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INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL

ESCUELA NACIONAL DE CIENCIAS BIOLÓGICAS


QUÍMICO BACTERIÓLOGO PARASITÓLOGO
LABORATORIO DE BIOQUÍMICA

PRÁCTICA: Aislamiento de DNA plasmídico.

Sección: 4 Grupo

Alumnos:

OBJETIVO

 Aislar DNA plasmídico bacteriano, comprobando dicho aislamiento mediante


electroforesis en gel de agarosa.

ANÁLISIS DE LA TÉCNICA

Para lograr aislar el plásmido PuC-19, comenzamos por suspender las células en una
solución de glucosa-Tris-EDTA, los distintos componentes de esa mezclan funcionan
para distintas cosas: el tris es un agente tamponante que permitirá mantener el pH de la
solución en 8, por otra parte, el EDTA a pH de 8 presentará una carga de 4- y en esas
condiciones logra quelar al Ca++ el cual es cofactor de la DNAasa (enzima que se encarga
de lisar el DNA), al impedir que la enzima trabaje logramos evitar que el plásmido no sea
lisado.

Después de mezclar bien e incubar en hielo, agregamos 200 µL de la solución II, la cual
contenía SDS al 1% y NaOH 2N, el SDS es un detergente que llevará a cabo la ruptura
de las membranas de las células, facilitando la obtención del DNA plasmídico, por otra
parte, el NaOH realizará la hidrólisis del DNA propio de la bacteria (genómico) el cual no
es requerido en la práctica. El NaOH lleva a cabo la hidrólisis de manera inespecífica por
lo cual se requirió mezclar con mucho cuidado para que no se viera afectado el DNA
plasmídico. Posteriormente se mezcló por inversión el tubo y se puso a incubar durante
5 minutos en hielo. Se siguió con la adición de la solución III, la cual contiene acetato de
potasio en concentración 5M; con esta solución logramos precipitar las proteínas y el DNA
genómico por lo que al centrifugarse logramos obtener en el sobrenadante el DNA
plasmídico el cual pasamos a otro tubo y lo que no deseamos se queda en el fondo del
tubo.

Al sobrenadante recuperado le añadimos 500 µL de la solución IV la cual contiene


isopropanol, éste nos ayudará a precipitar el DNA plasmídico ya que baja la constante
dieléctrica del medio facilitando ese proceso; una vez añadida la solución, se centrifugó
a 13000 rpm y desechamos el sobrenadante, quedándonos únicamente con lo que
precipitó. A lo que anterior le agregamos 10 µL de la solución V que contiene regulador
Tris-EDTA para posteriormente seguir con la electroforesis en el gel de agarosa.
RESULTADOS

1 2 3 4 5 6 7 8
DNA Genómico

DNA circular relajado


DNA lineal
DNA superenrollado
RNA

En la electroforesis en gel de agarosa que empleamos en la práctica nos permite


lograr el análisis de distintas moléculas de acuerdo con su carga, en función de
su tamaño y estructura. La distribución de las moléculas cargadas depende de un
campo eléctrico generado por la aplicación de voltaje a través de electrodos. Se
observa que las moléculas de ADN se desplazaron al polo positivo esto porque a
un pH alcalino presentan carga negativa. En los carriles 5 y 6 se distinguen 2
bandas correspondientes a DNA plasmídico superenrollado además de que estas
bandas se distinguen mucho más evidentes debido a la cantidad de estas
moléculas ya que en la cámara de electroforesis el bromuro de etidio se intercala
en las bases del DNA generando un color fluorescente cuando se expone a luz
UV.

DISCUSIÓN

En la electroforesis pudimos observar los corrimientos de distintas muestras, en


los pozos se quedó el DNA genómico ya que por su gran tamaño no le es posible
salir de ahí. La primera línea de corrimiento que se observa pertenece al DNA
circular relajado, este corrimiento no se logra observar en la muestra del equipo 5
y 6, este DNA tiene ese corrimiento debido a que fue “dañado” en el proceso por
lo que se fragmenta y su recorrido se vuelve muy lento. El segundo corrimiento
pertenece al DNA lineal el cual proviene del rompimiento de una hebra del DNA
original y su forma impedirá que corra de manera rápida; respecto a las muestras
del equipo 5 y 6 podemos observar que se presenta mayor cantidad en el equipo
5 probablemente porque durante el tratamiento de DNA existió mayor
fragmentación de éste en forma lineal.
La siguiente línea pertenece al DNA superenrollado el cual es el que nos interesa,
respecto a los equipos 5 y 6, podemos observar que en la muestra del equipo 6
hay mayor presencia de éste y esos resultados pueden deberse a que el equipo
5 diluyó demasiado su muestra antes de colocarla en los pozos del gel por lo que
la concentración del DNA plasmídico disminuyó de manera considerable y se vio
reflejado en la electroforesis.

La última línea que se observa pertenece al RNA el cual se encuentra en


abundancia, pero tanto en los equipos 5 y 6 no se observa mucho esa “nube” de
RNA.

CONCLUSIONES

 La muestra que realizó el mayor corrimiento fue la del DNA superenrollado


debido a que su estructura le permite moverse con mayor facilidad.
 La muestra que se presentó en mayor proporción fue la de RNA y DNA
superenrollado.

PREGUNTAS EXTRA:

1. ¿Qué es la agarosa?

R= Es un polisacárido formado por galactosas alfa y beta, presenta una


histéresis importante (diferencia entre los puntos de fusión y gelificación),
en concreto, gelifica a temperaturas que se encuentran entre los 32 y 45°C
y se funde a temperaturas que se encuentran entre los 80 y 95°C. Esta
propiedad la hace idónea para llevar a cabo distintas técnicas de
separación como electroforesis y cromatografía.

2. ¿Qué es el bromuro de etidio?

R= El bromuro de etidio (BrEt) es un agente intercalante usado


comúnmente como marcador de ácidos nucleicos en laboratorios de
biología molecular para procesos como la electroforesis en gel de agarosa.
Cuando se expone esta sustancia a luz ultravioleta, emite una luz roja-
anaranjada, que se intensifica unas 20 veces más después de haberse
unido a una cadena de ADN. Este efecto es debido al aumento de la
hidrofobia del medio, y no a la rigidificación del anillo bencénico, no estando
éste entre pares de bases del ADN. Como el bromuro de etidio se intercala
en el ADN, esta sustancia tiene un poderoso efecto mutágeno y, puede ser
cancerígeno o teratógeno.

BIBLIOGRAFÍA

 Lehninger, A. L. “Principios de bioquímica”, 5ta edición. Ediciones Omega.