211297- BIOLOGIA, BIOLOGÍA MARINA

Capitulo 3
Espectroscopía de
Absorción Molecular

Dra. Claudia Mardones Peña

 Temario
• Propiedades de las Radiaciones Electromagnéticas
• Espectro de Radiaciones Electromagnéticas (REM)
• Absorción de Radiación
• Ley de Lambert –Beer (LLB)
• Validez de LLB
• Instrumentación
• Error fotométrico
• Tipos de absorciómetros
• Aplicaciones cualitativas y cuantitativas
• Otras consideraciones
 INTRODUCCIÓN A LOS MÉTODOS ESPECTROMÉTRICOS

• Los métodos espectrométricos se basan en la espectroscopía atómica y

molecular.
• Espectroscopía es la Ciencia que trata las interacciones de la radiación con
la materia (radiaciones electromagneticas, ondas acústicas y haces de
partículas como iones y electrones).
• Para ello se mide intensidad de la radiación o sus cambios con sistemas
fotoeléctricos u otro dispositivo electrónico (transforman radiación en
electricidad).
• Dentro de los métodos espectrométricos podemos mencionar:

ESPECTROSCOPÍA MOLECULAR:
ESPECTROSCOPÍA ATÓMICA: -Espectrometría de absorción molecular
-Espectrometría de absorción en el UV-VIS
atómica -Espectrometría molecular por
-Espectrometría de fluorescencia luminiscencia
atómica -Espectrometría Infrarroja
-Espectrometría de emisión atómica -Espectroscopía Raman
-Espectrometría de masas atómica -Espectroscopía de Resonancia
-Espectroscopía atómica de rayos X Magnética Nuclear
-Espectrometría de masas molecular
 INTRODUCCIÓN A LOS MÉTODOS ESPECTROMÉTRICOS

• Los métodos espectrométricos se basan en la espectroscopía atómica y

molecular.
• Espectroscopía es la Ciencia que trata con las interacciones de varios tipos de
radiación con la materia (radiaciones electromagneticas, ondas acústicas y
haces de partículas como iones y electrones).
• Para ello se mide intensidad de la radiación o sus cambios con sistemas
fotoeléctricos u otro dispositivo electrónico (transforman radiación en
electricidad).
• Dentro de los métodos espectrométricos podemos mencionar:

ESPECTROSCOPÍA MOLECULAR:
ESPECTROSCOPÍA ATÓMICA: -Espectrometría de absorción
-Espectrometría de absorción molecular en el UV-VIS
atómica -Espectrometría molecular por
-Espectrometría de fluorescencia luminiscencia
atómica -Espectrometría Infrarroja
-Espectrometría de emisión atómica -Espectroscopía Raman
-Espectrometría de masas atómica -Espectroscopía de Resonancia
-Espectroscopía atómica de rayos X Magnética Nuclear
-Espectrometría de masas molecular
MÉTODOS ÓPTICO-QUÍMICOS:
Conjunto de métodos analíticos que aprovechan la
interacción de la luz con los componentes de la
materia, tanto con fines cualitativos como
cuantitativos.

NATURALEZA DE LA RADIACION ELECTROMAGNE-

TICA (REM):
Energía que se propaga por el espacio (o el vacío), no
necesitando un medio de transporte y que puede
adoptar diversas formas (luz, calor, etc.)

SU NATURALEZA PUEDE EXPLICARSE POR DOS

MODELOS:
A) Modelo ondulatorio: l, u, velocidad, amplitud
B) Modelo corpuscular: Fotones
Dra. C. Mardones Depto. A. Instrumental. Fac. Farmacia, U.de Concepción
 NATURALEZA ONDULATORIA DE LA LUZ
REPRESENTACIÓN DE UN HAZ DE RADIACIÓN MONOCROMÁTICO
(POLARIZADO EN EL ESPACIO)

Campo
eléctrico

Campo
magnético
E

H
Dirección de
propagación

Dra. C. Mardones Depto. A. Instrumental. Fac. Farmacia, U.de Concepción

 PARÁMETROS DE ONDA
l : Longitud de onda
Longitud de un ciclo o l
distancia entre dos máximos
o dos mínimos Unidades:
mm = 10-6 m, nm = 10-9 m, A° = 10-10 m

۷ : Frecuencia 1 seg
Número de oscilaciones o
ciclos que pasan por un punto
۷ = 3Hz
en una unidad de tiempo
Unidades:
۷ = c/l Ciclos/seg = Hz = seg-1

donde c = velocidad de la luz ۷ Número de onda

c = 2.99 * 10 8 m/seg Número de ondas por ۷=1/l = ۷/c
c = 299.792 Km/seg centímetro

Amplitud
(relacionada con
intensidad o potencia)
 NATURALEZA CORPUSCULAR DE LA LUZ
Considerando la luz como una partícula de energía (fotón o cuanto de energía)

h: cte de Planck
E=h*۷ E = h * c/l h = 6.625 * 10 -27 erg/seg

Propiedades de la REM que son explicadas por su naturaleza

corpuscular
Absorción: Cuando una REM atraviesa un sólido, líquido o gas, ciertas
frecuencias son eliminadas selectivamente por absorción de la energía, la
cual es transferida a los átomos, iones o moléculas, pasando éstas de un
estado fundamental a uno excitado.

REM REM
INCIDENTE TRANSMITIDA
ESPECTROSCOPÍA DE
ABSORCIÓN ATÓMICA

REM ESPECTROSCOPÍA DE
ABSORCIÓN MOLECULAR
ABSORBIDA
E REM absorbida = E REM transición electrónica
 ESPECTRO DE REM
103 10 10-1 10-3 10-5 10-7 10-9 10-11
l (m)
Virus

Punto Célula Bacteria Proteína Molec.

Estadio Ondas de radio
Tennis Infrarrojo Ultravioleta Rayos X Xagua
Rayos

Visible
Microondas Rayos X Rayos gama

۷
(ciclo/seg) 106 108 1010 1012 1014 1016 1018 1020

E foton
(eV) 10-9 10-7 10-5 10-3 10-1 101 103 105
 ESPECTRO DE REM
103 10 10-1 10-3 10-5 10-7 10-9 10-11
l (m)
Virus

Punto Célula Bacteria Proteína Molec. agua

Estadio Tennis
Casa

Infrarrojo Ultravioleta Rayos X

Ondas de radio

Visible
Microondas Rayos X Rayos gama

۷
(ciclo/seg) 106 108 1010 1012 1014 1016 1018 1020

E foton
(eV) 10-9 10-7 10-5 10-3 10-1 101 103 105
Ultravioleta cercano: 10 – 380 (200 - 380) nm
Visible: 380 - 780 nm
Infrarrojo: 0.78-1000 (2.5-15) um
 ABSORCIÓN DE RADIACIÓN

Sólido
transparente,
REM incidente líquido REM transmitida
o gas

Radiaciones (REM) que no emergen son ABSORBIDAS

REM ABSORBIDA ES TRANSFERIDA a átomos, moléculas o iones

capaces de absorber la radiación, pasando de un estado fundamental a
uno excitado.

Átomos, moléculas y iones presentan un número limitado

de niveles energéticos discretos y cuantizados

Clase 2 Absorciometría Dra. C. Mardones / Dr. D. von Baer, Depto. A. Instrumental. Fac. Farmacia, U.de Concepción
NIVELES DE ENERGÍA DE UNA MOLÉCULA ORGÁNICA FLUORESCENTE

E Electrónica:
Energía electrónica
de la molécula o
átomo

E vibracional:
Energía resultante de
vibraciones de varios
átomos

E rotacional:
Energía resultante de
la rotacion molecular
en torno a su centro
de gravedad

Niveles de
Energía rotacional

Dra. C. Mardones / Dr. D. von Baer, Depto. A. Instrumental. Fac. Farmacia, U.de Concepción
NIVELES ENERGÉTICOS
E ROTACIONAL< E VIBRACIONAL< E ELECTRÓNICA

PARA QUE OCURRA ABSORCIÓN

E FOTON
DE REM
D E = E Foton

ESPECTROSCOPÍA: Es el estudio de las transiciones típicas de una especie

(átomo, ión, molécula), con lo que es posible su caracterización
A
Lo que se obtienes es un
ESPECTROGRAMA

lo۷

Dra. C. Mardones / Dr. D. von Baer, Depto. A. Instrumental. Fac. Farmacia, U.de Concepción
 ESPECTROS ATÓMICOS SON MÁS SENCILLOS
QUE ESPECTROS MOLECULARES
3s 3p

ÁTOMOS

MOLÉCULAS

Absorción molecular
involucra transiciones
• ELECTRÓNICAS
• VIBRACIONALES
• ROTACIONALES

Dra. C. Mardones / Dr. D. von Baer, Depto. A. Instrumental. Fac. Farmacia, U.de Concepción
 ABSORCIÓN MOLECULAR
E = E ELECTRÓNICA + E VIBRACIONAL + E ROTACIONAL

Aumenta E electrónica de la molécula:

E del fotón permite que los electrones pasen de un
nivel electrónico a otro superior. Este cambio va
ABSORCIÓN DE REM DE acompañado de cambios vibracionales y rotacionales.
REGIÓN UV-VIS
(l =200-780 nm) E captada puede disiparse a la forma de calor
(vibraciones, rotaciones) o a la forma de
Fluorescencia.

ABSORCIÓN REM DE Aumenta E vibracional de la molécula:

REGIÓN IR cercana y me- E del fotón permite que las molécula vibren alrededor
dio (l =0.78 – 50 um) de sus enlaces

ABSORCIÓN DE REM DE Aumenta E rotacional de la molécula:

REGIÓN IR lejana y E del fotón permite que las molécula roten en torno a
microondas su eje.
(l = 50 -100 um)

Dra. C. Mardones / Dr. D. von Baer, Depto. A. Instrumental. Fac. Farmacia, U.de Concepción
ESPECTROSCOPÍA: Es el estudio de las transiciones típicas de una especie
(átomo, ión, molécula), con lo que es posible su caracterización
A

Lo que se obtienes es un l max lo۷

ESPECTROGRAMA
%T

e l max lo۷

l max lo۷

Dra. C. Mardones / Dr. D. von Baer, Depto. A. Instrumental. Fac. Farmacia, U.de Concepción
ESPECTROSCOPÍA

ESPECTRO CLOROFILA A Y B
 HEMOGRLOBINA

Absortividad molar cm2/mmol

ESPECTROSCOPÍA
 ANALISIS ESPECTROSCOPICO DE QUERCETINA

Nº SUSTITUYENTES ANILLO “B” GLICÓSIDO vs. AGLICONA

250-265 D = 18 nm
348-358

TRI-SUSTITUIDO Quercetina 3-glicósido

DI-SUBSTITUIDO
Quercetina libre
MONO-SUSTITUIDO

250 275 300 325 350 375 400 425 nm 250 275 300 325 350 375 400 425 nm
 ESPECTROSCOPÍA DE ABSORCIÓN MOLECULAR
LEY DE LAMBERT BEER
La absorción de REM por un medio depende de:
1. l de la radiación (en otras palabras, de su energía)
2. Naturaleza de la especie molecular que absorbe
3. Concentración de la especie molecular que absorbe
4. Camino óptico que debe recorrer la REM a través del medio que absorbe
Pi: Pot. Lum. Incidente
PA (soluto): Pot. Lum. Absorbida
por soluto
P: Potencia que emerge de la
Haz de luz
monocromático
Pi P muestra

PA(soluto)

MUESTRA Pil=PA+P P = POTENCIA LUMINOSA QUE

EMERGE DE LA MUESTRA

BLANCO Pil=PAPo Po = POTENCIA LUMINOSA QUE

EMERGE DEL BLANCO
0 Dra. C. Mardones / Dr. D. von Baer, Depto. A. Instrumental. Fac. Farmacia, U.de Concepción
 MUESTRA BLANCO
Igualando Pil
tenemos: PA+P = P0

Dividiendo ABSORCIÓN + TRANSMISIÓN = 1

por P0: PA/P0 + P/P0 =1
% ABSORCIÓN + % TRANSMISIÓN = 100

Potencia luminosa transmitida por la muestra

TRANSMISIÓN: T =
Potencia luminosa transmitida por el blanco

Potencia luminosa transmitida por la muestra x 100

% TRANSMISIÓN: % T =
Potencia luminosa transmitida por el blanco

Límites de T y %T:
Si P = P0 T=1 %T = 100
Si P = 0 T=0 %T = 0

Dra. C. Mardones / Dr. D. von Baer, Depto. A. Instrumental. Fac. Farmacia, U.de Concepción
 RELACION DE POTENCIA LUMINOSA TRANSMITIDA Y EL ESPESOR OPTICO
Ley de Lambert - Bouger

P0 P P
100 25 12.5
50

b b b b
Si un haz de REM monocromático incide en forma paralela sobre una superficie
absorbente, y si el espesor óptico de dicha sustancia (b) aumenta linealmente, la
potencia luminosa emergente disminuye en forma logarítmica o exponencial.
Constante Espesor óptico
P
P0
P = P0 x10-kb P/P0 = 10-kb
Transmitancia
Linealizando:
b 2b 3b 4b b (cm)
log P/P0 = -kb
Dra. C. Mardones / Dr. D. von Baer, Depto. A. Instrumental. Fac. Farmacia, U.de Concepción
RELACION DE POTENCIA LUMINOSA TRANSMITIDA Y LA CONCENTRACIÓN
Ley de Beer-Bernard
Si un haz de REM monocromático incide en forma
paralela sobre una superficie absorbente, y si la
concentración de la especie absorbente aumenta
linealmente, la potencia luminosa emergente
P0 ½P disminuye en forma logarítmica o exponencial.
C
P Constante

P0
P=P0x10-kc Concentración

P0 1/4 P
2C
c 2c 3c 4c C
T
P0
3C 1/8 P
log P/P0=-kc

Dra. C. Mardones / Dr. D. von Baer, Depto. A. Instrumental. Fac. Farmacia, U.de Concepción
 T= P/P0 Considerando ambas leyes:

Absorbancia

A = - log T = log 100 - log %T = 2- log %T

Ley de Lambert
- BEER (LBB) A=kbc a y e dependen de:

e : absortividad molar k = e si c (moles/L) • Naturaleza de la

sustancia
a : absortividad k = a si c (g/L) • Longitud de onda

Dra. C. Mardones / Dr. D. von Baer, Depto. A. Instrumental. Fac. Farmacia, U.de Concepción
 Representación gráfica LLB
Concentración
mg/L %T T A
0 100 1 0,000
2 50 0,5 0,301
4 25 0,25 0,602
6 12,5 0,125 0,903
8 6,25 0,0625 1,204

Variable : x y