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Proyecto I
Los carotenoides son componentes poliénicos que están formados por 8-10 unidades de
isopreno para obtener compuestos de 40 a 50 carbonos, posee dobles enlaces que forman los
grupo cromóforo con una absorción de 400 a 500 nm dando el color amarillo y rojo,
generalmente se encuentran en la forma trans, su formación se da gracias a la ruta del
mevalonato, donde el ácido mevalónico resulta ser el precursor de los carotenoides; está
presente en hongos, bacterias, algas,plantas, en peces, algunos pájaros y también en los
invertebrados, se consideran pigmentos naturales y accesorios porque permiten la captación
de la luz y protegen a los organismos de la foto-oxidación (Villa, et.al; 2002).
4. Justificación
Los carotenoides son muy utilizados para diferentes industrias como la acuicultura, ya que
sirven de alimento dentro del balanceado para especies como salmón, trucha, cultivos de
camarón, etc.; la ornitología, es esencial en el alimento de las gallinas ya que este permite el
color de la yema de los huevos; y en la industria farmaceútica es altamente utilizado como
antioxidante, anticancerígeno, foto protector en diferentes insumos médicos como pastillas y
jarabes (Ramírez, 2013). Debido a la gran demanda que presente ese metabolito secundario
en el mercado y a la baja producción, se aplicarán diferentes métodos de extracción de
astaxantina a partir de H.pluvialis.
5. Pregunta de Investigación
¿Qué método de extracción propuesto es el mejor para extraer astaxantina en la fase de
aplanospora?
6. Hipótesis
De acuerdo con la literatura consultada se espera extraer astaxantina aplicando tres métodos
diferentes para luego realizar una medición cualitativa mediante espectrofotometría y
visualizar el pico en la longitud de onda esperada.
7. Diseño Experimental
Para la extracción de astaxantina se aplicarán tres procesos los cuales varían en la
metodología de ruptura de la pared celular del alga. Los ensayos se plantearon de la siguiente
manera (Tabla 1). Los ensayos se realizarán por duplicado.
Tabla 1.- Ensayos extracción de astaxantina
8. Metodología
La extracción de la astaxantina se hará en el Laboratorio de Ingeniería Ambiental siguiendo
los tres métodos de acuerdo a la bibliografía consultada y en base a la Tabla 1.
● Microalga
Se utilizará un inóculo de microalgas de Haematococcus pluvialis en fase exponencial de
crecimiento suministrada por la empresa Andes Spirulina (Anexo 1), este inóculo ya se
encuentra en fase de aplanospora, es decir etapa en la que el alga ya ha producido el
carotenoide. Antes de realizar con los ensayos, la muestra de microalgas fue filtrada con la
ayuda de un papel filtro para reducir las impurezas presentes en la muestra.
● Evaluación estado de crecimiento
El estado de crecimiento se visualizará con la ayuda de un microscopio, donde se tomará una
pequeña proporción de la muestra otorgada y se verificará que el alga se encuentre en estado
de aplanospora para empezar con los ensayos de extracción.
● Preparación de ensayos
Cada bioensayo se preparará en un tubo eppendorf grande de 10 mL donde se seguirán las
condiciones establecidas en la tabla 1. Para cumplir con los objetivos del estudio y obtener
una mayor cantidad de microalgas se realizarán un total de 8 ensayos, es decir por duplicado.
● Extracción de astaxantina
Método 1: La extracción de astaxantina se realizará utilizando un solvente (metanol) y
analizando las muestras en un espectrofotómetro. Se tomará una muestra del ensayo y se
centrifugará a 7000 rpm, se retirará el sobrenadante con una pipeta y se añadirá al precipitado
1ml de metanol y 0,4 g de sílica gel. El rompimiento celular se realizará mediante la agitación
celular de las muestras en un Vortex a 2000 rpm durante 10 minutos. Las muestras serán
centrifugadas a 7000 rpm durante 5 minutos, eliminando el sobrenadante y se repetirá el
procedimiento hasta que no se observe el color rojo en la muestra. Se determinará la
absorbancia a 477 nm manteniendo las muestras completamente en la oscuridad (Ramírez,
2013).
Método 2: Se toma una parte de la muestra (1 mL), se realizará una filtración para eliminar el
excedente de agua, una vez que la biomasa esté libre de líquido se añadirá éter de petróleo, Se
centrifugó, el sobrenadante será recuperado usando un rotavapor de cual saldrá el extracto
deseado. Debe tenerse precauciones con la exposición a las altas temperaturas y oxígeno, ya
que el cultivo puede degradarse (Córdoba, et.al; 2015).
9. Resultados
Los resultados se obtuvieron mediante la medición del sobrenadante medido por un
espectrofotómetro y un programa que permite visualizar el pico en la longitud de onda
deseado. Previo a la ruptura celular se observó las células de Haematococcus pluvialis en un
microscopio. Las curvas obtenidas por el espectrofotómetro se indican a continuación.
Figura 4.- Espectro de medición de astaxantina por el método 1 (metanol + sílica gel)
12. Anexos
Anexo 1.- Microalga Haematococcus pluvialis obsequiada por Andes Spirulina
Hagen, C., Siegmund, S., y Braune, W. (2002). Ultrastructural and chemical changes in the
cell wall of Haematococcus pluvialis (Volvocales, Chlorophyta) during aplanospore
formation. European Journal of Phycology.
Harker, M., Tsavalos, A. J., y Young, A. J. (1996). Factors responsible for astaxanthin
formation in the chlorophyte Haematococcus pluvialis. Bioresource Technology.
Henriques, M., Silva, A., & Rocha, J. (2007). Extraction and quantification of pigments from
a marine microalga: a simple and reproducible method. Coimbra: Formatex.
Lababpour, A., Shimahara, K., Hada, K., Kyoui, Y., Katsuda, T., & Katoh, S. (2005). Fed-
Batch Culture under Illumination with Blue Light Emitting Diodes (LEDs) for
Astaxanthin Production by Haematococcus pluvialis. Journal of bioscience and
bioengineering.
Leonardi, R., Niizawa, I., y Irazoqui, H. (2015). Estudio de la producción de astaxantina a
partir de cultivo de microalgas de Haematococcus pluvialis. Instituto de Desarrollo
Tecnológico para la Industria Química