ATAGOISMO in vitro E in vivo CO Pseudomonas spp.

fluorescentes Y Bacillus

spp. SOBRE Botrytis cinerea pers. AISLADOS DE SUELO Y MATERIAL

VEGETAL DEL CULTIVO FLORES SILVESTRES S.A. C.I.

PIEDAD CECILIA LOPERA YEPES

FELIPE TORO MEJÍA

Trabajo de investigación presentado como requisito para optar al título de Biólogo

Asesor(a):
ADYA LOREA CARDOA BUSTOS
M.Sc, PhD.

Co-asesor
CAMILO ADRÉS RAMÍREZ
M.Sc, Candidato a PhD.

Universidad de Antioquia
Facultad de Ciencias Exactas y aturales

Medellín-Colombia

2009
A mi hijo Shamadi por ser el motor que mantuvo vivo el esfuerzo y la esperanza,

a mis padres por su apoyo incondicional,

a Alexey por su gran amor y su constancia,

a la vida porque en cada esquina

me tiene un regalo nuevo

Piedad Lopera.

Al Universo por brindarnos una mar de secretos por descubrir

A GAIA, para que el quehacer del hombre la afecte lo menos posible

A Ori, por abrir un nuevo Universo

Felipe Toro.

A nosotros por apropiarnos de este trabajo,

ponerle el alma

y hacer un buen equipo.

Piedad y Felipe.

2
La agricultura implica la simplificación de la biodiversidad natural
y alcanza su forma más extrema en los monocultivos.

Altieri y %icholls, 1994.

3
 AGRADECIMIENTOS

A la profesora Nadya Lorena Cardona no solamente por ser la directora de la investigación,

sino también por propiciar este trabajo de gran valor para el gremio universitario y

floricultor, además por todo su apoyo, por su enseñanza y paciencia y su gran disposición

con el trabajo y con nosotros.

Al profesor Camilo Andrés Ramírez por su disposición para responder preguntas, por

brindarnos su valiosísimo conocimiento, por su confianza y por permitir el nivel

investigativo que alcanza el proyecto.

A la empresa Flores Silvestres S.A. C.I. por contactar la Universidad de Antioquia, permitir

que se realicen este tipo de investigaciones y financiar el proyecto, especialmente al

departamento de Biorregulación de la compañía por su gran labor investigativa en control

biológico y amigable con el medio ambiente.

Al laboratorio de control microbiológico de la Universidad de Antioquia por abrirnos sus

puertas y cofinanciar el proyecto, así como a todas las personas que nos apoyaron y

estuvieron dispuestas a generar ideas y actitudes en pro del trabajo: María Ramírez, Omaira

Ramírez, Jaime Calle, Diego Salazar, Juan Esteban Pérez, David Borrero y Ana María

Suárez. Al laboratorio de control de microbiología general.

4
A todos los amigos y profesores que con su actitud y amistad generaron en nosotros la

pasión por hacer las cosas bien y por no cansarnos de indagar sobre el mundo maravilloso

del conocimiento.

5
 RESUMEN

Se evaluó la capacidad de cepas de dos géneros de bacterias, Pseudomonas spp.

fluorescentes y BAFE para antagonizar tanto in vivo como in vitro el hongo B. cinerea
sobre crisantemos de exportación. Se estableció una colección con 217 rizobacterias
aisladas de suelo poco intervenido de un cultivo de flores. De estas, 87 aislados
pertenecieron al grupo BAFE y 130 al grupo Pseudomonas spp. fluorescentes. En todos
los aislados se examinó el antagonismo in vitro de una forma cualitativa, de este montaje
se observaron 64 Pseudomonas spp. fluorescentes y 4 BAFE con capacidad de antagonizar
el hongo; a estas 68 cepas se les evaluó el porcentaje de antagonismo mediante pruebas
cuantitativas. Se obtuvo que 14 cepas del grupo de las Pseudomonas presentaban un
antagonismo mayor al 90%, mientras que del grupo de los BAFE solo 4 presentaban un
antagonismo mayor al 76%. Se seleccionaron los 4 BAFE y la cepa de Pseudomona con
mayor porcentaje de antagonismo (97,4) para realizar pruebas en invernadero sobre plantas
de crisantemo de la variedad Delistar Yellow. Se evaluaron la incidencia y la severidad de
la enfermedad en presencia de los 5 aislados bacterianos donde cada uno representaba un
tratamiento, se tuvieron como testigos dos controles, uno inoculado solo con hongo (testigo
positivo) y otro sin ningún tipo de inoculación (testigo negativo). Al evaluar la incidencia
una semana después de la inoculación tanto de bacterias como de hongo se encontró que
todas las cepas presentaron una disminución de la enfermedad con respecto al control
positivo, la segunda semana solo la cepa FSB84 mantiene diferencias estadísticas, mientras
que para la tercera y cuarta semana todos los tratamientos incluyendo el control negativo
presentan una incidencia del 100%. Para la severidad, solo el FSB84, la FSB58 y la FSB65
disminuyeron la severidad frente al control positivo la primer semana después de la
inoculación, dos y tres semanas después solo el control negativo presenta diferencias.

Palabras clave: Antagonismo, Botrytis, Pseudomonas fluorescentes, BAFE.

6
 ABSTRACT

The antagonism capacity of two bacterial genera, Pseudomonas spp. fluorescens and
aerobic bacilli forming spore (ABFS), against the plant-pathogenic fungi B. cinerea was
evaluated. A collection of 217 rhizobacterium isolated from less intervened soil was
obtained. Eighty-seven strains belong to de ABFS genera and 130 to the Pseudomonas spp.
fluorescens. The in vitro antagonism of all strains was assessed qualitatively. From this
assay, 64 Pseudomonas spp. fluorescens and 4 ABFS resulted with a potential of
antagonism against B. cinerea. The antagonism percentage of those 68 strains was
measured through quantitative in vitro tests. Fourteen strains of Pseudomonas spp.
fluorescens showed an antagonism increased 90%. On the other hand, 4 isolates of the
group of ABFS showed a greater antagonism than 76%. The strains with the highest
percentage of antagonism, were selected for testing in greenhouse on plants of
chrysanthemum of the variety Delistar Yellow, and the incidence and severity were the
factors evaluated. The positive control was inoculated with fungi and the negative control
wasn´t inoculated. One week after the inoculation, all the strains showed a decrease of the
disease in contrast with the positive control. At the second week, only one of the ABFS
(FSB84 strain) showed a statistical difference. At the third and fourth week all the
treatments showed an incidence of 100%, including the negative control. At the first week
after inoculation, just the strains FSB 84, FSB 58 and FSB 65 diminished the severity, in
contrast with the positive control. Only the negative control showed differences, at the
second and third weeks after inoculation.

Key words: antagonism, Botrytis, Pseudomonas fluorescens, ABFS.

7
 TABLA DE CONTENIDO

INTRODUCCIÓN .......................................................................................................... 10
1. ESTADO DEL ARTE ................................................................................................ 13
1.1Generalidades del crisantemo .................................................................................... 13
1.2 Descripción del Chrysanthemum .............................................................................. 14
1.3 Características generales de Dendranthema grandiflora ......................................... 14
1.4 Generalidades del control biológico ......................................................................... 15
1.5 Etiología de B. cinerea.............................................................................................. 18
1.6 Morfología y ciclo de vida de B. cinerea .................................................................. 18
1.7 Mecanismos de acción de B. cinerea en la flor ........................................................ 20
1.8 Control biológico de B. cinerea con Bacillus spp. y Pseudomonas spp. .................. 24
1.8.1 Bacillus spp. ........................................................................................................... 25
1.8.2 Pseudomonas spp. .................................................................................................. 27
1.9 Manejo de B.cinerea en invernadero ........................................................................ 28
2. FORMULACIÓN DEL PROBLEMA........................................................................ 30
3. HIPÓTESIS DEL TRABAJO ..................................................................................... 32
4. OBJETIVOS ............................................................................................................... 32
4.1 Objetivo General ....................................................................................................... 32
4.2 Objetivos específicos: ............................................................................................... 32
5. JUSTIFICACIÓN ....................................................................................................... 33
6. METODOLOGÍA ....................................................................................................... 36
6.1 Objetivo 1: Obtener una colección de rizobacteriass. ............................................. 36
6.1.1 Recolección de material para aislamiento de bacteria. ..................................... 36
6.1.2 Aislamiento y almacenamiento de rizobacterias. .................................................. 36
6.2 Objetivo 2: Pruebas de antagonismo in vitro ........................................................... 39
6.2.1 Recolección de material para aislamiento de B. cinerea ..................................... 39
6.2.2 Aislamiento de B. cinerea ..................................................................................... 39
6.2.3 Pruebas cualitativas .............................................................................................. 40
6.2.4 Pruebas cuantitativas ............................................................................................ 41
6.3 Objetivo 3: Evaluar las cepas con mayor potencialantagonico en invernadero 44
6.3.1 Preparación del inóculo ........................................................................................ 44
6.3.2 Siembra y cultivo ................................................................................................... 46
6.3.3 Diseño experimental .............................................................................................. 49
6.3.4 Aplicación del inóculo ........................................................................................... 51
6.3.5 Factores ................................................................................................................. 53
6.3.6 Análisis estadístico ................................................................................................ 54
6.4 Objetivo 4: Identificar la especie de la(s) cepa(s) con mayor potencial antagónico en
campo. ............................................................................................................................. 56
7. RESULTADOS Y DISCUSION ................................................................................ 57
7.1 Muestro y aislamiento de rizobacterias..................................................................... 57
7.2 Pruebas de antagonismo in vitro ............................................................................... 58
7.2.1 Pruebas cualitativas .............................................................................................. 58
7.2.2 Pruebas cuantitativas ............................................................................................ 59
7.3 Pruebas de antagonismo en invernadero ................................................................... 64
7.4 Identificar la especie de la(s) cepa(s) con mayor potencial antagónico en campo. .. 71

8
9. CONCLUSIONES ...................................................................................................... 73
10. RECOMENDACIONES ........................................................................................... 75
11.ANEXO 1 .................................................................................................................. 76
12. BIBLIOGRAFÍA ...................................................................................................... 78

LISTA DE FIGURAS

Figura 1. Ataque y penetración de B. cinerea en D. grandiflora ................................... 22

Figura 2. Desarrollo de las enfermedades producidas por el moho gris Botrytis . ......... 23
Figura 3. Aislados de Pseudomonas spp. fluorescentes ................................................. 37
Figura 4 Botrytis. cinerea .............................................................................................. 40
Figura 5. Esquema mostrando método para pruebas cualitativas. .................................. 41
Figura 6. Método del anillo ............................................................................................ 42
Figura 7. Esquema mostrando método para pruebas cuantitativas. ................................ 43
Figura 8. Invernadero para ensayos. . ............................................................................. 46
Figura 9. Panorámica general del montaje. ..................................................................... 47
Figura 10. Esquema del diseño experimental. ................................................................ 50
Figura 11. Fotografía de aspersión en Spray. ................................................................. 52
Figura 12. Obsérvese los 4 estadios de la flor. ............................................................... 54
Figura 13.Rhizobacterias. ............................................................................................... 57
Figura 14. Halo de inhibición ........................................................................................ 59
Figura 15. Grado de inhibición de B. cinérea generado por las 5 cepas bacterianas...... 61
Figura 16. Prueba cuantitativa BAFE FSB58. ................................................................ 62
Figura 17. Porcentaje de incidencia de . ......................................................................... 65
Figura 18. Porcentaje de severidad. ................................................................................ 66
Figura 19. Plantas afectadas por el patógeno. ................................................................. 67

LISTA DE TABLAS

Tabla 1.Correspondencia de los tratamientos ................................................................. 51

Tabla 2. Pruebas bioquímicas. ........................................................................................ 56
Tabla 3. Porcentaje de antagonismo de los aislados pertenecientes al grupo Pseudomonas
spp. .................................................................................................................................. 60
Tabla 4. Porcentaje de antagonismo de los aislados pertenecientes al grupo BAFE. ..... 60
Tabla 5. Resultados pruebas bioquímicas. ...................................................................... 72

9
 ITRODUCCIÓ

La producción y comercialización de flores ornamentales de excelente calidad ha sido uno

de los renglones de la economía en Colombia, año tras año ha ido creciendo debido a la

gran demanda nacional e internacional por lo cual se ha hecho necesaria la diversificación

de la producción con variedades como statice, gypsophila, aster y pompón (Díaz et al,

1996).

Actualmente Colombia es el primer proveedor de Estados Unidos con una participación del

60% del mercado total, y es el cuarto de la Unión Europea con un 4% sobre el volumen

total importado, lo cual lo sitúa como el segundo país productor mundial de flores después

de Holanda; la sabana de Bogotá con el 85% del área cultivada y Antioquia con el 12% son

las regiones más importantes. En Antioquia, la zona del Oriente se ha establecido como el

sector más fuerte en producción y comercialización donde uno de los principales productos

de las empresas floricultores es el crisantemo.

Con el fin de poder suplir la demanda del mercado, en los invernaderos del Oriente

Antioqueño se realizan prácticas de monocultivos extensivos con altas densidades de

siembra; esto genera un ambiente ideal para el establecimiento de enfermedades cuyos

agentes patógenos son hongos, bacterias, virus y nemátodos, algunos de los géneros de

hongos son, Phytium, Rhizoctonia, Fusarium, Stemphylium, Alternaria, Cercóspora,

Septoria, Esclerotinia, Verticillum y Botrytis (Pardo, 1995; Agrios, 2007; Barnett y Hunter,

2003) este último de gran importancia dentro de los floricultivos ya que es el que reporta

10
más pérdidas económicas en el crisantemo, al desarrollarse con mayor severidad en la

cadena de distribución internacional en las etapas de embalaje, transporte y

almacenamiento causando pecas o pudriciones básicamente en la flor, aunque también en

algunas variedades como la del estudio en cuestión en hojas y tallos.

B. cinerea también afecta cultivos de hortalizas y frutales como pepino, tomate (Dik y Elad,

2004), alfalfa (Gossen et al, 1996; Gossen et al, 1999), uva (Rojas, 1993) pera (Mari et al,

1996) y fresa (Peng y sutton, 1991) entre muchos otros; en flores generalmente se controla

con dosis altas y continuas de fungicidas desde la siembra hasta el corte, lo cual incrementa

los costos de producción, abre la posibilidad de que se generen cepas resistentes al control

químico y crea un desequilibrio ecológico al aumentar los niveles tóxicos en el ambiente y

eliminar los microorganismos benéficos del suelo y del agua (Segarra et al, 2007).

Sin embargo, actualmente se ha ido generando una tendencia hacia una producción agrícola

mas limpia con miras hacia una agricultura sostenible en el tiempo y un menor impacto

ambiental. Esto, sumado a la resistencia de la mayoría de los patógenos a los pesticidas de

síntesis química (CPP, por sus siglas en inglés: chemical pesticides products), ha obligado a

los investigadores y productores a desarrollar nuevas herramientas para el control integrado

de los mismos. Dentro de estos métodos, el control biológico con el uso de

microorganismos aparece como un posible sustituto a la aplicación de CPP.

En este contexto, la compañía Flores Silvestres S.A C.I. con tres fincas dedicadas a la

producción de flores de exportación ubicadas en los departamentos de Antioquia (2) y

11
Cundinamarca(1) con 50 hectáreas cultivadas, manifiesta la necesidad de empezar a

investigar sobre el control biológico con una bacteria endógena para el control de B.

cinerea en crisantemos (Dendranthema grandiflora), en la finca más grande ubicada en el

municipio del Carmen de Viboral con 38 hectáreas cultivadas y una producción de D.

grandiflora del 40% sobre el total de productos, con el fin de reemplazar la cepa comercial

utilizada para el control del hongo, la cual pertenece al género Burkolderia, bacterias

prohibidas en EEUU y la unión Europea por ser patógenas a humanos. En esta finca se han

empezado a utilizar métodos de control biológicos y ecológicos como Trichoderma

harzianum y Burkolderia cepacia genomóvar V, para el manejo de B. cinerea,

Paecylomyces linacinus y un extracto de Ricinus cuminis (higuerilla) para el control de

nemátodos, un extracto de swinglea glutinosa para controlar mildeos polvosos y extracto de

Allium sativum (ajo) y Capsicum sp. (ají) como repelente de insectos. Muchos de estos

productos son elaborados allí mismo y les ha permitido reemplazar algunos CPP.

Este trabajo obedece a la inquietud de la compañía y se basa en la selección de aislados

rizosféricos benéficos que tengan un potencial antagónico frente al hongo en estudio. A

nivel nacional, la investigación con estas nuevas tecnologías está en sus primeras etapas de

desarrollo, por esta razón es importante generar nuevos registros de los microorganismos

disponibles para el control de enfermedades, con el fin de poder aprovechar todo su

potencial como bio-controladores.

12
 1. ESTADO DEL ARTE

1.1 Generalidades del crisantemo

Los crisantemos son originarios de Asia oriental y fue allí en donde se iniciaron como

flores ornamentales, hoy en día son las más cultivadas de todo el mundo. Según los

registros históricos es producto de muchas hibridaciones entre diferentes especies del

género; la producción es importante en países como Holanda, Gran Bretaña, Francia,

Estados Unidos, Colombia y Canadá donde hace mucho tiempo es un cultivo

industrializado, esto ha permitido muchos estudios sobre mejora genética que han dado

lugar a numerosas variedades con formas y colores; después de la rosa, es la flor cortada

más vendida en las subastas holandesas, donde el blanco es el color más apetecido con una

participación en el mercado del 40%, ocupa el primer puesto gracias a la facilidad que

posee para los procesos de tinción. En segundo lugar están los crisantemos amarillos con

un 31% y en tercero los violetas con un 11% (Postharvest, 2004).

El género Chrysanthemum pertenece a la familia Asteraceae, el cual incluía muchas

especies, pero hace varias décadas dichas especies se dividieron en varios géneros,

Glebionis, Argyranthemum, Leucanthemopsis, Leucanthemum, Rhodanthemum, y

Tanacetum; la denominación fue polémica pero según una norma del Código Internacional

de Nomenclatura Botánica (ICBN ) en 1999 se decidió cambiar el nombre, restableciendo

de este modo la importancia florística del crisantemo, antes del arbitraje del ICBN, todas

tratadas bajo el nombre genérico de Dendranthema (Saint Lois code, 2001).

13
1.2 Descripción del Chrysanthemum

Hojas lobuladas o dentadas, ligulosas o rugosas, de color variable entre el verde claro y

oscuro, casi siempre aromáticas, recubiertas de un polvillo blanquecino que le da un

aspecto grisáceo. Lo que se conoce como flor es realmente una inflorescencia en capítulo.

Existen diversos tipos de capítulo cultivados comercialmente, aunque, en general, esta

inflorescencia está formada por dos tipos de flores: femeninas (radiales; se corresponden

con la hilera exterior en las margaritas) y hermafroditas (concéntricas; se corresponden con

las centrales). El receptáculo es plano o convexo y está rodeado de una envoltura de

brácteas. (Postharvest, 2004.).

1.3 Características generales de Dendranthema grandiflora Tevelev = Chrysanthemum

morifolium)

Plantas perennes, hasta de 1.5 m de alto, aromáticas; tallos erectos o patentes, frondosos.

Hojas alternas, lobadas, lanceoladas a ovadas, entre 4 a 12 cm de largo y 4 a 6 cm de ancho,

segmentos enteros a gruesamente dentados, haz glabra, envés piloso con tricomas 2-

armados, glanduloso; pecíolos hasta 4 cm de largo, con 2 segmentos auriculados en la base.

Capitulescencias de corimbos laxos, pedúnculos bracteados; capítulos radiados; involucros

hemisféricos; filarias herbáceas, las exteriores lanceoladas a oblongas, 4 a 8 mm de largo y

1 a 2 mm de ancho, las internas ovadas, 8 a 10 mm de largo y 2 a 3 mm de ancho, márgenes

ampliamente escariosos; receptáculos fuertemente convexos, epaleáceos; flósculos del

radio numerosos (100 a 200), en series múltiples, pistilados, las lígulas 1 a 8 cm de largo,

variadamente coloreadas (comúnmente purpúreas o amarillas); flósculos del disco 100 a

14
200, perfectos, las corolas tubulares, 5-lobadas, amarillas; base de las anteras obtusa, los

apéndices terminales lanceolados; ramas del estilo oblongas, truncadas, peniciladas.

Aquenios cilíndricos a obcónicos, 1 a 1.5 mm de largo, 5 a 8-acostillados; vilano ausente

(Stevens, 2001).

1.4 Generalidades del control biológico

El control biológico es, “la acción de parásitos, depredadores o patógenos que mantienen

poblaciones de otros organismos a un nivel más bajo de lo que pudiera ocurrir en su

ausencia y se establece en un cultivo determinado ya sea por vía natural o artificial”

(Rodríguez y Arredondo, 2007).

Su historia se remonta a china, 200 años A.C. cuando los agricultores usaban tallos de

bambú para comunicar los árboles y permitir que las hormigas circulasen de un árbol a otro

comiendo insectos plaga, en tiempos más modernos se puede considerar con el éxito de la

catarinita, Rodolia cardinales para el control de la escama Icerya purchasi Maskell en

California (Rodríguez y Arredondo, 2007).

La premisa del control biológico descansa entonces en un principio muy básico: Cadena y

niveles tróficos, teniendo en cuenta para el caso específico de la agricultura las

interacciones entre las especies que allí se establezcan, así: planta-fitófago, fitófago-

predador, fitófago- parásito, fitófago-patógeno, fitófago-enemigo de una especie vegetal

asociada al cultivo que no soporte este, y, fitófago-enemigo en una especie vegetal puede

15
ser afectado por la presencia de otros fitófagos presentes en las plantas asociadas (Altieri y

Nicholls, 1994).

Los monocultivos tienen el grave problema de que las relaciones solo se establecen entre la

planta cultivada y el fitófago, y al momento de aplicar la premisa del control biológico, no

se da de manera natural, sino que tiene que ser artificial y se tiene que ser muy hábil

conociendo muy bien la zona, la ecología y la biología de los organismos que se quieran

introducir, pues dado el tiempo que tenga el cultivo y las aplicaciones que haya recibido, ya

sea de fertilizantes o de pesticidas, casi se puede asegurar que allí solo se encontrarán

microorganismos y algunas especies de artrópodos con muy pocos individuos.

En estos casos, es necesario empezar a introducir especies foráneas a la zona, con unas

propiedades excepcionales, que se adapten a este tipo de hábitats, que sean efectivas y que

no se conviertan en plaga ni en enfermedad en ningún momento ni en todo de su ciclo de

vida.

Sin embargo, cada región tiene un conjunto único de agro-ecosistemas que derivan del

clima local, de la topografía, del suelo, de las relaciones económicas, de la estructura social

y de la historia, es por ello que al momento de introducirse una especie a un cultivo para el

manejo de una enfermedad es importante, primero, saber que especies estuvieron antes allí

que puedan tener el mismo fin, pues cuando se adiciona un enemigo natural al campo

donde este no ocurrió, se está haciendo un incremento al control biológico natural,

mientras que cuando se adiciona un organismo a un campo donde este ocurrió u ocurrió en

16
campos cercanos, se está haciendo una conservación del control biológico natural (Altieri y

Nicholls, 1994), lo cual es mucho más promisorio para restaurar ciclos biológicos y tener

menos implicaciones en el tiempo.

En la actualidad, en el sector agrícola se están implementando nuevos métodos de control

biológico de plagas y enfermedades, de manera articulada con las estrategias culturales y

químicas para incrementar la eficiencia productiva en las cosechas. Estos métodos deben

cumplir niveles de calidad biológica y de respeto al medio ambiente, durabilidad,

efectividad a bajas concentraciones, baja toxicidad, no patogenicidad contra la planta

hospedera y compatibilidad con otros tratamientos (Stone et al, 2004).

Un método de control biológico actual y contundente, que ya está siendo implementado en

varias partes del mundo, es el uso de insectos predatores y de biopesticidas o

bioformulados, estos pueden ser organismos vivos como bacterias, hongos, o asociaciones

entre estos, o estructuras como esporas y virus, los cuales se utilizan para el control de

algunas plagas y enfermedades de tipo fungosas, bacterianas y nematológicas.

Actualmente en el mercado, se encuentra un buen grupo de bioformulados que se basan en

organismos tanto fúngicos, como bacterianos o virales. Ejemplos de ellos son los Bacillus

thuringiensis con actividad tóxica hacia diversas plagas como lepidópteros, dípteros,

coleópteros, nemátodos, y ácaros (Liebman, 1997) otro organismo usado como

bioformulado es el hongo del género Trichoderma, dentro de las distintas especies están: T.

17
viridae, T. harzianum, T. hamatum, T. konningi, estos dos últimos son los más efectivos,

incluso bajo condiciones extremas como las estaciones frías (González, 1989).

Los casos más exitosos de todo el mundo de control biológico se reportan para los

policultivos, lo cual es de esperarse pues los sistemas diversificados favorecen las cadenas

tróficas que suponen más conexiones e interacciones potenciales entre sus miembros, así

como muchas vías alternativas de flujo y materia (Altieri y Nicholls, 1994).

1.5 Etiología de B. cinerea

Botrytris cinerea pers, Pertenece a la fase conidial, cuya fase perfecta corresponde al

endoparásito Botryotinia fuckeliana (de Bary). Reino Fungi, Filo Ascomycota, Subfilo

Pezizomycotina, Clase Leotiomycetes, orden Helotiales, Familia Sclerotinicaeae, Género:

Botryotinia, Especie: B. fuckeliana (Castañeda, 2004).

1.6 Morfología y ciclo de vida de B. cinerea

Colonias ampliamente expandidas, aproximadamente 6 cm de diámetro o más a los 10 días

de crecimiento sobre OA a 20 0C, con aspecto hialino al principio pero más adelante se

tornan grises o café grisáceas, aspecto pulvurento y con textura compacta de hasta 2 mm de

altura. Micelio septado, conidióforos aristados irregularmente, erectos, de 750 µm a 2 mm

de largo, marrón, con varias cabezas en el ápice sobre ramas alternadas, conidias ovoides a

elípticas con base ligeramente puntiaguda, hidrofóbicas, pared lisa, 8-14 x 6-9 µm de

longitud, son liberadas por movimientos higroscópicos de las células conidiogénicas,

18
micro-conidias globosas, 2.5-3.0 µm de diámetro, esclerocios de tamaños irregulares,

pueden presentar hasta 15 mm de diámetro, negros. Las hifas y las conidias son

multinucleadas mientras que las micro-conidias son uninucleadas, la especie es heterotálica

y presenta compatibilidad bipolar. Posee enzimas como endopoligalactorunasas, cutinasas,

citasas, oxidasas, diastasas, 1-3 glucanasas, botridial y dihidrobotridial que ayudan a la

infección en la planta (Williamson et al, 1994; Domsch y Gams, 1993).

La forma en que se puede encontrar en la naturaleza es: 1. En forma de esclerocios, los

cuales son órganos de resistencia, que primero son blancos y luego se tornan negros y

duros, constituyen una forma de conservación frecuente al final de la estación fría por ser

estructuras de resistencia. Al realizar un corte de su masa miceliar, se observa una corteza

constituida de células muertas y una médula formada por hifas enmarañadas. (Pérez,

1985). La temperatura óptima para la formación de los esclerocios es entre 11-13 0C, el pH

óptimo es de 4 (Domsch y Gams, 1993). 2. En forma estéril el cual constituye un micelio

fieltro grisáceo o amarronado en la superficie de los órganos. El crecimiento del micelio

es rápido entre los 15 0C y 25 0C (Domsch y Gams, 1993) y es muy lento cuando la

temperatura es cercana a 10-11 0C. El micelio necesita oxígeno para su crecimiento y su

maduración puede ser favorecida a pH bajos entre 2-5 (Kirk et al, 2001). 3. En forma

cotidiana, son estructuras reproductivas unicelulares, ovoides y grises que en conjunto se

asemejan a unos racimos. La producción de conidias es particularmente variable, y puede

ser estimulada por NH4NO3, asparagina y luz cercana al rango de UV, la sorbosa, la glicina

y la úrea son inhibitorios para este. La temperatura mínima para la esporulación es de 120C

en el campo, siendo la óptima de 150C (Kirk et al, 2001). La diseminación de las conidias

19
se realiza especialmente por el viento y es favorecida por la lluvia. Las conidias son

susceptibles de conservarse durante un mes luego de su aparición, siendo activadas en su

germinación por el contacto con sustancias como carbohidratos y fosfatos que llevan las

aguas lluvias (Holguín, 1999).

B. cinerea tiene una amplia distribución pero ocurre principalmente en regiones

subtropicales y en climas templados – húmedos, es común en el filoplano de plantas y en el

suelo en forma de esclerocios, tiene fácil dispersión ya sea por corrientes de viento, lluvia,

transporte de material contaminado o flujo de personas (Domsch y Gams, 1993).

1.7 Mecanismos de acción de B. cinerea en la flor

En condiciones silvestres la penetración del hongo se deben a algún golpe, una granizada,

ataques de insectos e influyen también las lluvias abundantes luego de un período de sequía

riguroso (Agrios, 2007). En flores Silvestres S.A. C.I., su ataque es frecuente observarlo

cuando se empieza a formar el botón floral, en precorte, y en florero. (Contacto directo:

Juan Gabriel Montoya, jefe de producción de la variedad en estudio: Flores Silvestres).

El hongo se establece en los pétalos de la flor, los cuales son particularmente susceptibles

cuando comienzan a envejecer y ahí produce micelio abundante. Cuando el clima es

húmedo y fresco, el micelio del hongo produce numerosos conidios que ocasionan más

infecciones, pero el micelio también se desarrolla, penetra e invade el resto de la

inflorescencia lo cual se llena y cubre con un moho intrincado de color gris blanquecino o

café claro. El hongo avanza hacia el pedicelo, el cual se pudre y permite que las flores y

20
yemas cuelguen (figura 1). En la medida en que se pudren los tejidos, la epidermis se

rompe y se producen esclerocios aplanados de color negro sobre la superficie o hundidos en

el tejido. Otro síntoma que se observa son las manchas en las hojas y en la flor, dichas

manchas son pequeñas y amarillentas al principio, pero posteriormente se extienden,

adquieren un color canela o gris blanquecino, se hunden, coalescen y a menudo cubren toda

la hoja.

Por lo general las lesiones del tallo aparecen en tallos suculentos y pueden ser lesiones

hundidas, alargadas y de color oscuro con un contorno bien definido, o bien pueden

extenderse sobre el tallo y hacer que éste se debilite y quiebre a nivel de la zona de

infección como ocurre en el rosal, tulipán y otras plantas (ver figura 1, y 2).

El ahogamiento de las plántulas producido por B. cinerea ocurre principalmente en lugares

fríos donde la humedad es alta, pero aparece también en el campo cuando las semillas o los

esquejes son contaminadas por los esclerocios del hongo (Agrios, 2007).

Los mecanismos de penetración en la flor se dan de tres maneras, primero y sobre todo a

nivel de heridas, luego por elementos germinativos surgidos a través de una espora, los

cuales pueden penetrar por el ostiolo de un estoma o atravesar la cutícula cuando es

delgada, y por último por contacto de plantas sanas con material infectado. El poder

contaminante de los micelios será mayor que el de las esporas pues la cutícula es

atravesada más fácilmente, la posibilidad de la penetración es facilitada por medio de

enzimas que secreta el hongo (Leroux y Moncomble, 1993; Blackman y Wilford, 1916 En:

Holguín, 1999; Salinas y Verhoeff, 1995).

21
Figura 1. Ataque y penetración de B. cinerea en D. grandiflora var: D. yellow, nótese como
empieza la sintomatología en los sépalos hasta que se produce la muerte de la planta.
Fotografía in situ.

Enzimas que intervienen en la penetración del hongo

El hongo patógeno tiene una maquinaria enzimática que le ayuda a la penetración en la

planta, las enzimas más importantes son (González, 1989; Williamson et al, 1994, Agrios

2007):

• Endopoligalactorunasas: Involucradas en la penetración de las hifas a los tejidos

parenquimáticos.

22
 • 1,3 glucanasas y cutinasas: Ayudan a la penetración del hongo y causan

infección.

• Citasa: Degrada la celulosa.

• Oxidasa: Produce el amarronamiento de la parte afectada.

• Diastasa: Ayuda con la fermentación de sustancias producidas por la planta.

• Botridial y dihidrobotridial: Responsables de las manchas necróticas de la

enfermedad y produce efecto sinérgico en la necrosis de las hojas.

Figura 2. Desarrollo de las enfermedades producidas por el moho gris Botrytis (Agrios
2007).

A pesar de las temperaturas óptimas descritas en párrafos anteriores, un estudio J. Salinas y

K. Verhoeff (1995), sobre la acción microscópica de Botrytis sp. sobre Gérbera encontraron

que a los 40 C y 18 días después de inoculado el patógeno, también se da infección y se

observa un tejido necrótico constituido entre 40 y 50 células, siendo las flores portadoras de

23
la enfermedad, pero sin ninguna sintomatología visible. En este mismo estudio, se

encontró que la germinación de la conidia después de la inoculación en la flor, depende en

gran medida de la cantidad de agua disponible, y no de la adición de nutrientes externos

favorables para el hongo fitopatógeno.

Las necesidades metabólicas del hongo se basan en: Glúcidos (glucosa, fructosa, manosa);

ácidos orgánicos como ácido málico y ácido tartárico; alcoholes superiores como glicerol y

manitol, y prótidos que constituyen una fuente de nitrógenos, nitratos y sales de amonio

(Rojas, 1993). Los factores externos tienen una influencia determinante en el desarrollo del

hongo. La humedad relativa superior al 65% es necesaria para que se produzca la

germinación de las conidias, así como temperaturas entre 15 y 25 0 C. (Hidalgo, 1978)

En general las plantas que están sujetas a situaciones de estrés como cantidades de agua

muy altas o muy bajas, temperatura excesivamente alta o baja, oscuridad prolongada o

deficiencia mineral tienen poca resistencia a microorganismos y comúnmente sucumben

ante este patógeno (Baker et al, 1982).

1.8 Control biológico de B. cinerea con Bacillus spp. y Pseudomonas spp.

El biocontrol mediante el uso de bacterias es considerado actualmente como una opción

para reducir el ataque de hongos que afectan a numerosos cultivos en programas de

agricultura orgánica y sostenible. Hay muchos estudios sobre Pseudomonas spp.

fluorescentes y Bacillus spp. como posibles biocontroladores de especies fitopatógenas,

24
esto puede deberse a que son los habitantes más comunes de la rizosfera y de la filosfera, se

aíslan fácilmente de ambientes naturales, utilizan una amplia gama de sustratos, son fáciles

de cultivar y manipular genéticamente (Raaijmakers et al, 2002), pueden competir por

espacio y nutrientes con otros microorganismos del suelo, se pueden caracterizar

taxonómicamente sin dificultad y son capaces de producir antibióticos y sideróforos como

toxinas fúngicas (Yánez, 2003).

1.8.1 Bacillus spp.

Pertenecen al orden Bacillales, familia Bacillaceae, género Bacillus, Son de distribución

cosmopolita y presentan células vegetativas en forma de bastones, tienen diferentes formas

de agrupación dependiendo de la especie, son Gram positivos, presentan flagelos peritricos,

pueden producir pigmentos en algunos medios y exhiben grandes habilidades fisiológicas,

ácidofílicas o alcalofílicas, termofílicas o sicrófilas, halófilas o crecen en medios con sales

específicas, aerobias estrictos o anaerobias facultativos y esporógenas deformantes o no

deformantes con una espora por célula; la mayoría de especies son catalasa positiva,

oxidasa positiva o negativa (Sneath et al, 1986), durante su cultivo y asociadas a la

formación de estas, se pueden formar cuerpos paraesporales con actividad plaguicida, su

temperatura óptima de crecimiento es entre los 20-25 0C (Ramírez, 2005)1. Para la

clasificación de las especies de este género se han usado varios métodos, los primeros se

basan en caracterización morfológica y bioquímica utilizando técnicas convencionales, pero

se han venido desarrollando técnicas más complejas y precisas basadas en la secuenciación

1
Ver mayor información sobre la clasificación en metodología, numeral 6.4.

25
de DNA utilizando genética molecular, análisis de ácidos grasos, estudios serológicos y

electroforéticos.

Su reporte como antagonista sobre hongos fitopatógenos está fuertemente sustentado por

numerosos estudios, se ha demostrado que esta acción inhibidora se debe a que la actividad

antagónica contra bacterias y hongos fitopatógenos por cepas del género Bacillus está

relacionada con la producción de antibióticos (Lagunas-Lagunas et al, 2001; Luna et al,

2001; Utiamada et al, 1999) como subtilina, bacilopeptina, bacilomicina, bacilisina,

botricidina, fengicina, micosubtilina y rhizocticina (Hernández et al, 2006); competencia

por sitios nutricionalmente activos como lo sugieren Mari et al, (1996), en un bioensayo

para evaluar el potencial antagónico de B. pumilos y B. amyloliquefaciens sobre el moho

gris de la pera causado por B. cinerea; estructuras con actividad tóxica como es el caso de

los cristales paraesporales de Bacillus thuringiensis para el control de insectos (Rosas,

2008; Fillinger, 2003; Singh, 2007) y degradación de quitina (Okumoto et al, 2001).

Diversos autores han encontrado una mayor emergencia de plántulas de trigo y reducción

de hongos fitopatógenos al utilizar B. subtilis (Korsten et al, 1997) Este bacteria también

mostró inhibir el crecimiento de hongos del suelo como F. oxysporum, Pythium ultimum,

Rhizoctonia solani, Sclerotium rolfsii, P. nicotianae, F. moniliforme y F. solani, y permitió

el control de Alternaria porri en plantas de cebolla especialmente cuando se alternó con

aplicaciones de los funguicidas zineb y oxicloruro de cobre (Chen et al, 2004), en

investigaciones a nivel agrícola se ha demostrado que esta misma bacteria es especialmente

activa en la descomposición y mineralización de sustancias orgánicas, colonización de

raíces y producción de antibióticos como la fengicina, surfatina e iturín (Yánez, 2003).

26
También se ha consignado el efecto benéfico in vitro de Bacillus sp. sobre la germinación y

el desarrollo de semillas de tomate (Jongebloed et al, 1993) infectadas con Fusarium

oxysporium var. Cubensis y de Bacillus sp. aislado de trigo (Korsten et al, 1997).

1.8.2 Pseudomonas spp.

Pertenecen al orden Pseudomonadales, familia Pseudomonadaceae, género Pseudomonas

(Brenner et al, 2005), son de distribución cosmopolita, aunque son predominantes en

ambientes de la rizosfera y la filosfera de plantas, muchas ejerciendo efectos positivos

sobre estas, los cuales radican en la producción y segregación de reguladores del

crecimiento de plantas como auxinas, giberelinas y citoquininas, mejorando procesos como

germinación de semillas, nutrición mineral, desarrollo de raíces, empleo del agua entre

otros (Pan et al, 1999 en: Santillana, 2006). Presentan células vegetativas en forma de

bacilos rectos o ligeramente curvados, tienen diferentes formas de agrupación dependiendo

de la especie, son Gram negativos, aerobios estrictos, no esporógenos, su movilidad es

variable, por lo general positiva y raras veces inmóviles, cuando es positiva presenta

flagelos polares aunque algunas especies los poseen laterales, su temperatura óptima de

crecimiento es de 20-250C (Brenner et al, 2005).

Este género de bacterias ejercen su capacidad antagónica de diversas maneras, Okumoto et

al, (2001) encontraron cepas de Pseudomonas spp. fluorescentes degradadoras de quitina

para el control in vitro de Alternaria solani, esto debido a que la pared celular de los

hongos está constituida básicamente de quitina y manoproteínas como el glucógeno, la

27
glucana, entre otras (Sánchez et al, rev: 2007; Wietze et al, 1998), en un estudio realizado

sobre la podredumbre radicular del aguacate, encontraron a Pseudomonas fluorescens cepa

PCL 1606 efectiva para el biocontrol de Dematophora necatrix agente causal de la

enfermedad, por medio de sustancias antifúngicas que podrían ser de naturaleza antibiótica

(Doñal et al, 2003), este último mecanismo ampliamente reportado, pioluterina, ácido

cianhídrico y DAP son expuestos como antibióticos que actúan en el proceso de supresión

de enfermedades por parte de este grupo de bacterias (Van et al, 1998), otra característica

que les permite a las Pseudomonas spp. fluorescentes inhibir a los fitopatógenos, es la alta

producción de sideróforos, compuestos quemantes que secuestran el hierro, privando al

patógeno de este, que es esencial en sus actividades deletéreas de la rizosfera, producción

de enzimas hidrolíticas y competencia por sitios nutricionalmente favorables o ricos en

nutrientes (Kloepper et al. 1980; Pérez et al, 2000; Perotti et al, 2005; Lin y Crowley, 2001)

1.9 Manejo de B.cinerea en invernadero

El moho gris, la peca de la flor y la pudrición de tallos y estructuras de la planta, causado

por B.cinerea, es una de las mayores patologías que afectan a los cultivos en invernadero,

debido a la gran importancia económica que estos tienen a nivel mundial, se han realizado

numerosas investigaciones acerca de cómo manejar este patógeno. Inicialmente los

métodos que mayor éxito reportaron, fueron aquellos que utilizaban fungicidas sistémicos

de síntesis química; sin embargo pronto perdieron su efectividad debido a la acción

selectiva que dichos fungicidas tienen sobre los patógenos. Los investigadores propusieron

crear fungicidas más fuertes, pero rápidamente se dieron cuenta que esta alternativa no es

28
muy viable puesto que ocurriría el mismo efecto de selección de resistentes y cada vez se

vería la obligación de crear más potentes y nuevos productos, además de los impactos

ambientales y en la salud de las personas que entran en contacto directo o indirecto con

estos productos.

Es por esta razón que en las últimas décadas se ha dado un viraje en el enfoque de manejar

estas patologías. El manejo integrado ha demostrado ser una alternativa interesante. Este

método de manejo de enfermedades y plagas, combina prácticas culturales, métodos

biológicos y herramientas químicas. Estudios han demostrado (Elad et al, 1995), que la

combinación de fungicidas con agentes de control biológico producen buenos resultados en

el control del moho gris, además de reducir a la mitad la descarga de fungicidas en el

medio.

29
 2. FORMULACIÓ DEL PROBLEMA

Actualmente la empresa Flores Silvestres S.A. C.I. en el oriente Antioqueño, dedicada en

un 40% de su total de especies cultivadas a la producción de crisantemo D. grandiflora,

manifiesta una necesidad por bio-controlar la enfermedad causada por B. cinerea en la

variedad Delistar yellow de esta especie, la cual es altamente dependiente de tratamientos

químicos.

Hasta el momento, los resultados más alentadores para el control del hongo son dados por

procesos químicos utilizando aplicaciones con una gran variedad de productos entre los

cuales cabe mencionar, debido a su uso más frecuente: Fosetyl Al, azoxystrobin, propineb,

iminoctadine, iprodione, cabendazim, boscalid, clorotalonil, mancozeb, phlocloraz,

pyremethanil, procymidone, fenhexamyd + tebuconazole, ciprodinil+fludioxonil, con tres

aplicaciones semanales después del desbotone hasta el corte para un total de seis

aplicaciones en promedio para dicha enfermedad, con un costo de 7`500.000 pesos

mensuales.

Flores Silvestres viene desarrollando, a través de la creación del Departamento de

Biorregulación, nuevas alternativas para el manejo de las enfermedades y plagas,

apoyándose en la investigación con el uso de bacterias, hongos, extractos de plantas,

sustratos orgánicos, insectos benéficos y biofertilizantes, dentro de programas de manejo

integrado de plagas y enfermedades (MIPE). Este manejo disminuye el impacto ambiental

30
del monocultivo de D. grandiflora var. Delistar yellow, e incrementa las posibilidades de

acceder a mercados orgánicos o amigables con el medio ambiente.

Debido a lo anterior, en la empresa Flores Silvestres S.A. se hace necesaria la búsqueda y

realización de pruebas de patogenicidad con microorganismos capaces de bioregular a B.

cinérea, con el fin de disminuir la utilización de fungicidas para su control, lo cual

permitirá en un futuro implementar el uso de las bacterias trabajadas en el presente trabajo,

dentro del manejo integrado del Moho gris en crisantemo.

31
 3. HIPÓTESIS DEL TRABAJO

Aislados rizosféricos de Pseudomonas spp. fluorescentes. y Bacillus spp. presentan

antagonismo contra B. cinerea, que se manifiesta por una disminución de la incidencia

y la severidad de la enfermedad.

4. OBJETIVOS

4.1 Objetivo General

Realizar pruebas de antagonismo in vitro e in vivo con Pseudomonas spp. y Bacillus spp.

sobre Botrytis cinerea pers. aislados de suelo y material vegetal del Cultivo Flores

Silvestres S.A. C.I.

4.2 Objetivos específicos:

1. Obtener una colección de rizobacterias pertenecientes a los géneros Pseudomonas

spp. y Bacillus spp. , asociadas a áreas poco intervenidas que manifiesten buenas
condiciones sanitarias y de producción.

2. Determinar in vitro mediante pruebas de antagonismo, los aislados con mayor

potencial antagónico.

3. Evaluar las cepas caracterizadas con mayor potencial antagónico, en invernadero.

4. Identificar presuntivamente la especie de la(s) cepa(s) con mayor potencial

antagónico en campo mediante pruebas bioquímicas.

32
 5. JUSTIFICACIÓ

En Colombia hay 6953 hectáreas de tierra dedicadas a la floricultura, ubicando al país en el

segundo puesto de exportación de flores a nivel mundial, siendo los departamentos de

Cundinamarca y Antioquia los principales productores, con una participación del 75% y

20% respectivamente. El crisantemo es el tercer producto en orden de importancia de

flores cultivadas a nivel nacional (www.asocolflores.org, consultada en Octubre de 2007).

En Flores Silvestres S.A específicamente, el crisantemo representa el 40% del total de su

producción. De este porcentaje el 7.5% corresponde a la variedad delistar yellow y de este

7.5% el 1.5% es afectado por B. cienerea.

Aunque el porcentaje de crisantemos de la variedad delistar yellow que es afectado por el

hongo es aparentemente bajo (7.5% del 1.5), hay que tener en cuenta los métodos de

control aduaneros que establecen la fumigación de un lote entero de cajas de flores si en

este lote hay una sola flor afectada, por ello es necesario encontrar e implementar medidas

de control con el fin de reducir la incidencia de este fitopatógeno.

La compañía tiene 21 años en el mercado internacional, lo que la hace una empresa de

prestigio al sacar productos que se pueden comercializar en casi todo el mundo, Canadá,

Alemania, Japón, Inglaterra, Puerto Rico, Holanda, Rusia y E.U, este último el principal

comprador de todas las especies y variedades, vale la pena que una empresa de renombre

se mantenga en el mercado con productos número uno en ventas de exportación.

33
Un control biológico que se estaba utilizando en el cultivo para este hongo fitopatógeno era

la bacteria Burkholderia cepacia; si bien es cierto que esta bacteria puede antagonizar y

reprimir muchos patógenos de plantas por acción de antibiosis, como hongos pertenecientes

a los géneros Fusarium, Pythium, Rhizoctonia, Cilindrocarpum y Botrytis, se debe

considerar que antes del empleo de estas cepas bacterianas habría que considerar sus

efectos sobre la salud humana, ya que B. cepacia está asociada con un incremento en la

enfermedad y muerte de pacientes con fibrosis cística . Esta observación hace que la

dispersión deliberada de la misma en el ambiente se considere con cuidado. Parece evidente

que la aplicación agrícola de B. cepacia ocasionaría una contaminación de tierras y aguas

incrementándose la exposición a los humanos (Alemán et al, 2003).

Por ello ante las limitaciones en el manejo de la enfermedad surge la necesidad de plantear

alternativas sustitutas o complementarias a las existentes, como el control biológico seguro,

importante para la recuperación del equilibrio de los agro ecosistemas y para el

aprovechamiento del potencial antagonista natural de ciertos microorganismos (Avendaño

et al, 2006).

El estudio de la acción de las poblaciones bacterianas como Pseudomonas spp. Y Bacillus

spp. sobre las pudriciones en la filosfera de crisantemo ocasionada por B. cinerea en el

oriente Antioqueño permitirá establecer si existe alguna relación antagonista entre ellos y

que resultados se encuentran en el desarrollo de la planta. Al mismo tiempo, es importante

comenzar a generar información acerca de los posibles biocontroladores de este hongo que

ocasiona tantos problemas, no solo en la floricultura sino en cultivos de gran diversidad de

34
productos, así como la construcción de ceparios con este tipo de aislados, todo esto en aras

de abrir camino para la selección de poblaciones bacterianas deseables (PGPRs) para una

máxima productividad y calidad.

Por medio del Laboratorio de control microbiológico (LCMB) de la Universidad de

Antioquia, se logró hacer un estudio a cerca de las cepas endógenas de Pseudomonas spp y

Bacillus spp. de la finca-Flores Silvestres el Carmen a fin de seleccionar una de ellas que

mostrara efectividad para el control del moho gris. Este trabajo logró desarrollar pruebas de

antagonismo en planta, así como una aproximación a la clasificación de este

microorganismo, utilizando algunas pruebas bioquímicas.

35
 6. METODOLOGÍA

6.1 Objetivo 1: Obtener una colección de rizobacterias pertenecientes a los géneros

Pseudomonas y Bacillus.

6.1.1 Recolección de material para aislamiento de bacteria.

El estudio se llevó a cabo en el cultivo de flores ornamentales de exportación del Carmen

de Viboral (Antioquia-Colombia) Flores Silvestres S.A. C.I. a 2.124 msnm, con

coordenadas 605´63´´N y 75020´53´´W, se seleccionaron tres zonas diferentes de muestreo

en donde no se han realizado actividades productivas en los últimos 20 años, de cada sitio

de muestreo se sacaron 20 muestras de suelo rizosférico, entre 15 y 20 cm de profundidad y

cada una de ellas conformada a su vez por tres sub-muestras de diferentes puntos de las

plantas asociadas. El total de muestreos fueron 6 los cuales se realizaron entre los meses de

noviembre de 2007 y marzo de 2008. Las muestras fueron almacenadas en bolsas plásticas

y transportadas al laboratorio de Control Microbiológico (LCMB) de la Universidad de

Antioquia en Medellín. Los instrumentos (machete, pala, barra) utilizados para la toma de

las muestras fueron limpiados con alcohol al 96% entre una y otra. (Ramírez, 2005)

6.1.2 Aislamiento y almacenamiento de rizobacterias.

Una vez en el laboratorio, se pesaron 100 g de cada muestra y se almacenaron en bolsas

ziploc® con el fin de tener material de respaldo. De estos 100 se pesaron 10 g, se diluyeron

en 100 ml de agua destilada estéril (ADE) y se agitaron manualmente durante 20 minutos,

36
conformando esta la dilución 10-1. A partir de esta se realizaron diluciones seriadas desde

10-2 hasta 10-4 en tubos Falcon® de 50 ml. Para aislar bacterias del género Pseudomonas, se

sembraron 100 µL de las diluciones 10-3 y 10-4 en medio B de King 50% + antibióticos

(ampicilina 50mg/l, benlatex 100mg/l, cloranfenicol 125mg/l) (Ramírez, 2005).

En este medio el pigmento producido por las cepas de la especie Pseudomonas spp.,

fluorescentes se ve con la ayuda de luz UV. De esta manera las colonias que presentaban

presencia del pigmento fueron seleccionadas y repicadas en cajas de Petri individuales en el

mismo medio para su posterior almacenamiento (Figura 3).

Figura 3. Aislados de Pseudomonas spp. fluorescentes sembrados

en medio B de King. Se observa la diferencia en el color del
pigmento producido. (a) pigmento amarillo. (b) pigmento azul.
Fotografía in situ.

Para las bacterias aerobias formadoras de espora BAFE (integrantes del género Bacillus),

tubos Falcon® conteniendo las diluciones 10-4 y 10-5 se sometieron a un choque térmico en

baño maría a una temperatura de 80ºC durante 15 minutos. Luego se sembraron 100 µL de

estas soluciones en cajas de Petri con TSA al 50%. Al realizar la siembra a temperatura

ambiente y en condiciones aeróbicas se evita la presencia de bacterias termófilas y del

37
género Clostridium, grupos que también soportan altas temperaturas. Las colonias

individuales se trasladaron a cajas de Petri con TSA al 50% con el fin de obtener una cepa

pura, para luego proceder con su almacenamiento (Ramírez, 2005).

Tanto de BAFE como de Pseudomonas spp. fluorescentes, se seleccionaron arbitrariamente

morfotipos distintos (características y aspecto de las colonias). En cada muestro, se

eligieron de 20 a 25 colonias para obtener una colección de aproximadamente 110 cepas de

cada grupo, a cada una de ellas se le hizo tinción de Gram, se observó al microscopio y se

le hizo prueba de KOH con el fin de garantizar la pureza del aislado. (Suslow y Schroth,

1982).

El almacenamiento, tanto de Pseudomonas como de BAFE, se realizó en caldo tripticasa de

soya (TSB) + 20% de glicerol al 87 %. El procedimiento consistió, en transferir una colonia

individual de cada aislado a un tubo Falcon® de 50 ml conteniendo 10 ml de TSB y

sometiéndolo a agitación (100 rpm) constante durante 48 horas a temperatura ambiente.

Pasadas las 48 horas los tubos fueron centrifugados a 3.250 rpm por un lapso de 15

minutos, se descartó el sobrenadante y el pellet se resuspendió en 3 ml de TSB + 20% de

glicerol previamente esterilizado. Esta resuspención fue sometida a agitación por Vortex®

y transferida a crioviales con tapa rosca con capacidad de 1,5 ml. De esta manera se

obtuvieron tres copias de cada cepa que fueron almacenadas a una temperatura de -70 ºC (

Forma Biofrezzer®) . (Bashan et al., 1993)

38
6.2 Objetivo 2: Pruebas de antagonismo in vitro

6.2.1 Recolección de material para aislamiento de B. cinerea

Las pruebas de antagonismo in vitro, se realizaron con cepas del patógeno aisladas de la

variedad en estudio, de camas de producción infectadas. El material vegetal contaminado

con B. cinérea se colectó y se trasladó en papel periódico humedecido al LCMB de la

Universidad de Antioquia en donde se procesaron.

6.2.2 Aislamiento de B. cinerea

Todas las plantas infectadas con B. cinerea, se observaron al esteromicroscopio (Zeus®

1,6x) para detectar el micelio característico del hongo (Figura 3). Una vez identificado el

material vegetal contaminado, se depositó en cámara húmeda durante un lapso de 3 a 4 días

con el fin de favorecer la esporulación. Con el objetivo de evitar el crecimiento de

bacterias, se trasladaron trozos de micelio de las muestras esporuladas a cajas de Petri con

agar extracto de malta acidificado (EMA). Se incubó bajo condiciones ambientales de

laboratorio por 8 días y se realizó un seguimiento del crecimiento del hongo diariamente.

Luego de haber obtenido el hongo en medio acidificado, se repicó en medio sin acidificar y

se observaron características microscópicas como tipo de conidia, conidióforos y micelio

(Figura 4). Todo el proceso se realizó en cámara de flujo laminar. Los medios se

esterilizaron en autoclave a 120ºC y 20 psi durante 25 minutos.

39
 Figura 4. (a) Cámara húmeda de B. cinerea al tercer día sobre D. grandiflora var. Delistar
Yellow. (b) Conidióforo y conidias del hongo. Fotografías in situ.

6.2.3 Pruebas cualitativas

Para ambos grupos bacterianos las pruebas de antagonismo cualitativas se realizaron

mediante la técnica de enfrentamiento en caja de Petri (Ramírez, 2005). Esta técnica

consiste en sembrar las posibles bacterias antagonistas y el patógeno en una misma caja; las

cepas bacterianas se reactivaron en TSA al 10% y se incubaron por 48 horas a temperatura

ambiente. Posteriormente se sembraron 6 colonias individuales de cada cepa en PDA

(Conversación directa con el doctor Kloepper, 2008), equidistantemente a lo largo del

perímetro de la caja y pasadas 24 horas se colocó un disco de micelio del hongo de 8 días

40
de edad en el centro de la caja (figura 5), a los 8 días se observó el crecimiento del hongo,

se tomó como antagonismo positivo, las bacterias que generaban un halo o una

deformación en el micelio del hongo. El control negativo fue una caja de Petri con hongo y

sin bacterias.

Aislado Aislado Aislado

1 2 3

Aislado Aislado Aislado

4 5 6

Hongo

Figura 5. Esquema mostrando método para pruebas cualitativas.

6.2.4 Pruebas cuantitativas

Los aislados que presentaron mayor actividad antagónica in vitro, fueron evaluados

cuantitativamente siguiendo el “método del anillo” empleado por Dhingra y Sinclair

(1995), modificado con PDA (Conversación directa con el Doctor Kloepper, 2008). Se

evaluaron cuantitativamente aquellas cepas que en la prueba cualitativa dieron como

positivas. Las cepas seleccionadas fueron reactivadas en TSA al 10% e incubadas por 48

horas a temperatura ambiente. Luego, con la ayuda del borde interno de una tapa de caja de

Petri pequeña, se realizó una impronta de la bacteria en una caja de Petri grande con PDA,

formando un anillo. Posterior a 24 horas y utilizando un sacabocado de 5 mm de diámetro,

41
se tomó un trozo circular de hongo de 8 días de crecimiento y se ubicó en el centro del

anillo (figuras 6 y 7). Como control negativo se utilizaron cajas cultivadas solamente con

discos del hongo ubicados en el centro de la caja (Figuras 6 y 7), una vez que el control

hubo igualado el diámetro del anillo bacteriano, se midieron los diámetros de las cajas que

contenían cada una de las cepas que se sometieron a la prueba y se determinó el porcentaje

de inhibición según la fórmula (Meza et al, 2008):

   −    

% ℎ = ( ∗ 100)
  

Tanto el control como las pruebas individuales de cada una de las cepas se realizaron por

triplicado.

Figura 6. Método del anillo (Dhingra y Sinclair, 1995) utilizado para evaluar el porcentaje
de inhibición in vitro en el crecimiento de Foc por rizobacterias seleccionadas. Fotografía
Tomada de Ramírez (2005)

42
 Bacteria

Hongo

Figura 7. Esquema mostrando método para pruebas cuantitativas.

Los datos obtenidos se manipularon utilizando Microsoft Excel 2007 y se realizó un

análisis de varianza utilizando Statgraphics Centurion XV con separación de medias por

LSD. El análisis fue llevado a cabo mediante el ajuste de modelos mixtos lineares

generalizados usando Proc GLIMMIX de SAS® (SAS institute Inc., North Carolina, USA).

El primer paso fue la evaluación de los supuestos de normalidad (distribución normal de

residuales) y heterogeneidad de varianzas. Este análisis fue realizado usando el panel de

gráficos para residuales estudiantizados generado por Proc GLIMMIX. Los datos

presentaron una distribución log-normal. Cuando el supuesto de homogeneidad de

varianzas no fue cumplido, las estructuras de varianza fueron modeladas usando la opción

group= (R-side de los parámetros de covarianza, de acuerdo con lenguaje SAS) para crear

grupos de varianzas homogéneas. La selección de un modelo apropiado estuvo basada,

además de en el análisis gráfico de residuales, en los valores AIC y AICC dados por Proc

GLIMMIX en el panel de estadísticos de ajuste (Fit Statistics). Después de confirmar la

existencia de diferencias estadísticamente significativas (P < 0.05) por la prueba F, se usó la

43
prueba de Dunnett para evaluar la diferencia entre cada uno de los tratamientos. Valores P

< 0.01 en la prueba de Dunnett fueron considerados estadísticamente significativos.

6.3 Objetivo 3: Evaluar las cepas con mayor potencial antagónico en invernadero.

6.3.1 Preparación del inóculo

Aislados Bacterianos

Para las pruebas en invernadero, se utilizaron 4 cepas pertenecientes al grupo BAFE y una

cepa del género Pseudomonas spp. Se prefirieron las BAFE por la endoespora que forman,

lo que aumenta su viabilidad en condiciones de campo. El criterio de selección para las

Pseudomonas spp. fluorescentes fue la cepa con mayor potencial antagónica in vitro,

mientras que para los BAFE, los que presentaron un potencial antagónico mayor al 75%.

Los delineamientos para este montaje se tomaron de Ramírez (2005).

Una vez seleccionadas las cepas, se reactivaron en TSA 50% y se incubaron por 48 horas a

temperatura ambiente. Posteriormente una colonia individual de cada aislado fue

transferida a un erlenmeyer con TSB 100%. Para el caso de los BAFE se utilizaron cuatro

erlenmeyer, uno por cepa, de 1000 ml con 200 ml de medio, mientras que para el aislado de

Pseudomonas spp se utilizaron dos erlenmeyer de 500 ml con 100 ml de medio cada uno.

Los erlenmeyer se sometieron a agitación constante (100 rpm) por 48 horas a temperatura

ambiente. Pasado este tiempo, el contenido de cada erlenmeyer se vertió en tubos Falcon®

44
de 50 ml y se centrifugó a 3.250 rpm durante 15 minutos. Se descartó el sobrenadante y el

pellet bacteriano fue resuspendido en 20 ml de MgSO4 • 7H2O 0,1M. Esta suspensión se

fue diluyendo poco a poco en 500 ml de la misma solución hasta ajustar una absorbancia de

0,15 para Pseudomonas spp. fluorescentes y 1 para BAFE. Ambas a una longitud de onda

de 600 nm. Estos valores de absorbancia corresponden a una densidad de inóculo

8
aproximada de 5 x 10 ufc.mL-1 .Como blanco se tomó la solución de MgSO4 •7H2O

0,1M. Todas las mediciones se realizaron con un espectrofotómetro marca Genesys 5. Cada

elemento utilizado fue esterilizado en autoclave a 120ºC y 20 psi durante 25 minutos.

Patógeno

Cepas de B. cinérea aisladas de camas infectadas, fueron cultivadas en botellas de arroz e

incubadas en el LCMB por cinco días a temperatura ambiente. Pasado este periodo, el

contenido de las botellas fue disuelto con ADE y filtrado. A esta solución se le realizó un

conteo de esporas y se ajusto la concentración a 1x106 esporas ml-1. El conteo se realizó

utilizando una cámara de Neubauer y depositando en esta 100 µl de la solución se contaron

las esporas utilizando el objetivo 40x. La concentración de esporas se estandarizo

inoculando grupos de 5 plantas con diferentes concentraciones de esporas y evaluando el

efecto de dichas concentraciones sobre las plantas. Se encontró que la concentración de

1x106 esporas ml-1 enfermo a todas las plantas de manera homogénea. (Dhingra y Sinclair ,

2005)

45
6.3.2 Siembra y cultivo

Para la realización del experimento, se construyó un pequeño invernadero de 27 m2 en las

instalaciones del departamento de Biorregulación de la finca Flores Silvestres S.A C.I.

(Figura 8), a unos 600 metros de los bloques de cultivo comerciales. Con el fin de

garantizar la “inocuidad” de las plantas empleadas, se trabajó con ellas desde el esqueje,

siguiendo los delineamientos de producción, a excepción de la aplicación de aspersiones

químicas, desde la siembra hasta el corte utilizados en el cultivo.

Figura 8. Invernadero para ensayos. Fotografía in situ.

El inicio del experimento en campo, consistió en sembrar 210 esquejes enraizados de

Crisantemo (D. grandiflora) de la variedad “Delistar Yellow”, en macetas individuales

(figura 9). La tierra con que se llenaron las macetas fue tratada de la forma convencional

46
en que lo hace el cultivo; esterilizada con caldera y fertilizada con Nitromag, Cafetero, Cal

dolomita y Manganeso.

Figura 9. Panorámica general del montaje, 8 días de siembra. Fotografía in situ.

Cultivo

El riego se realizó tres veces por semana durante todo el ciclo de cultivo (8-10 semanas

aproximadamente). El fertilizante utilizado, fue la fórmula líquida que convencionalmente

se emplea en áreas de producción (Nitrógeno, fósforo, potasio, boro, Molibdato de amonio,

sulfato de magnesio, manganeso y hierro), y se aplicó dos veces por semana hasta el

momento de la aparición de los botones laterales.

47
Controles y monitoreos

Con el fin de mantener las condiciones edáficas óptimas y la sanidad general para el

desarrollo de las plantas se monitorearon el pH y la conductividad eléctrica (CE) del suelo

y del fertilizante, la humedad relativa y la temperatura del invernadero y la incidencia de

plagas y/o enfermedades que pudieran presentarse de manera natural, parámetros

determinantes para el buen desarrollo del experimento. Tanto el pH del suelo como del

fertilizante debe mantenerse entre 5,0 y 6,5, de no ser esta la condición, se puede adicionar

cal apagada al suelo para regular pH, así mismo la conductividad eléctrica no debe exceder

los 2,5 mmhos.cm-1 (Cermeño, 2006) ya que pueden presentarse fitotoxicidades, hubo

momentos donde el suelo presentó esta condición, por lo que se mermaban las aplicaciones

de fórmulas líquidas y se hacían riegos con agua para lavar el sustrato. Las mediciones se

realizaron dos veces por semana para el suelo y para el fertilizante cada vez que se aplicó.

Se empleó un pH-metro y un conductívimetro electrónico de bolsillo (Hanna).

La humedad relativa dentro de los invernaderos de producción se mantiene entre 40 y 80%

y la temperatura entre 15 y 27ºC, es de anotar que estos rangos climáticos dependen mucho

de las temporadas de lluvia o calor de la zona, ya que entre uno y otro hay variaciones

importantes, para monitorear estos parámetros se instaló un termohygrometro 5565 Taylor

dentro del invernadero y se tomaron los datos diariamente en la mañana y en la tarde. Para

ayudar a mantener la temperatura y la humedad relativa dentro de los rangos de la finca se

cubrió el invernadero con malla polisombra al 80% y se hacían riegos constantes con

manguera alrededor de todo el invernadero y al piso de este.

48
6.3.3 Diseño experimental

El diseño del experimento fue en bloques aleatorizados. Se realizaron un total de 6 bloques,

cada bloque contenía una réplica de los siete tratamientos realizados, teniendo cada

tratamiento 6 repeticiones en total. La unidad experimental fue constituida por 5 plantas,

para un total de 30 plantas por tratamiento (figura 10 y tabla 1). Se tuvieron dos controles

como referencia para evaluar las variables de incidencia y severidad de la enfermedad, 1.

Control negativo: Plantas con la solución de MgSO4 • 7H2O 0,1M y sin ninguna

inoculación biológica y 2. Control Positivo: Plantas con la solución de MgSO4 • 7H2O

0,1M e inoculadas con B. cinerea.

49
 Cont - Cont -
BLOQUE 4

BLOQUE 3
FSB98 FSB98

FSB 65 FSB 65

FSB 84 FSB 84

FSB 58 FSB 58

FSP 71 FSP 71

Cont + Cont +

Cont -
BLOQUE 5

FSB98

FSB 65 Cont -

BLOQUE 2
FSB 84 FSB98

FSB 58 FSB 65

FSP 71 FSB 84

Cont + FSB 58

FSP 71

Cont +
Cont -
BLOQUE 6

FSB98

FSB 65

FSB 84

FSB 58 Cont -
BLOQUE 1

FSP 71 FSB98

Cont + FSB 65

FSB 84

FSB 58

FSP 71

Cont +

Figura 10. Esquema del diseño experimental por bloques al azar. FSB corresponden a cepas
de BAFE, FSP corresponden al aislado de Pseudomona sp. fluorescente.

50
Tratamiento 1 Cont (-) MgSO4 • 7H2O 0,1M sin inoculo biológico

Tratamiento 2 FSB 98 Bacillo aeróbico formador de espora (BAFE) 98

Tratamiento 3 FSB 65 BAFE 65

Tratamiento 4 FSB 84 BAFE 84

Tratamiento 5 FSB 58 BAFE 58

Tratamiento 6 FSP 71 Pseudomona spp fluorescente 71

Tratamiento 7 Cont (+) MgSO4 • 7H2O 0,1M con inoculo de B. cinerea

Tabla 1.Correspondencia de los tratamientos

6.3.4 Aplicación del inóculo

Tratamientos bacterianos

Luego de preparado el inóculo con cada una de las cepas bacterianas seleccionadas, se

conservó en nevera hasta el momento de su uso. Cada unidad experimental se aisló de las

demás colocándola en el suelo y se procedió a la aplicación del correspondiente tratamiento

con 75 ml de solución bacteriana en un atomizador “spray” previamente desinfectado con

alcohol al 98% (figura 11). Este volumen se determinó en un montaje previo, aplicando

diferentes volúmenes de agua y verificando que el total de las hojas de la planta quedase

húmedo. Luego de este procedimiento, las plantas inoculadas se colocaron en su sitio

inicial. Este procedimiento se repitió para cada una de las 6 unidades experimentales de

cada uno de los 5 tratamientos bacterianos.

51
 Figura 11. Fotografía de aspersión en Spray, en unidades experimentales aisladas.
Fotografía In situ.

Patógeno

El inóculo del patógeno se aplicó inmediatamente después de su preparación y 24 horas

después a la inoculación con los tratamientos bacterianos (figura 11). El inóculo se aplico

de forma general a todos los tratamientos sin enfocarse en cada uno de ellos por separado.

De esta manera, cada planta se asperjó con aproximadamente 2 ml de inóculo, volumen que

en un pequeño montaje de 10 plantas, generó una infección muy similar a la que se presenta

en los bloques comerciales. El único tratamiento que se aisló por un período de 48 horas

durante la inoculación fúngica fue el control negativo. Durante estos dos días se trato en

todo momento mantener la humedad relativa en un 80% y la temperatura en 22-260C,

factores determinantes para la infección por B. cinerea.

52
6.3.5 Factores

Con el fin de determinar la efectividad de los aislados obtenidos en campo, se

seleccionaron dos factores: Incidencia (Cantidad de plantas afectas) y Severidad (Grado de

afección de las plantas). En ambos casos se determinaron los porcentajes respectivos. Para

ambos factores se tomaron datos semanalmente. En el caso de la incidencia se realizó un

conteo de plantas infectadas para cada unidad experimental por tratamiento y luego se

determinó el porcentaje de incidencia según la fórmula:

Número de plantas infectas por unidad experimental X 100

Total plantas unidad experimental (5)

Para determinar el porcentaje de severidad, se realizó un conteo del número de estructuras

de pétalos y sépalos de plantas sanas de producción en 4 estadios de floración (primera

semana de floración, segunda semana de floración, flor en precorte, y flor de corte) (figura

12) se encontró que el número de estructuras no es muy variable por estadio, lo que varía es

el tamaño y la abertura, se contaron un total de 24 plantas por cada estadio y se determinó

que el promedio general de pétalos es de de 409 y de sépalos 49, para un promedio general

total de 455 estructuras para la variedad Delistar yellow. Se definió determinar la severidad

en estas estructuras ya que son los sitios que principalmente se infectan y en los cuales una

vez infectados es difícil encontrar soluciones que puedan salvar una producción.

Una vez obtenidos estos datos se realizó un conteo semanal del número de pétalos y sépalos

afectados de cada planta por unidad experimental por tratamiento, este conteo se promedió

53
para cada unidad y tomando el promedio de estructuras sanas que debe tener la planta se

calculó el porcentaje de severidad. La fórmula utilizada fue:

    

∗ 100
     (455)

Figura 12. Obsérvese los 4 estadios de la flor, de izquierda a derecha: primera semana de
floración, segunda semana de floración, flor de precorte, corte de flor. Fotografía in situ.

6.3.6 Análisis estadístico

Los datos, tanto de incidencia como de severidad, fueron analizados para cada semana por

separado. El análisis fue llevado a cabo mediante el ajuste de modelos mixtos lineares

generalizados usando Proc GLIMMIX de SAS® (SAS institute Inc., North Carolina, USA).

Debido a que el diseño experimental utilizado fue de bloques completos al azar, en todos

los casos los tratamientos fueron considerados como el único efecto fijo dentro del modelo,

mientras el efecto de los bloques fue extraído del error residual y tratado como un efecto

aleatorio. El primer paso fue la evaluación de los supuestos de normalidad (distribución

normal de residuales) y heterogeneidad de varianzas. Este análisis fue realizado usando el

panel de gráficos para residuales estudiantizados generado por Proc GLIMMIX. Con el

54
modelo mencionado, la normalidad estuvo garantizada para la incidencia en las semanas

analizadas (1 y 2, ya que en las semanas 3 y 4 todos los tratamientos presentaron una

incidencia del 100%). En el caso de la severidad, los datos presentaron una distribución

log-normal durante las 4 semanas de evaluación. Cuando el supuesto de homogeneidad de

varianzas no fue cumplido, las estructuras de varianza fueron modeladas usando la opción

group= (R-side de los parámetros de covarianza, de acuerdo con lenguaje SAS) para crear

grupos de varianzas homogéneas. La selección de un modelo apropiado estuvo basada,

además de en el análisis gráfico de residuales, en los valores AIC y AICC dados por Proc

GLIMMIX en el panel de estadísticos de ajuste (Fit Statistics). Después de confirmar la

existencia de diferencias estadísticamente significativas (P < 0.05) por la prueba F, se usó

la prueba de Dunnett para evaluar la diferencia entre cada uno de los tratamientos

(incluyendo el control no inoculado con patógeno, control negativo) y el control inoculado

artificialmente con el patógeno (control positivo).

55
6.4 Objetivo 4: Identificar la especie de la(s) cepa(s) con mayor potencial antagónico en

campo.

Se determinó que la cepa “más antagónica” en el bioensayo de invernadero fue la FSB84,

perteneciente al grupo de las BAFE, por tal motivo la taxonomía se hará siguiendo las

pruebas bioquímicas respectivas a este grupo, las cuales fueron tomadas de Sneath , (1986)

(tabla 2.)

Movilidad Crecimiento Ph 6.8 y 5.7

Producción de gas a partir de glucosa Crecimiento en Nacl al 2-5-7 y 10 %

Voges-Proskauer Indol

Nitrato a nitrito Citrato Simons

Catalasa Ubicación de espora

Generación de acido a partir de d-glucosa, Hidrólisis de gelatina y almidón

l-arabinosa-, d-xylosa-, d manitol

Tabla 2. Pruebas bioquímicas.

56
 7. RESULTADOS Y DISCUSIO

7.1 Muestro y aislamiento de rizobacterias

De las 3 zonas muestreadas se obtuvieron 87 aislados de BAFE y 130 aislados de

Pseudomonas spp. fluorescentes (figura 13) para un total de 217 aislados. Los aislados
aisla

fueron evaluados con las pruebas de KOH 3% y tinción de Gram para determinar la

clasificación del grupo bacteriano. Todos los BAFE fueron Gram positivos mientras que

todas las Pseudomonas spp. fluorescentes fueron Gram negativas. Los aislados se

encuentran
tran almacenados en crioviales con caldo tripticasa de soya (TSB) + 20% de glicerol

a -70ºC
70ºC (Ramírez, 2005) en el LCMB. (Ver Anexo 1)

a b

Figura 13. a. Aislados de Pseudomonas spp. fluorescentes vistos en transiluminador.

transiluminador
b.BAFE
BAFE 58 visto al microscopio óptico.

El trabajo con este tipo de bacterias se ve facilitado por el método de almacenamiento y

conservación en TSB + 20% glicerol

glicerol,, el cual ha demostrado ser hasta el momento el más

eficiente, para la crio-preservación

preservación ddee las bacterias, lo cual había sido reportado por otros

57
autores (Ramírez, 2005), Ramírez, 2008). Por otra parte, estudios realizados con métodos

iguales de aislamiento de rizobacterias por Ramírez (2005) en banano, Ramírez (2008) en

crisantemo, Haas y Defago (2005) con Pseudomonas spp. fluorescentes rizosféricas para el

control de enfermedades del suelo, respaldan el hallazgo de estos géneros en este trabajo.

La colección de rizobacterias obtenida, fue indispensable para lograr los objetivos de la

presente investigación. Estos objetivos pueden considerarse pioneros, ya que hasta el

momento apenas se empieza a realizar investigación aplicada de la especie en estudio.

7.2 Pruebas de antagonismo in vitro

7.2.1 Pruebas cualitativas

Los 210 aislados bacterianos fueron evaluados cualitativamente para realizar un sondeo

general de las cepas con potencial antagónico (figura 14). De los aislados de BAFE 4

resultaron con potencial antagónico (tabla 4) mientras que para Pseudomonas se

encontraron 64 aislados con características antagónicas (tabla 3).

58
Figura 14. Halo de inhibición generado por las cepas con potencial antagónico. Fotografía
tomada de Ramírez (2008)

7.2.2 Pruebas cuantitativas

Con los 68 aislados bacterianos obtenidos en las pruebas cualitativas, se realizaron pruebas

de antagonismo cuantitativo con el fin de determinar el porcentaje de inhibición de cada

uno de los aislados. Los aislados pertenecientes al grupo de Pseudomonas spp.

fluorescentes presentaron el mayor grado de antagonismo con respecto al control (tabla 3).

Sin embargo como se especificará en el próximo apartado, solo se tomó el aislado con

mayor grado de antagonismo para la evaluación en campo. De los 5 aislados a los cuales se

les realizó el análisis estadístico, la cepa FSP71 fue la que presentó un mayor porcentaje de

antagonismo con un 97.4 % con respecto al control, seguida por la FSB58 con un 89%,

seguidos por las cepas FSB98, FSB52 y FSB65 con porcentajes de antagonismo del 83.8,

83.2 y 76.7% respectivamente. Todas las cepas presentaron diferencias estadísticamente

59
significativas con respecto al control (Figura 15). En la figura 16 se ilustra el resultado del

aislado FSB58.

Cepa %Antagonismo Cepa % Antagonismo

71 97,4 5 87,2
65 97,2 105 87,2
74 96,9 112 87,1
84 96,0 100 86,7
83 95,3 116 86,6
26 94,9 123 86,4
8 94,7 107 86,1
47 94,5 121 85,9
7 94,0 98 85,6
6 93,8 115 85,6
14 92,6 2 85,6
17 91,5 124 85,4
119 91,2 9 85,4
13 90,6 93 85,3
59 89,5 96 85,0
73 89,3 68 84,8
109 89,0 113 84,8
114 88,9 29 84,8
44 88,9 92 84,7
88 88,5 66 84,6
33 88,2 91 84,6
103 88,0 90 84,6
4 87,9 108 84,1
15 87,9 76 84,0
111 87,9 89 83,9
62 87,8 94 83,5
51 87,7 120 82,4
117 87,5 106 82,4
54 87,5 31 82,2
99 87,3 10 81,9
122 87,2 64 80,8
97 87,2 30 79,0
Tabla 3. Porcentaje de antagonismo de los aislados pertenecientes al grupo Pseudomonas
spp.
%
Cepa Antagonismo
58 89,6
98 83,9
52 83,2
65 76,8
Tabla 4. Porcentaje de antagonismo de los aislados pertenecientes al grupo BAFE.

60
 Diametro
60

p=0.0264
50
Diametro (mm)

p=0.0002
p=0.0003
40

p<0.0001
p< 0.0001
30
20
10
0
FSP 71 FSB 58 FSB 98 FSB 84 FSB 65 Control
Cepa

% Antagonismo
120
a
100 ab
% Antagonismo

b b c
80
60
40
20
0
FSP 71 FSB 58 FSB 98 FSB 84 FSB 65
Cepa

Figura 15. Grado de inhibición de B. cinérea generado por las 5 cepas bacterianas, nótese
que todos los tratamientos presentan diferencias estadísticas significativas respecto al
control positivo. (a) Resultados según diámetro. Se ilustran los valores p de la prueba de
Dunnet. Para la prueba F el valor P<0.0001. (b) Resultados según % Antagonismo

61
 Figura 16. Prueba cuantitativa BAFE FSB58. Fotografía in situ

Los resultados obtenidos en los ensayos de laboratorio, concuerdan con los reportes que

existen acerca de la actividad antagónica de estos dos grupos bacterianos, concernientes a la

bioregulación del hongo fitopatógeno B. cinerea. Los resultados obtenidos in vitro,

evidencian claramente que las Pseudomonas obtenidas de los aislamientos, poseen un

mayor potencial antagónico que los aislados pertenecientes a BAFE. Este hecho puede

deberse a los diversos mecanismos de antagonismo que poseen las Pseudomonas spp.

fluorescentes para controlar el hongo. Estudios realizados por Páez et al, (2005), reportan

en varias especies de Pseudomonas, la producción de sideróforos, la colonización de hifas y

la producción de antibióticos como principales mecanismos antagónicos contra B. cinérea.

Walker (2002) realizó experimentos en los cuales descubrió que P. antimicrobia produce

metabolitos secundarios que inhiben la germinación de conidias de B. cinérea hasta en un

20%. Mikani et al, (2007) realizan una aproximación a los metabolitos secundarios

producidos por Pseudomonas fluorescens involucrados en el proceso de antagonismo. Los

bioensayos realizados por este grupo de investigadores, revelan que la pirrolnitrina,

62
metabolito derivado del triptófano, posee un alto poder antifúngico. En el mismo trabajo,

los autores reportan que P. syringae utiliza como mecanismos antagónicos la competencia

por espacio y nutrientes. Por otra parte, Delaney et al (2000) clasifica al metabolito 2,4

diacetilflotoglucinol como protagonista en la actividad biocontroladora de P. fluorescens.

En cuanto a los mecanismos de antagonismo de las bacterias pertenecientes a BAFE,

Walker (1998,2002) reporta que los metabolitos polimixina y subtilina producidos por B.

polymyxa y B. subtilis respectivamente inhiben el crecimiento de Botrytis en judías. Según

Edwars (2001) la producción de gramidicina por parte de Brevibacillus brevis es la

responsable de la inhibición en el proceso germinativo de las esporas de B. cinérea. En un

completo análisis de los microorganismos susceptibles a un antagonismo por parte de cepas

del género Bacillus realizado por Földes et al (2000), se encontró que la actividad

controladora fue consecuencia de un amplio espectro de compuestos o varios compuestos

antimicrobianos. Los compuestos fueron efectivos controlando hongos filamentosos,

levaduras y bacterias.

Aunque se conoce la producción de sideróforos por parte de las bacterias pertenecientes a

BAFE, existen algunos pocos estudios que reportan a esta sustancia como un mecanismo

controlador eficaz en el género Bacillus. Reyes et al en el 2000 al analizar los diferentes

mecanismos de antagonismo de cepas pertenecientes a B. subtilis, reporta que los

metabolitos secundarios y los metabolitos volátiles inhiben en mayor grado el crecimiento

de Botrytis que los sideróforos producidos por esta bacteria. Al parecer las características

63
de los siderofóros producidos por BAFE, no permiten que estas bacterias posean una

actividad antagónica como la de Pseudomonas.

Es entonces posible, que la diferencia observada en los ensayos de laboratorio sea

ocasionada por las diferentes estrategias adoptadas por cada uno de los grupos bacterianos,

poseyendo las Pseudomonas un número mayor de mecanismos de antagonismo.

7.3 Pruebas de antagonismo en invernadero

Como ya se mencionó en el apartado 6.3.1 A pesar de que en el grupo de Pseudomonas

spp. se encontraron más aislados antagónicos, se decidió, para las pruebas en invernadero,

trabajar con los aislados pertenecientes a BAFE debido a la formación de endoesporas,

característica que aumenta las posibilidades de establecimiento y resistencia a posibles

condiciones adversas. A continuación se presentan los resultados obtenidos para los

factores evaluados.

Todos los tratamientos, incluyendo el control (-), fueron comparados contra el control (+)

para determinar la variación que cada uno tuvo respecto al mismo (Figura 17b). Para la

semana 1 se observa que los aislados FSB98, FSB 65, FSB 84 y FSB 58 tuvieron

diferencias estadísticamente significativa con respecto al control(+) (Figura 17 a y b). En la

semana 2 se observó un aumento en la incidencia de todas las cepas menos de la FSB 84

que mantuvo su diferencia con respecto al control (+) en mas de un 99% igualando al

control(-).

64
 Comparación en el progreso de la enfermedad
Mínimos cuadrados para incidencia (%) (% Incidencia)

P = 0.9949
P = 0.5901

P = 0.5901
P = 0.3129
P = 0.0063***

P = 0.0063***
100,0
90,0 Control (+)

P = 0.4972
80,0 Control (-)

P = 0.0120***
P = 0.0047***
70,0 P = 0.0018*** FSB65
60,0
FSB98
50,0
P < 0.0001 ***
P < 0.0001***

40,0 FSB58
30,0 FSB84
20,0
FSP71
10,0
0,0
Semana 1 Semana 2

a.
Semana
Tratamiento
1 2

Control (-) <0.0001 0,0063

FSB65 0,0018 0,5901

FSB98 <0.0001 0,9949

FSB58 0,0120 0,3129

FSB84 0,0047 0,0063

FSP71 0,4972 0,5901

b
Figura 17. a. Porcentaje de incidencia de los tratamientos durante las semanas 1 y 2. Para las
semanas 3 y 4 todos los tratamientos presentaron 100% de incidencia (no se muestran los
datos). b. Valores P para la prueba de Dunnet (comparación con respecto al control positivo)
evaluando el efecto de tratamientos bacterianos sobre la Incidencia de B. cinerea durante 2
semanas después de la inoculación artificial con el patógeno. Valores en rojo son considerados
estadísticamente significativos (P < 0.01).

65
Los resultados obtenidos para la severidad se ilustran en la figura 18.

40
Comparación en el progreso de la enfermedad
35 (% Severidad)
Mímos cuadrados para Severidad (%)

30
Control (+)
25 Control (-)
FSB65
20
FSB98
15 FSB58

10 FSB84
FSP71
5

0
Semana 1 Semana 2 Semana 3 Semana 4

a.
Semana
Tratamiento
1 2 3 4

Control (-) 0,0072 0,0053 0,0031 0,0044

FSB65 0,9850 0,9999 0,9229 0,7185

FSB98 0,7844 0,5174 0,1816 0,1690

FSB58 0,0075 0,6353 0,2169 0,2372

FSB84 0,0307 0,1646 0,2877 0,2722

FSP71 1,0000 1,0000 0,6271 0,1626

b
Figura 18. a. % de severidad para las cuatro semans. b.Valores P para la prueba de Dunnet
(comparación con respecto al control positivo) evaluando el efecto de tratamientos bacterianos
sobre la severidad de Botrytis cinerea las cuatro semanas después de la inoculación artificial
con el patógeno. Valores en rojo son considerados estadísticamente significativos (P < 0.1).

66
Debido a que algunos factores del experimento son imposibles de controlar en su totalidad,

para el factor de severidad se decidió aceptar aquellos valores con un valor p<0.1 como

estadísticamente significativos. Se observa entonces que los aislados FSB 58 y FSB 84

presentan diferencias estadísticamente significativas respecto al control(+) (figura 18b).

Estos resultados son congruentes con los observados en los valores de incidencia, donde la

cepa FSB 84 tuvo diferencias en las dos semanas analizadas (figura 17b).

Figura 19. Plantas afectadas por el patógeno. Fotografía in situ.

67
El comportamiento antagónico in vitro se ve contrastado por los resultados obtenidos en

campo, en donde, al parecer, la formación de endoesporas por parte de los BAFE favorece

su establecimiento en la filosfera.

A pesar de la innegable efectividad de las bacterias Gram positivas, estas han sido poco

estudias durante la última década, en parte debido a la falta de estudios genéticos que se

tienen acerca de estos microorganismos. Sin embargo, recientemente los investigadores han

enfocado su atención hacía este grupo bacteriano, debido a los excelentes resultados

obtenidos en campo y la facilidad que brinda la formación de esporas para la formulación

de estos microorganismos. De hecho esta característica ha sido ampliamente explotada

desde hace ya varias décadas, con la utilización de B. thuringensis como agente

entomopatógeno. (Emmert 1999)

Lee y colaboradores (2006), realizaron experimentos en cultivos de tomate bajo

invernadero y encontraron que la aplicación de un bioformulado a base de B. licheniformis

redujo hasta en un 90% la enfermedad del moho gris causada por B. cinérea, en este ensayo

la efectividad del bioformulado fue incluso mayor que el producto químico utilizado (70%),

adicional al control del patógeno, el tratamiento bacteriano en comparación con el químico,

aumentó el número de frutos por planta y generó un engrosamiento de las hojas.

A pesar de la superioridad de los BAFE en campo, no se puede negar que las bacterias

pertenecientes al grupo de la Pseudomonas, también poseen gran potencial como

biocontroladoras. Amein et al, (2008), reportan que semillas de trigo tratadas con P.

68
fluorescens, aumentan el porcentaje de germinación y el porcentaje de infección del moho

nevoso generado por el patógeno M. nivale se ve drásticamente reducido. Así mismo el

tratamiento bacteriano generó un aumento de plantas de 46% y la cosecha se vio

incrementada en 26%. Este estímulo de crecimiento vegetal es investigado por Ramírez

(2008), sobre Pseudomonas en crisantemo quien descubre que estas bacterias poseen la

capacidad de producir metabolitos involucrados en la promoción de crecimiento,

especialmente la producción de la enzima ACC de aminasa y una gran habilidad para

colonizar la rizosfera.

Recientemente se ha encontrado que existen algunas cepas de Pseudomonas que poseen la

capacidad de colonizar tejidos internos de las plantas. En 2008 esta característica endófita,

es reportada por Aziz y colegas, en su trabajo realizado en vid, encontraron que P.

agglomerans, aislada de hojas, y P. fluorescens, aislada de tallos, presentaron actividad

antagónica contra B. cinérea.

En el presente trabajo, es importante resaltar el comportamiento del aislado FSB65. Este

aislado presentó, dentro de los BAFE, el menor porcentaje de antagonismo in vitro,

mientras que en las pruebas de campo mostró el menor grado de porcentaje de incidencia

para la semana 1. Es posible que esta cepa posea características adaptativas que le permitan

colonizar de manera rápida y efectiva la filosfera. Sin embargo en la semana 2 el aislado

FSB 84 superó el porcentaje de incidencia logrado por el FSB65 e igualó al control

negativo. Probablemente el mecanismo de FSB84 para colonizar la filosfera no es tan

eficiente como lo es el de FSB65, sin embrago posee una adaptación que le permite exhibir

69
sus rasgos de antagonismo en el tiempo. Indudablemente, es necesario realizar estudios que

soporten estas especulaciones.

Los resultados obtenidos en las pruebas de campo, son altamente alentadores ya que

demuestran el potencial biocontrolador de los microorganismos aislados y su posible

implementación en las actividades productivas. Es de anotar que, en los ensayos en campo

solo se realizó una sola aspersión con la suspensión bacteriana y que esto puede ser la causa

de los porcentajes de severidad obtenidos. Porcentajes que no son aceptables a nivel

comercial. Sin embargo, ensayos como los realizados por Lee et al (2006), dan indicios del

rumbo a seguir con el material obtenido.

Finalmente, es importante considerar que tanto los BAFE como las Pseudomonas, poseen

un alto potencial como elementos biocontroladores. La literatura existente hasta el

momento, ha demostrado que las Pseudomonas son excelentes promotoras de crecimiento y

altamente efectivas como “vacunas” de semillas, mientras que los BAFE, por su

característica de formar endoesporas, se han caracterizado como unos excelentes candidatos

a la hora de producir bioformulados. Utilizando cada uno de los grupos bacterianos, de

acuerdo a sus características de adaptación a los diferentes nichos ecológicos, es posible

lograr excelentes resultados.

70
7.4 Identificar la especie de la(s) cepa(s) con mayor potencial antagónico en campo.

Los resultados obtenidos en estas pruebas permitieron realizar un acercamiento a la

clasificación taxonómica del BAFE 84, que se presume podría pertenecer a la especie
Bacillus laterosporus, de tal forma que las comparaciones entre esta bacteria y las
descripciones registradas por (MANUAL BERGEYS) asi lo indican. Todas las pruebas
excepto la de la hidrólisis del almidón coinciden con el microorganismo mencionado
(Tabla 5). Sin embargo, teniendo en cuenta la variabilidad de las características
bioquímicas de algunas cepas bacterianas, y la existencia de técnicas mas sensibles para la
clasificación taxonómica, es necesario realizar ténicas moleculares, en donde se utilice el
ADNr bacteriano.

Si se trata de esta especie, es importante anotar como este microorganismo, ya ha sido

registrado para el biocontrol de insectos plaga (Martínez et al 1985), al igual que en
vectores de enfermedades en humanos ( Orloya et al, 1998). Adicionalmente estudios
realizados en años anteriores, han dado como resultado una patente para el control de
hongos oportunistas en humanos, tales como Cándida y Aspergillus (US Patent 5455028 -
Method of inhibiting fungi by Bacillus laterosporus Inventor O'Donnell, Boyd J.
Application No. 236701 filed on 04/28/1994) y para el control de nemátodos (US Patent
5045314 - Control of parasitic nematode ova/larvae with a Bacillus laterosporus. Inventors
Bone, Leon W. Singer, Samuel Application No. 436154 filed on 11/14/1989)

71
 Catalasa +
Voges-Proskauer -
Generación de acido a partir de:
• d-glucosa -
• l-arabinosa -
• d-xylosa -
• d manitol +

Hidrólisis de:
• Gelatina +
• Almidón +
Citrato Simons -
Reducción de Nitratos a nitritos +
Indol -
Generación de gas a partir de -
glucosa
Crecimiento en %Nacl al
• 2 +
• 5 -
• 7 -
• 10% -

Crecimiento a pH:
• 6.8 +
• 5.7 +
Movilidad +
Ubicación espora Central
Tabla 5. Resultados pruebas bioquímicas.

72
 9. COCLUSIOES

1. Las poblaciones bacterianas, de los grupos Pseudomonas y BAFE, de la rizosfera de

suelos no intervenidos de la finca del floricultivo Flores Silvestres S.A. C.I, son

susceptibles a ser aislados por los métodos reportados en la literatura.

2. Dentro de esta población existen cepas bacterianas con potencial antagónico al hongo

fitopatógeno B. cinérea.

3. El método de criopreservación, utilizado en este trabajo, es efectivo para almacenar

bacterias rizosféricas y preservar sus mecanismos de antagonismo.

4. Los resultados obtenidos en campo, evidencian la superioridad de los BAFE frente a

las Pseudomonas.

5. No obstante la Pseudomona sp. fluorescente evaluada presentó porcentajes de

antagonismo in vitro de 90%, en campo no logró establecerse y por lo tanto no mostró

resultados congruentes con este dato de laboratorio.

6. In vitro, hubo una mayor cantidad de cepas antagónicas pertenecientes a

Pseudomonas.

73
7. A pesar de que se obtuvieron buenos resultados investigativos a nivel de porcentajes de

incidencia y severidad en campo, es necesario continuar realizando investigaciones con

el fin de alcanzar estándares de producción.

8. Es posible realizar de una manera fácil, efectiva y económicamente viable un sondeo

de los microorganismos antagónicos presentes en un área determinada.

74
 10. RECOMEDACIOES

1. Los aislados FSB 84, FSB 65 y FSB 98 deben continuar estudiándose pues mostraron

su potencial como agentes biocontroladores.

2. Es recomendable evaluar los rasgos PGPR de la colección de rizobacterias obtenida,

con el fin de combinar estrategias de antagonismo y promoción de crecimiento en el

plan de manejo integrado de enfermedades.

3. Es preciso realizar pruebas de campo repitiendo la aspersión con la solución bacteriana

a diferentes intervalos de tiempo.

4. Hacer varias repeticiones del ensayo para tener más datos que sustenten cual de los

tratamientos puede empezar un proceso de investigación para ser bioformulado.

5. Es conveniente incluir en futuras repeticiones del ensayo un tratamiento donde se

mezclen los cuatro BAFE, previo estudio in vitro de compatibilidad.

6. Es importante corroborar con pruebas moleculares, la identificación presuntiva de

Bacillus laterosporus realizada mediante algunos caracteres bioquímicos.

75
 11.AEXO 1

Listado de cepas de BAFE y Pseudomonas almacenadas. Las marcadas en Amarillo,

corresponden a aquellos aislados trabajados en las pruebas de patogenicidad.

Codigo Cepa # Codigo Cepa # Codigo Capa #

Bc 1 1 Bc 31 31 Bc 64 61
Bc 2 2 Bc 32 32 Bc 65 62
Bc 3 3 Bc 33 33 Bc 66 63
Bc 4 4 Bc 34 34 Bc 67 64
Bc 5 5 Bc 35 35 Bc 69 65
Bc 6 6 Bc 36 36 Bc 71 66
Bc 7 7 Bc 37 37 Bc 72 67
Bc 8 8 Bc 38 38 Bc 73 68
Bc 9 9 Bc 39 39 Bc 74 69
Bc 10 10 Bc 40 40 Bc 75 70
Bc 11 11 Bc 41 41 Bc 76 71
Bc 12 12 Bc 42 42 Bc 77 72
Bc 13 13 Bc 43 43 Bc 78 73
Bc 14 14 Bc 44 44 Bc 79 74
Bc 15 15 Bc 45 45 Bc 80 75
Bc 16 16 Bc 46 46 Bc 83 76
Bc 17 17 Bc 47 47 Bc 84 77
Bc 18 18 Bc 48 48 Bc 85 78
Bc 19 19 Bc 49 49 Bc 86 79
Bc 20 20 Bc 50 50 Bc 87 80
Bc 21 21 Bc 51 51 Bc 92 81
Bc 22 22 Bc 52 52 Bc 93 82
Bc 23 23 Bc 53 53 Bc 97 83
Bc 24 24 Bc 54 54 Bc 98 84
Bc 25 25 Bc 55 55 Bc 100 85
Bc 26 26 Bc 56 56 Bc 101 86
Bc 27 27 Bc 57 57 Bc 102 87
Bc 28 28 Bc 58 58
Bc 29 29 Bc 59 59
Bc 30 30 Bc 63 60

76
 Cepa Cepa Cepa
Codigo # Codigo # Codigo #
Ps 1 1 Ps 44 44 Ps 87 87
Ps 2 2 Ps 45 45 Ps 88 88
Ps 3 3 Ps 46 46 Ps 89 89
Ps 4 4 Ps 47 47 Ps 90 90
Ps 5 5 Ps 48 48 Ps 91 91
Ps 6 6 Ps 49 49 Ps 92 92
Ps 7 7 Ps 50 50 Ps 93 93
Ps 8 8 Ps 51 51 Ps 94 94
Ps 9 9 Ps 52 52 Ps 95 95
Ps 10 10 Ps 53 53 Ps 96 96
Ps 11 11 Ps 54 54 Ps 97 97
Ps 12 12 Ps 55 55 Ps 98 98
Ps 13 13 Ps 56 56 Ps 99 99
Ps 14 14 Ps 57 57 Ps 100 100
Ps 15 15 Ps 58 58 Ps 101 101
Ps 16 16 Ps 59 59 Ps 102 102
Ps 17 17 Ps 60 60 Ps 103 103
Ps 18 18 Ps 61 61 Ps 104 104
Ps 19 19 Ps 62 62 Ps 105 105
Ps 20 20 Ps 63 63 Ps 106 106
Ps 21 21 Ps 64 64 Ps 107 107
Ps 22 22 Ps 65 65 Ps 108 108
Ps 23 23 Ps 66 66 Ps 109 109
Ps 24 24 Ps 67 67 Ps 110 110
Ps 25 25 Ps 68 68 Ps 111 111
Ps 26 26 Ps 69 69 Ps 112 112
Ps 27 27 Ps 70 70 Ps 113 113
Ps 28 28 Ps 71 71 Ps 114 114
Ps 29 29 Ps 72 72 Ps 115 115
Ps 30 30 Ps 73 73 Ps 116 116
Ps 31 31 Ps 74 74 Ps 117 117
Ps 32 32 Ps 75 75 Ps 118 118
Ps 33 33 Ps 76 76 Ps 119 119
Ps 34 34 Ps 77 77 Ps 120 120
Ps 35 35 Ps 78 78 Ps 121 121
Ps 36 36 Ps 79 79 Ps 122 122
Ps 37 37 Ps 80 80 Ps 123 123
Ps 38 38 Ps 81 81 Ps 124 124
Ps 39 39 Ps 82 82 Ps 125 125
Ps 40 40 Ps 83 83 Ps 126 126
Ps 41 41 Ps 84 84 Ps 127 127
Ps 42 42 Ps 85 85 Ps 128 128
Ps 43 43 Ps 86 86 Ps 129 129
Ps 130 130

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