuantitativo H

Cuantitativo M

Cuantitativo H

Cuantitativo M

   

Grupo

Hidrólisis Ácida

Hidrólisis Ácida

Hidrólisis Básica

Hidrólisis Básica

Cualitativo H

Cualitativo M

1

           

2

           

3

           

4

           

5

           

6

           

7

           

8

           

9

           

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