Universidad Colegio Mayor de Cundinamarca

Facultad de Ciencias de la Salud

Bacteriología y Laboratorio Clínico

Biología Molecular y Celular

Docente: Gladys Pinilla

Secuenciación y Clonación

Maria Daniela Bacca Patiño

Johanna Ruiz Gómez

Andrea Rodriguez González

Yordy Ferney Rodriguez Gonzalez

Grupo: IV A

Bogotá

2018
 INTRODUCCIÓN

Las técnicas de ingeniería genética han ido avanzando a través del tiempo,

desde 1952 en donde se realizó la primera clonación a partir de del óvulo de una rana,

por científicos de la Universidad de Pennsylvania, quienes después del éxito logrado

continuaron haciendo clonación con ratones. La clonación es el procedimiento de

obtener una población de varios individuos genéticamente homogéneos a partir de uno

solo por reproducción asexuada. El concepto de clonación puede aplicarse, en la

ciencia moderna, tanto a nivel molecular como celular y se ha desarrollado siendo un

gran descubrimiento que aporta en la investigación de diagnóstico y terapia en la

medicina moderna, así como también aplicaciones industriales, en animales y plantas a

pesar de sus implicaciones bioéticas.

Durante décadas, los microbiólogos han podido cultivar in vitro poblaciones de

células procariotas, como las bacterias, tales microorganismos, que en la naturaleza se

desarrollan como células simples, son relativamente fáciles de cultivar, generalmente

sobre la superficie de un medio de cultivo que proporciona los requerimientos

nutricionales para el microorganismo, así mismo, a lo largo de la historia los

investigadores se preguntaban cómo se podría hacer esto mismo con células de

animales, humanos o plantas (células eucariotas), para poder desarrollar cultivos de

tejidos haciendo de esto un gran aporte para la ciencia por medio de técnicas más

avanzadas El mantenimiento y desarrollo, durante largos períodos de tiempo, de

células normales y diferenciadas animales y, sobre todo, humanas fuera del cuerpo (in

vitro) se ha visto posibilitado al establecerse en el curso del siglo XX varias

investigaciones y acontecimientos que documentan los nuevos hallazgos.

Estas técnicas de cultivos celulares in vitro, posibilitan hoy día la obtención de

clones no sólo de células cultivadas o de organismos unicelulares como las amebas,

sino también de organismos complejos, incluidos los mamíferos e incluso el hombre. la

clonación es, un procedimiento artificial expresamente dirigido a producir individuos

genéticamente homogéneos mediante mecanismos reproductores asexuados. La

clonación de complejos organismos pluricelulares como los mamíferos y el hombre

reemplaza artificialmente la reproducción sexual, omitiendo los procesos naturales de

la recombinación genética y la selección natural. En este escrito tratamos el tema a

profundidad haciendo énfasis en definiciones y aplicaciones del mismo, que nos

ayuden a tener una claridad frente a sus aplicaciones en las ciencias de la salud y

como puede ser reflejado en nuestro ámbito estudiantil y laboral.

 OBJETIVOS

GENERAL:

 Entender las estrategias que se establecen frente a la secuenciación y la

clonación dependientes de la preparación de células competentes que permitan

la transformación y la producción del ADN genómico.

ESPECÍFICOS:

● Identificar los aspectos más importantes relacionados con el origen de

plásmidos, cósmidos, cromosomas artificiales y bacteriófagos, los cuales están

vinculados en la manipulación genética y por ende en la secuenciación.

● Establecer los marcadores de selección de proteínas mediante enzimas de

restricción que permitan la replicación y elongación del ADN a través de vectores

de clonación

SECUENCIACIÓN DEL ADN

1.¿Para qué sirve?

Cuando un científico desea conocer la información genética heredable de seres

vivos, utilizará una secuenciación del ADN que le permitirá observar qué tramos del

ADN contienen genes, cuales transportan instrucciones regulatorias y cuales pueden

activar o desactivar genes e incluso los genes que pueden alterarse y producir

enfermedades.
 La secuenciación de ADN es un conjunto de métodos y técnicas bioquímicas

cuya finalidad es determinar el orden de los cuatro componentes básicos químicos,

llamados "bases", que forman la molécula de ADN, conocidos como nucleótidos (A, C,

G y T). Las técnicas actuales permiten realizar esta secuenciación a gran velocidad, lo

cual ha sido de gran importancia para proyectos de secuenciación a gran escala como

el Proyecto Genoma Humano, teniendo en cuenta que este genoma contiene alrededor

de tres mil millones de pares de bases que detallan las instrucciones para crear y

mantener a un ser humano.

2. Técnicas empleadas en la secuenciación de ADN

Como se dijo anteriormente en la actualidad existen métodos que realizan

secuenciaciones a gran velocidad. Durante treinta años la mayor parte se llevaba a

cabo con el método de terminación de la cadena desarrollado por Frederick Sanger, en

1975. Antes de un método rápido en 1973 Walter Gilbert y Allan Maxam publicaron una

secuencia de 24 pares de bases utilizando un método conocido como “punto corrido”.

La secuenciación de ARN, es la técnica más sencilla a diferencia del de ADN y el

primero data con ADN recombinante, de donde se obtuvo la primera secuencia de gen

completo del genoma Bacteriófago MS2.

a) Pirosecuenciación: La pirosecuenciación o secuenciación 454, es una tecnología

de determinación de secuencia de DNA a gran escala, aplicable a genomas completos,

mediante luminiscencia. A diferencia del sistema de Sanger, capaz de resolver 67.000

bases cada hora, el método 454 puede determinar la secuencia de 20millones en 4,5

horas, lo cual disminuye los costos en el procedimiento.

 Fundamento

La muestra biológica se carga en una placa, de fibra óptica, que permite

transmitir la luz producida por quimioluminiscencia durante la reacción de

secuenciación hasta la cámara de captación de imágenes. Dicha placa, en forma de

panal, posee multitud de pocillos. El tamaño del DNA a secuenciar en cada pocillo:

debe ser entre a 500 y 1000 nucleótidos. El ADN genómico con la cual comenzar la

secuenciación se carga en la placa; en ella, cada fragmento se amplifica de forma

aislada mediante PCR basada en emulsión de modo que se amplifique hasta

10millones de veces; este incremento facilita la detección de la señal.

Lo más importante de la técnica es controlar el flujo secuencial y cíclico de

nucleótidos sobre la placa en combinación con un sistema de detección bioluminiscente

que permite convertir los productos generados durante la incorporación de nucleótidos

(pirofosfato) en luz (por medio de la luciferasa) que es detectable por el dispositivo.

Procedimiento

Para la secuencuenciación se utilizarán los siguientes componentes:

• un ADN de cadena sencilla que actúa como molde

• un cebador para iniciar la síntesis de ADN

• tres desoxirribonucleótidos trifosfato (dGTP, dCTP y dTTP) más desoxiadenosina alfa-

tiotrifosfato (dATPS, un derivado del dATP que puede ser utilizado normalmente por la

ADN-polimerasa pero que no es reconocido por la luciferasa).

• cuatro enzimas: ADN polimerasa (que cada vez que añade un nuevo

desoxirribonucleótido trifosfato a la cadena naciente genera una molécula de PPi), ATP

sulfurilasa (que convierte el PPi en ATP en presencia de APS), luciferasa (que, en

presencia de ATP, convierte la luciferina en oxiluciferina y genera un fotón de luz

visible) y apirasa (que degrada los nucleótidos que no se han incorporado a la cadena

naciente y el ATP generado por la sulfurilasa).

• adenosina 5'-fosfosulfato (APS)

• luciferina

El procedimiento es el siguiente:

1 Fase: Preparación de una genoteca. Se fragmenta el ADN genómico por métodos

suaves como, por ejemplo, la nebulización, que genera fragmentos de entre 300 y 800

pares de bases. Se marcan los extremos de los fragmentos con dos tipos de

adaptadores, que denominaremos A y B (uno permitirá que el fragmento se una a las

esferas de agarosa y el otro es complementario al oligonucleótido que actuará como

cebador en las fases de amplificación y secuenciación).

Fig 1. Primera fase de pirosecuenciación

2 Fase: En la segunda fase se hace una PCR en emulsión, es decir, en una mezcla de

aceite y agua. En cada gota aumenta exponencialmente el número de fragmentos de

ADN (todos ellos idénticos) que, a su vez, se unen a los oligonucleótidos que recubren

la esfera.

Fig 2. Segunda fase de pirosecuenciación

A continuación, se deshace la emulsión y se depositan las esferas recubiertas

de ADN en una placa que contiene cientos de miles de pocillos con un diámetro medio

de 44 μm, de manera que en cada pocillo sólo cabe una esfera. Algunos pocillos

pueden quedar vacíos. A continuación se añaden otras esferas más pequeñas sobre

las que se han inmobilizado dos de las enzimas que intervienen en el proceso de

pirosecuenciación (la sulfurilasa, que convierte el PPi en ATP, y luciferasa, que

convierte la luciferina en oxiluciferina y genera un fotón de luz).

 Fig 3. Segunda fase de pirosecuenciación

3 Fase: En la tercera fase se lleva a cabo la pirosecuenciación. El sistema de flujo hace

pasar de manera secuencial cada uno de los cuatro nucleótidos a través de la placa

que contiene los pocillos. Se añaden siempre en el mismo orden (TACG) con lo que se

consigue una secuenciación masiva en paralelo (cientos de miles de pocillos, cada uno

con dos millones de fragmentos de ADN). Cada vez que en uno de los pocillos se

incorpora un nucleótido se genera una señal quimioluminiscente que es recogida por

una cámara digital. Esta señal es proporcional al número de nucleótidos que se

incorporan en cada pocillo.

Fig 4. Tercera fase de pirosecuenciación

4 Fase: Se hace un análisis de las imágenes obtenidas en cada pocillo y se determina

la secuencia de cada fragmento. A partir de esta colección de secuencias se

reconstruye la secuencia genómica original por métodos computacionales.

Fig 5. Cuarta fase de pirosecuenciación

APLICACIONES

Secuenciación de: genomas completos, transcriptomas, amplicones, extremos

apareados. Identificación de SNPs, sitios de unión para la transcripción.

b) Método enzimático de Sanger: Este método de secuenciación de ADN fue

diseñado por Sanger, Nicklen y Coulson también en 1977 y se conoce como método de

los terminadores de cadena o dideoxi.

 Fundamento

Este método realiza la replicacion de una region blanco de ADN, la cual resulta

al disponer de un ADN de cadena simple (molde) y un iniciador, cebador o "primer"

complementario de una región del ADN molde anterior a donde va a iniciarse la

secuencia. Este cebador se utiliza como sustrato de la enzima ADN polimerasa que va

a extender la cadena copiando de forma complementaria el molde de ADN. Es

importante aclarar que los dideoxi son similares a los nucleótidos normales, pero con

una diferencia clave: no tienen grupo hidroxilo en el carbono 3' del anillo de azúcar.

Puesto que en un nucleótido normal, el grupo hidroxilo 3' actúa como un "gancho" que

permite que un nuevo nucleótido se añada a una cadena existente. Y a diferencia Una

vez que se añade a la cadena un nucleótido dideoxi, ya no hay un hidroxilo sobre el

que se puedan agregar más nucleótidos. La cadena termina con el nucleótido dideoxi,

que está marcado con pigmento de un color particular dependiendo de la base (A, T, C

o G) que lleve.

Figura 6. Dideoxi
 Procedimiento

Para poder secuenciar se necesita de:

● Una enzima ADN polimerasa

● Un cebador, que es un fragmento pequeño de ADN monocatenario que se une

al molde de ADN y actúa como un "iniciador" de la polimerasa.

● Los cuatro nucleótidos del ADN (dATP, dTTP, dCTP, dGTP).

● El molde de ADN que será secuenciado.

Sin embargo, una reacción de secuenciación de Sanger también contiene Versiones

dideoxi, o terminadores de la cadena, de los cuatro nucleótidos (ddATP, ddTTP,

ddCTP, ddGTP), cada uno marcado con pigmentos de color diferente.

1 Fase: La muestra de ADN que se secuenciará se combina en un tubo con el cebador,

la ADN polimerasa y los nucleótidos del ADN (dATP, dTTP, dGTP y dCTP). También

se añaden los cuatro nucleótidos didesoxi terminadores de la cadena, marcados con su

pigmento, pero en cantidades mucho más pequeñas que los nucleótidos normales.

2 Fase: Se calienta la mezcla para desnaturalizar el molde de ADN (separar las

cadenas) y luego se enfría para que el cebador pueda unirse al molde de cadena

sencilla. Una vez que se ha unido el cebador, se eleva la temperatura para que la ADN

polimerasa pueda sintetizar ADN nuevo a partir del cebador. La ADN polimerasa

añadirá nucleótidos a la cadena hasta que aleatoriamente agregue un nucleótido

dideoxi en lugar de uno normal. A partir de ese momento, no es posible agregar más

nucleótidos y la cadena termina con el nucleótido dideoxi. Este proceso se repite cierto
número de ciclos. Cuando los ciclos terminan, está prácticamente garantizado que se

ha incorporado un nucleótido dideoxi en cada una de las posiciones del ADN blanco en

al menos una reacción.

Fig. 7 Método enzimático de Sanger

3 Fase: Cuando la reacción termina, los fragmentos se hacen pasar a través de un

tubo largo y delgado que contiene una matriz de gel en un proceso llamado

electroforesis capilar en gel. Los fragmentos cortos se mueven rápidamente a través de

los poros del gel, mientras que los fragmentos largos se mueven más lentamente.

Cuando cada fragmento cruza la "línea de meta" al final del tubo, un láser lo ilumina y

permite la detección del pigmento asociado.

4 Fase: Los fragmentos pequeños serán los primeros en observarse. De está forma, se

recontruye la secuencia del fragmento de ADN a partir de los colores de los pigmentos

registrados de los nucleótidos por el detector. Y finalmente la secuencia de ADN se va

a leer a partir de los picos en el cromatograma.

 Aplicaciones

Al arrojar secuencias de alta calidad para segmentos largos de ADN (hasta 900pb), la

técnica es usada para secuenciar fragmentos individuales de ADN, como plásmidos

bacterianos o ADN copiado en la PCR.

c) Secuenciación de nueva generación

Llamado así al ser el conjunto de tecnologías más recientes de secuenciación de ADN.

Hay una variedad de técnicas de secuenciación de nueva generación que utilizan

diferentes tecnologías. Sin embargo, la mayoría comparte un conjunto común de

características que las distinguen de la secuenciación de Sanger:

● Altamente paralelas: ocurren muchas reacciones de secuenciación al mismo

tiempo.

● Microescala: las reacciones son diminutas y se pueden hacer muchas a la vez

en un chip.

● Rápidas: puesto que las reacciones se realizan en paralelo, los resultados están

listos mucho más rápido.

Fundamento

Por tanto las nuevas plataformas se distinguen por su capacidad de secuenciar

millones de fragmentos de ADN de forma paralela a un precio mucho más barato por

base. Además la secuenciación masiva tiene el potencial de detectar todos los tipos de

variación genómica en un único experimento, incluyendo variantes de nucleótido único

o mutaciones puntuales, pequeñas inserciones y deleciones, y también variantes

estructurales tanto equilibradas (inversiones y traslocaciones) como desequilibradas

(deleciones o duplicaciones).

Todas las técnicas tienen en común la fragmentación del DNA, y sus principal

diferencia es el tipo de PCR utilizada. Los procedimientos de secuenciación de nueva

generación más importantes son:

Método de 454 Life Sciences-Roche (pirosecuenciación): Fue el primer método de

secuenciación de nueva generación. La amplificación se realiza mediante PCR de

emulsión utilizando microesferas. Los productos de la secuenciación se analizan según

la intensidad de señal luminosa obtenida.

Método Solexa de Illumina: La amplificación se realiza mediante PCR de puente.

Para la secuenciación se utilizan cuatro nucleótidos con terminadores reversibles y

cada ciclo tiene lugar con los cuatro nucleótidos simultáneamente.

Procedimiento

El procedimiento de pirosecuenciación fue descrito anteriormente, por lo que se

explicará el método de Solexa de IIIumina, el cual se divide en cuatro etapas.

1 Fase: Preparación de la genoteca: son muestras de fragmentos aleatorios de DNA o

de cDNA, seguidos de adaptadores (linkers) 5’ y 3’. Al mismo tiempo, el marcaje

combina reacciones de fragmentación y unión en un solo paso que aumenta la

eficiencia del proceso de preparación de la genoteca. Después, los fragmentos unidos

con los adaptadores son amplificados y purificados.

2 Fase Generación de cluster: Los moldes para la secuenciación son inmovilizados

en una superficie de celdillas que presenta el DNA accesible para las enzimas mientras

asegura una alta estabilidad de los moldes ligados a una superficie y uniones no

específicas de nucleótidos etiquetados con fluorocromos. Cada fragmento es

amplificado y la amplificación en fase sólida crea hasta 1.000 copias idénticas de cada

molde de moléculas. La amplificación se realiza por PCR de puente (los fragmentos se

amplifican a partir de unos cebadores unidos a una superficie sólida).

3 Fase Secuenciación por síntesis (SBS): se secuencian cadenas molde de DNA

por ciclos repetidos en los que se va añadiendo cada base de forma individual. La

tecnología SBS de Illumina utiliza cuatro terminadores reversibles, cada uno marcado

con un fluoróforo diferente, de forma que se detecta cada base cuando son

incorporadas a las cadenas moldes de DNA. Los cuatro terminadores reversibles se

encuentran ligados a los nucleótidos y bloquean la polimerización, por lo que la enzima

polimerasa solo puede añadir una base a cada cadena de DNA que se está

sintetizando. Al añadirse los nucleótidos simultáneamente y no secuencialmente, se

produce una competencia - 10 - natural por lo que se minimizan los errores de

incorporación.

4 Fase Análisis de los datos: El enfoque de la secuenciación Illumina se basa en la

lectura simultánea de grandes cantidades de secuencias. El muestreo en profundidad y

una cobertura uniforme asegura una alta precisión en la determinación de diferencias

genéticas. Cada lectura de base tiene una puntuación asignada según la calidad por lo

que el software de Illumina puede hacer diferencias y generar puntuaciones seguras.

 Aplicación

Se suele asociar con secuenciación de genomas humanos, pero también puede ser útil

para la secuenciación de genomas microbianos. La metodología actual se basa

principalmente en la secuenciación “shotgun” de Illumina (secuenciación de fragmentos

aleatorios) y una variedad de métodos para ensamblar las lecturas en un genoma (no

es un verdadero genoma completo, pero cubre casi todo el genoma).

CLONACIÓN

Gracias a la especificidad del reconocimiento de las secuencias que pueden ser

cortadas por las enzimas de restricción ha sido posible la identificación, el aislamiento y

la clonación de fragmentos de ADN provenientes de diferentes organismos, para

producir moléculas de ADN recombinante. El termino clonación, indica el acto de

producir muchas copias idénticas de una molécula de ADN, y antes del advenimiento

de la técnica de PCR era la manera usual de multiplicar una secuencia específica. En

la actualidad, la clonación se emplea para la producción de moléculas recombinantes y

para determinar sus funciones en el organismo.

La clonación de ADN, o clonación molecular, es la introducción de un fragmento

de ADN denominado inserto dentro de una molécula de ADN denominada vector, que

puede replicarse de manera autónoma e independiente del genoma de la célula

hospedera. El resultado es la obtención de millones de copias de una molécula

recombinante o clona molecular compuesta por ADN proveniente del inserto y del

vector.
 Vectores de clonación

Es una molécula de ADN de doble cadena (DNAds), con capacidad de albergar

un fragmento de ADN exógeno, estos vectores se dividen en dos, vectores de

clonación y de expresión se clasifican de acuerdo a su uso:

Vectores de clonación Vectores de expresión

Su uso es el almacenamiento de Son los encargados de producir un

secuencias y la obtención de grandes transcrito (ARN) o la proteína

cantidades del ADN insertado o de la producto de ese transcrito. Los

molécula recombinante. vectores de expresión pueden ser

plásmidos o fagos

Fig 8. Vectores de clonación y expresión.

Elementos que forman un vector de clonación

Los vectores de clonación poseen, como parte de su estructura, elementos básicos

comunes:
a) Origen de replicación: es una secuencia en el ADN del vector que provee un sitio

único de reconocimiento a las proteínas que identifican el sitio de inicio de la replicación

(ORI). Los plásmidos se caracterizan por tener un solo sitio ORI en su genoma y

realizar una replicación unidireccional.

b) Marcador de selección: Gen que generalmente otorga resistencia a un antibiótico

que genera un fenotipo particular con el cual puede seleccionarse la célula que unió el

vector. Los genes de selección más comunes se encuentran los de resistencia a

ampicilina y kanamicina. Así, cuando el vector se replica dentro de la célula hospedera,

la β-galactosidasa puede expresarse y generar una enzima funcional.

Fig. 9 Marcadores de selección

c) Sitio de clonación múltiple:

Es un fragmento de ADN que tiene una serie de sitios únicos de reconocimiento

para enzimas de restricción, estos son muy cercanos entre ella, tienen amplia gama de
posibilidades de ingresar cualquier fragmento de ADN. Los sitios de restricción más

comunes presentes en el sitio de clonación múltiple en la mayoría de los vectores son

para las enzimas EcoR I, Hind III, BamH I, Xho I y Kpn I .

VECTORES DE CLONACIÓN MÁS USADOS:

 Plásmidos

Son pequeñas moléculas circulares de ADN que se replican y se transmiten con

independencia del cromosoma bacteriano. Hacen parte del material genético móvil de

las bacterias, donde funcionan como medio de transporte de genes a otras bacterias.

Sin embargo, también pueden transmitirse a través de los pili entre las bacterias. La

replicación y transcripción plasmídica depende de la maquinaria enzimática de la célula

huésped. Los plásmidos son manipulados genéticamente en el laboratorio para

preservar sólo las características deseables, eliminar el ADN innecesario y añadir otras

que no poseen de forma natural. Comercialmente existen plásmidos disponibles que

ofrecen una amplia variedad de posibilidades en cuanto a las enzimas de restricción

que se utilizan a emplear para la clonación, la longitud del producto que se va a insertar

y los marcadores de selección de las clonas transformadas.

 Bacteriófagos

Son virus que infectan bacterias y se comportan como parásitos intracelulares

obligados que se replican haciendo uso de la maquinaria biosintética de las bacterias.

Para convertirlo en un vector, el bacteriófago silvestre debe ser modificado

genéticamente. Dichas modificaciones consisten en adicionar sitios de restricción

específicos y eliminar aquellos genes que no se necesitan para la replicación, esto

permite la adicion de fragmentos de ADN de mayor longitud que los plásmidos. El

bacteriófaga lambda es el fago más utilizado como vector de clonación, y su genoma

consiste de una molécula lineal de aproximadamente 45000 pb, sus extremos son 12

nucleótidos, que poseen secuencias complementarias entre sí, denominados sitios cos,

que utiliza para “circularizar” su genoma a través de la acción de una ligasa de la célula

huésped.

 Cósmidos

Los cósmidos son vectores híbridos del ADN de un plásmido (proporciona la

resistencia a los antibióticos) y los sitios cos del bacteriófago (le permiten empaquetar

el ADN) que acepta insertos de hasta 45kb. Los cósmidos derivados del fago P1

pueden admitir 85 kb de ADN exógeno. Además, contienen los genes de selección y un

sitio ORI del plásmido, por lo que se replican de manera independiente del genoma

bacteriano, como lo hacen los plásmidos.

 Cromosomas artificiales

Es un vector de clonación útil para estudios de mapeo de cromosomas, debido a su

capacidad de almacenar fragmentos de ADN de gran tamaño, su replicación es

independiente dentro de una bacteria o levadura. Los fragmentos de ADN que se

quiere clonar se insertan en cromosomas artificiales de bacterias (BAC) o levadura

(YAC).
 El cromosoma artificial de bacterias (BAC) se deriva del plásmido F, el cual regula la

distribución equitativa de plásmidos después de la división bacteriana, este cromosoma

acepta inserto de 150 a 350 kb, pero se ha podido clonar fragmentos de hasta 700 kb,

por otro lado los cromosomas artificiales YAC aceptan insertos de 100 a 1000kb, estos

contienen telomeros, Origen de replicación, un centrómero y un marcador de selección

para su identificación.

Los YAC son cromosomas artificiales que contienen telómeros, origen de

replicación, un centrómero de levadura y un marcador de selección para la

identificación en las células que los contengan. Su capacidad de clonación es de 100 a

1000 kb. Fragmentos de ADN de mayor tamaño (cientos de kilobases) pueden clonarse

en cromosomas artificiales de bacterias (BAC) o levadura (YAC), que se replican como

un cromosoma independiente dentro de bacterias o levaduras, respectivamente.

Estos vectores son útiles para estudios de mapeo de cromosomas, por su

capacidad para guardar fragmentos de gran tamaño. Un BAC es un constructo

derivado del plásmido F, capaz de regular la distribución equitativa de plásmidos

después de la división bacteriana. Usualmente, acepta insertos de 150 a 350 Kb, pero

se han clonado segmentos de hasta 700 kb. Un sistema similar denominado PAC,

derivado del plásmido bacterial P1, tiene capacidad de insertar hasta 300 kb.

Vectores de clonación utilizados

Tipo de vector Método de inducción Tamaño del inserto

que se puede clonar

Plásmidos Transformación química o por 15000 pb

 electroporación. Las células se

vuelven competentes para

incorporar el plásmido

recombinante.

Bacteriófagos λ Infección con fagos. Después del 23000 pb

empaquetamiento in vitro del

factor recombinante en partículas

del fago.

Cósmidos y cromosomas Dependiendo del tamaño del 45000 pb

artificiales inserto de ADN se puede utilizar

cualquiera de los métodos

anteriores. Fragmentos largos

necesitan empaquetamiento en

fagos I.

Cuadro 1. Características de los vectores de clonación

Fig 10. Estrategia general de clonación
Fig 11. Estrategia general de clonación

Vectores de expresión

Los vectores de expresión se usan con dos fines: 1. Generar el ARN resultante

de la transcripción o 2. Producir la proteína codiciada en la secuencia génica que

portan. Los vectores de expresión son plásmidos o bacteriófagos componentes de los

vectores de expresión, en su estructura los vectores de expresión poseen elementos

básicos presentes en los vectores de clonación, además de contar en su secuencia con

por lo menos un promotor fuerte. También deben incluir secuencias de terminación de

la transcripción y adición de cola de poliadelinación, pues con ello el transcrito estará

protegido de la degradación de nucleasas, con lo que su vida media se extenderá. Otro

factor presente en un vector de expresión es el sitio de unión al ribosoma, que es la

secuencia Shine-Dalgarno que precede el codón de inicio AUG de la traducción en los

ARNm procariontes. También debe considerarse que la presencia de promotores

fuertes en plásmidos con un alto número de copias origina interferencias en la

viabilidad celular.

Clonación molecular

Generalmente, la célula hospedera del vector es una bacteria (E. coli), también

puede ser una célula eucariota. La introducción de un vector a una célula eucariota se

denomina transfección y si el vector es un virus, transducción.

La introducción del ADN recombinante tiene como propósito la transformación

celular, esto quiere decir, que el material genético se incorpora de manera

extracromosómica y se replique, transcriba y traduzca empleando la maquinaria

enzimática de la célula huésped.

1. Preparación del inserto de ADN que se va a clonar.

Involucra la digestión con enzimas de restricción para liberar el fragmento de

interés de la molécula de ADN completa. Para facilitar la clonación se recomienda el

uso de enzimas de restricción cuyos sitios de corte estén presentes en el sitio de

clonación múltiple del vector, con lo que se evita la necesidad de una posible

modificación posrestricción del inserto. De igual manera , el inserto deberá cortarse con

la misma enzima o con unas que dejen los mismos extremos, de manera tal que la

complementariedad de los extremos generados en el inserto coincida con los extremos

del vector . El inserto, producto de la digestión enzimática, se purifica y separa de la

molécula de ADN de donde proviene, mediante una electroforesis en gel de agarosa .

2. Preparación del vector para clonación. Consiste en:

a) Se realiza un corte con la(s) misma(s) enzima(s) de restricción con que se digirió el

inserto y obtener un ADN lineal. La estrategia de clonación debe diseñarse para que el

corte genere extremos con secuencias complementarias a los extremos del inserto a

clonar.

b) Desfosforilación del vector con la finalidad de impedir la autoligación del vector. Se

realiza usando la fosfatasa alcalina bovina de origen intestinal (CIP) o la fosfatasa

bacteriana (BAP) que elimina los grupos fosfato 5’ de una cadena de ADN.

c) Purificación del vector, consiste en eliminar las partículas de agarosa, los restos de

enzimas inactivadas y las sales provenientes de la reacción de digestión. Esto permite

una elución de la muestra en volúmenes pequeños de agua o buffer con baja

concentración de sales. También existe la posibilidad de purificar por la técnica

fenol:cloroformo modificada, para obtener ADN plasmídico ; sin embargo, presenta el

inconveniente de que para su realización consume mucho tiempo y que en general se

obtiene un ADN plasmídico de menor calidad .

3. Ligación del inserto con el vector, es la ligación de un segmento de ADN exógeno a

un vector involucra la formación de enlaces fosfodiéster entre los residuos fosfato que

se localizan en los extremos 5’ de la cadena de ADN y los residuos hidroxilo 3’. Esta

unión la cataliza in vitro una enzima denominada ligasa. Las más utilizadas son la

ligasa de E. coli y la T4 ligasa de bacteriófagos. Para la reacción de ligación existen

diferentes protocolos, que dependen del tipo de extremos generados por las enzimas

de restricción.

4. Para su replicación, los vectores requieren encontrarse dentro de una célula, que

debe prepararse para hacerla permeable a la entrada del vector recombinante, proceso

denominado generación de células competentes. Uno de los métodos de competencia

más utilizados consiste en tratar las bacterias con una solución de CaCl2. Sin embargo,

una explicación sostiene que la membrana bacteriana es permeable a los iones cloro,

mas no a los iones calcio, de manera que los iones Ca++ se rodean de moléculas de

agua para entrar a la célula, lo que provoca que la célula se abulte, lo que facilita la

formación de poros y la entrada del ADN. Este procedimiento se prefiere para células

que se van a transformar usando precipitados de ClCa2.

Para lograr el estado de competencia por cualquiera de las técnicas se requiere

que las células se encuentren en la fase logarítmica de crecimiento (OD entre 0.5 y

0.7), que corresponde a una densidad celular de 5 × 107 cel/ ml). Otro método para

conferir competencia a las bacterias es someterlas a lavados consecutivos por 4-5

veces con una solución de glicerol a 10%, para obtener células libres de iones y

proteger a la membrana celular del daño que ocasionará la electroporación por la cual

se transformarán. Con independencia del procedimiento empleado para inducir el

estado de competencia, las células pueden almacenarse de forma indefinida sin perder

su competencia en una solución acuosa con glicerol a 10%, para impedir que al

descongelarse se lisen.
5. Transformación en bacterias. La transformación bacteriana consiste en la adquisición

de ADN exógeno, que le confiere un nuevo fenotipo a la célula huésped. Entre los

métodos más comunes se encuentran la transformación química y la transformación

por electroporación. Cabe resaltar que el termino transformación se refiere a la

introducción de material genético a través de vectores a las bacterias; el término

transducción describe la introducción del ácido nucleico exógeno en una célula por

medio de un vector viral, y el término transfección implica la introducción del material

genético en las células empleando agentes químicos o físicos.

a) Transformación química: esta técnica está basada en estudios realizados por

Mandel e Higa en 1970, en los que observaron que la incorporación de ADN del fago λ

por células bacterianas se incrementaba sustancialmente en presencia de cloruro de

calcio. En este procedimiento las células y el ADN plasmídico se incuban en una

solución hipotónica de CaCl2, que forma un complejo con el ADN que facilita su

entrada por endocitosis a una célula competente; además, se aplica un breve choque

térmico a 42ºC por 90 segundos que incrementa la permeabilidad de la membrana

celular. Es un método sencillo y proporciona una buena efi ciencia de transformación

para muchos de los procedimientos de rutina, aunque puede incrementarse utilizando

otros cationes divalentes, como el rubidio y el manganeso.

b) Transformación por electroporación: consiste en la aplicación de breves pulsos

eléctricos de alto voltaje a las células receptoras, para formar poros en la membrana

plasmática en células eucariotas y/o la pared celular en bacterias. Los componentes de

la membrana se desestabilizan, lo que permite la entrada del vector al citoplasma de la

célula. Por otro lado, este método es la mejor opción para plásmidos grandes de hasta
50 kb. La electroporación no es exclusiva de las bacterias, ya que puede utilizarse en

células eucariotas.

6. Identificación de las colonias que contienen el vector recombinante. Para identificar

las bacterias transformadas se utilizan marcadores de selección proporcionados por los

vectores. Los más utilizados son los genes de resistencia a antibióticos, como la

ampicilina, la tetraciclina, el cloranfenicol y la kanamicina. Después de la

transformación, las bacterias se siembran en cajas petri con agar suplementado con el

antibiótico, para el cual el plásmido es resistente. Si la transformación ha sido exitosa

las bacterias serán capaces de metabolizar el antibiótico y vivirán, lo que indicará que

incorporaron el vector; cada colonia representa un solo evento de transformación. Otros

marcadores de selección se basan en la producción de moléculas fluorescentes o bien

en la producción de enzimas que, al reaccionar con un sustrato, producen coloración

en la colonia de células transformadas.

Aplicaciones de la clonación molecular

La clonación génica tiene múltiples aplicaciones y ha sido el principal impulsor

de la biotecnología y la metodología del ADN recombinante. Este proceso puede

emplearse para la producción de proteínas eucariotas en bacterias (proteínas

recombinantes), como hormonas, antibióticos, vacunas, generación de cultivos

transgénicos resistentes a plagas o sequías, producción de animales transgénicos

capaces de producir en su leche proteínas recombinantes, así como para el

establecimiento de librerías genómicas o genotecas, que han permitido secuenciar por

completo el genoma humano y el de otros organismos.

 Genotecas

Una biblioteca genómica o genoteca es una colección de fragmentos de ADN,

provenientes del genoma de un organismo, clonados en vectores para facilitar su

estudio. Se pueden construir genotecas de ADN o de ADN

Genotecas de ADNc

Los bancos de ADNc se construyen a partir de secuencias de ARNm mediante

una reacción in vitro que sintetiza una primera cadena de ADNc utilizando una ADN

polimerasa con actividad de transcriptasa inversa. El ARNm que no se copia a ADNc se

elimina con la adición de la enzima ARNasa H. La segunda cadena de ADNc,

complementaria a la obtenida de la retrotranscripción, se sintetiza en una reacción de

PCR o empleando una DNAc polimerasa que utilice la cadena sencilla del ADNc como

templado. Posteriormente, este ADNc de doble cadena se clona en un vector.

Genotecas de ADNg

Para construir bancos de ADN es necesario aislar el ADNg del organismo de

interés. Este ADNg se corta con enzimas de restricción para generar fragmentos con

extremos complementarios a los del vector de clonación. Una vez que se ha construido

la genoteca, se rastrea el clon o clones que portan el ADN con el gen de interés. En la

actualidad, gracias a los adelantos de la metodología del ADN recombinante, es posible

separar regiones determinadas de ADN, secuenciarlas, alterar la secuencia e introducir

ese ADN exógeno a las células de un organismo, y aun a células germinales, para la

producción de organismos transgénicos .

 Producción de proteínas recombinantes

La clonación molecular ha permitido determinar la función de múltiples proteínas

y generar proteínas recombinantes, que han reducido los costos de producción de

hormonas o proteínas requeridas en la terapéutica, de las cuales previamente sólo se

disponía de pequeñas cantidades por la escasez de fuentes, y la dificultad en su

aislamiento o purificación. La facilidad en la producción de las proteínas recombinantes

ha revolucionado el área biotecnológica, que ahora es un mercado dominante en el

mundo de la biología molecular y cubre más de 10% de toda la industria

farmacéutica. Las proteínas recombinantes se producen en

bacterias ,levaduras , células de insecto y células de mamífero . Para maximizar la

expresión de las proteínas se emplean promotores fuertes que aseguren la expresión

por arriba de 10% del total de las proteínas celulares, aunque esto impone una carga

metabólica a las células bajando la velocidad de su crecimiento, por lo que ciertas

proteínas recombinantes pueden resultar tóxicas para las células que las producen.

La clonación molecular ha incrementado las perspectivas iniciales de la

metodología del ADN recombinante y, de cierta manera, sentó las bases para la

clonación de organismos e impulsó el desarrollo de la biotecnología, que ha tomado un

papel protagónico en las ciencias de la salud.

 APLICACIONES (ARTÍCULO)

Evaluación de la eficiencia y la utilidad de métodos de clonación de ADN sin

enzimas recombinantes sin enzimas

El objetivo de este artículo es visibilizar los recientes métodos de clonación de

ADN sin enzimas recombinantes, sencillos, de bajo costo y sin enzimas. La

investigación transcurre bajo la clonación de Escherichia coli in vivo que puede

transformar directamente una mezcla de fragmentos de ADN de inserto y vector en

E. coli, los cuales se ligan por actividad de recombinación homóloga endógena en las

células. La clonación del extracto de clonación sin ligación utiliza la actividad de

recombinación endógena de extractos celulares de E.coli in vitro para ligar fragmentos

de ADN de inserto y vector.

Introducción

Los métodos de clonación de ADN transparente son útiles para la ingeniería de

plásmidos porque los fragmentos de ADN se pueden ligar en una forma independiente

de sitio de enzima de restricción. En la última década, se han desarrollado varios

métodos de clonación de ADN transparente dependiente de enzima purificada. Los

métodos de clonación sin interrupción generalmente se basan en regiones de

homología de extremo corto para la ligación de fragmentos de ADN de inserto y

vector. Recientemente, se han descrito varios métodos de clonación de ADN sin

enzimas simples y recombinantes sin enzimas, que utilizan la actividad de

recombinación endógena homóloga de las cepas de laboratorio de Escherichia coli.

 Recientemente se informó que varios fragmentos de ADN se pueden incorporar

simultáneamente en un vector lineal común utilizando el método iVEC con E. coli DH5

α . Más recientemente, el Proyecto Nacional de BioResource ha caracterizado y

distribuido una cepa específica de E. coli, AQ3625 , para un iVEC eficiente .

Los fragmentos amplificados por PCR con regiones de homología de extremo

cortas se pueden ligar de manera eficaz en un vector in vitro utilizando la clonación de

SLiCE con extractos celulares de diversas cepas de laboratorio de E. coli incluyendo

JM109, DH5α, DH10B y XL10-Gold . SLiCE preparado a partir de E. coli JM109 se

puede utilizar en lugar de un kit comercial. Sin embargo, la eficiencia y la precisión de

estos métodos de clonación de ADN sin fisuras no se han comparado directamente

hasta la fecha.

Materiales y métodos

Se prepararon células de E. coli químicamente competentes usando el método

de solución de transformación y almacenamiento modificada. Para comparar la

competencia de las células químicamente competentes entre DH5α y AQ3625, el

método de Inoue y el método de cloruro de calcio también se utilizaron.

Brevemente, las células de E. coli JM109 pre-cultivadas en medio LB Miller a 37ºC se

transfirieron a medio 2xYT en un matraz de agitación Sakaguchi de cuello redondo y

largo de 100 ml. La mezcla de células resuspendida se dejó reposar durante 10 min a

temperatura ambiente para permitir que la reacción de lisis continuara.

Los sobrenadantes se transfirieron cuidadosamente a microtubos de 1,5 ml para

eliminar los materiales insolubles, y se añadió un volumen igual de glicerol al 80%

enfriado con hielo y se mezcló suavemente. Las condiciones de reacción que incluyen

las cantidades de fragmentos de ADN de inserto y vector se describen en detalle en las

leyendas de figuras y tablas. Las cantidades de fragmentos de ADN de inserto y vector

en la mezcla se describen en detalle en las leyendas de figuras y tablas.

Resultados y discusión

El método iVEC utilizando E. coli DH5α y la eficacia de clonación. Estos dos

índices son importantes para evaluar los métodos de clonación en general . Este

resultado es consistente con la conclusión de que las regiones de homología de

extremo más largo son óptimas para el método iVEC-DH5α . Los métodos de clonación

de ADN sin fisuras también pueden ligar con éxito fragmentos amplificados por PCR no

purificados en vectores debido a su alta eficacia de clonación.

Recientemente, ha sido posible omitir la purificación de ADN mediante

electroforesis en gel de agarosa porque las ADN polimerasas termoestables de alta

fidelidad pueden amplificar específicamente los fragmentos de ADN diana sin la

amplificación de fragmentos de ADN no específicos. Como resultado, no se esperaba

la formación de colonias con el método iVEC-DH5α utilizando fragmentos de PCR no

purificados debido a la tasa de formación de colonias de 1 / 10-1 / 100 para la clonación

sin fisuras de fragmentos de PCR no purificados . Por lo tanto, se usó E. coli AQ3625

como cepa huésped para ligar fragmentos de PCR no purificados con el método de

iVEC . El proyecto National BioResource comenzó a distribuir una cepa específica

AQ3625 de E. coli para un iVEC eficiente en abril de 2016 .

Como otra posible explicación, el tampón de lisis celular podría extraer

específicamente la actividad de recombinación homóloga requerida para la clonación

sin interrupción, pero no la actividad nucleasa en células de E. coli. Para el

propósito, se usaron células competentes preparadas por el método TSS modificado

porque estas células competentes de las cepas DH5α y AQ3625 tienen una

competencia similar . En todos los casos, las células AQ3625 fueron menos

competentes que las células DH5α correspondientes , lo que podría deberse a la menor

competencia de las cepas RecA + incluyendo E. coli AQ3625 y BL21 . La preparación

de células competentes AQ3625 podría requerir un método específico.

Conclusión

Además, el método SLiCE tenía una mayor eficacia de clonación y precisión

de clonación que iVEC-AQ3625, incluso cuando se usaron células DH5α y AQ3625

. En trabajos futuros, la eficiencia de clonación de las células AQ3625 y la competencia

de las células en la cepa AQ3625 deberían mejorarse aún más.

 REFERENCIAS

1. Armendáriz Borunda J, Sandoval Rodríguez A, Armenda#x81;riz Borunda J.

Biología molecular [recurso electrónico]. 1st ed. México: Mcgraw-Hill

Interamericana Editores, S.A. de C.V.; 2013.

2. ELVESIER. (2012). Tecnologías de secuenciación de nueva generación en

diagnóstico genético pre- y postnatal. [online] Available at:

http://www.elsevier.es/es-revista-diagnostico-prenatal-327-articulo-

tecnologias-secuenciacion-nueva-generacion-diagnostico-

S2173412712000273 [Accessed 21 Apr. 2018].

3. CATARINA. (n.d.). SECUENCIACIÓN DEL ADN. [online] Available at:

http://www.ehu.eus/biofisica/juanma/bioinf/pdf/tema_2a.pdf [Accessed 20

Apr. 2018].

4. CONOGASI. (2017). Secuenciación de alto rendimiento (Pirosecuenciación e

Illumina). [online] Available at: http://conogasi.org/articulos/secuenciacion-de-

alto-rendimiento-pirosecuenciacion-e-illumina/ [Accessed 20 Apr. 2018].

5. Khan academy. (2017). Secuenciación de ADN. [online] Available at:

https://es.khanacademy.org/science/biology/biotech-dna-technology/dna-

sequencing-pcr-electrophoresis/a/dna-sequencing [Accessed 20 Apr. 2018].

6. CSIC. (n.d.). Estudio del ADN. [online] Available at:

http://www2.iib.uam.es/seq/tecnicas/biomed1.htm#metodos [Accessed 20

Apr. 2018].
7. 2. BIOLOGIA MOLECULAR FUNDAMENTOS Y APLICACIONES EN LAS

CIENCIAS DE LA SALUD B. fig 8. Mexico: pag 128; 2018.

8. 3. BIOLOGIA MOLECULAR FUNDAMENTOS Y APLICACIONES EN LAS

CIENCIAS DE LA SALUD B. fig 9. Mexico: pag 128; 2018.

9. 4. BIOLOGIA MOLECULAR FUNDAMENTOS Y APLICACIONES EN LAS

CIENCIAS DE LA SALUD B. fig 10. Mexico: pag 132; 2018.

10. 5. BIOLOGIA MOLECULAR FUNDAMENTOS Y APLICACIONES EN LAS

CIENCIAS DE LA SALUD B. fig 11. Mexico: pag 133; 2018

11. 6. BIOLOGIA MOLECULAR FUNDAMENTOS Y APLICACIONES EN LAS

CIENCIAS DE LA SALUD B. cuadro 1. Mexico: pag 129; 2018.

12. Ac.els-cdn.com. (2017). Evaluation of the efficiency and utility of recombinant

enzyme-free seamless DNA cloning methods. [online] Available at:

https://ac.els-cdn.com/S240558081730033X/1-s2.0-S240558081730033X-

main.pdf?_tid=e784cc6d-3b43-4ae2-942d-

f14e6d445a95&acdnat=1524573738_fc7071fa160b010738dec635c1f62ce8

[Accessed 23 Apr. 2018].