DETERMINACION DE LA ACTIVIDAD AMILOLITICA DE LA ALFA AMILASA

INTRODUCCION

Las enzimas son moléculas de naturaleza proteica y estructural que catalizan reacciones
químicas, siempre que sean termodinámicamente posibles: una enzima hace que una
reacción química que es energéticamente posible (ver Energía libre de Gibbs), pero que
transcurre a una velocidad muy baja, sea cinéticamente favorable, es decir, transcurra a una
mayor velocidad respecto a la ausencia de la enzima.

En estas reacciones, las enzimas actúan sobre unas moléculas denominadas sustratos, las
cuales se convierten en moléculas diferentes denominadas productos. Casi todos los
procesos en las células necesitan enzimas para que ocurran a unas tasas significativas. A las
reacciones mediadas por enzimas se las denomina reacciones enzimáticas.

Debido a que las enzimas son extremadamente selectivas con sus sustratos y su velocidad
crece solo con algunas reacciones, el conjunto (set) de enzimas sintetizadas en una célula
determina el tipo de metabolismo que tendrá cada célula. A su vez, esta síntesis depende de
la regulación de la expresión génica.

Como todos los catalizadores, las enzimas funcionan disminuyendo la energía de activación
(ΔG‡) de una reacción, de forma que se acelera sustancialmente la tasa de reacción. Las
enzimas no alteran el balance energético de las reacciones en que intervienen, ni modifican,
por lo tanto, el equilibrio de la reacción, pero consiguen acelerar el proceso incluso
millones de veces. Una reacción que se produce bajo el control de una enzima, o de un
catalizador en general, alcanza el equilibrio mucho más deprisa que la correspondiente
reacción no catalizada.

Al igual que ocurre con otros catalizadores, las enzimas no son consumidas por las
reacciones que catalizan, ni alteran su equilibrio químico. Sin embargo, difieren de otros
catalizadores por ser más específicas. Las enzimas catalizan alrededor de 4.000 reacciones
bioquímicas distintas. No todos los catalizadores bioquímicos son proteínas, pues algunas
moléculas de ARN son capaces de catalizar reacciones (como la subunidad 16S de los
ribosomas en la que reside la actividad peptidil transferasa). También cabe nombrar unas
moléculas sintéticas denominadas enzimas artificiales capaces de catalizar reacciones
químicas como las enzimas clásicas.

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La actividad enzimática puede ser afectada por otras moléculas. Los inhibidores
enzimáticos son moléculas que disminuyen o impiden la actividad de las enzimas, mientras
que los activadores son moléculas que incrementan dicha actividad. Asimismo, gran
cantidad de enzimas requieren de cofactores para su actividad. Muchas drogas o fármacos
son moléculas inhibidoras. Igualmente, la actividad es afectada por la temperatura, el pH, la
concentración de la propia enzima y del sustrato, y otros factores físico-químicos.

Algunas enzimas son usadas comercialmente, por ejemplo, en la síntesis de antibióticos y

otros productos farmacéuticos, como Brix 3000 por ejemplo, y otros productos médicos
innovadores y revolucionarios que Brix Medical Science está desarrollando para presentar
al mercado próximamente.

OBJETIVO

 Determinar la actividad amilolítica de la alfa amilasa (amilasa salival o ptialina).

REVISION BIBLIOGRAFICA

ALMIDON:

Es un polisacárido de reserva alimenticia predominante en las plantas, constituido por

amilosa y amilopectina. Proporciona el 70-80% de las calorías consumidas por los humanos
de todo el mundo. Tanto el almidón como los productos de la hidrólisis del almidón
constituyen la mayor parte de los carbohidratos digestibles de la dieta habitual. Del mismo
modo, la cantidad de almidón utilizado en la preparación de productos alimenticios, sin
contar el que se encuentra presente en las harinas usadas para hacer pan y otros productos
de panadería.

1. COMPONENTES

El almidón está compuesto fundamentalmente por glucosa. Aunque puede contener una
serie de constituyentes en cantidades mínimas, estos aparecen a niveles tan bajos, que es
discutible si son oligoconstituyentes del almidón o contaminantes no eliminados
completamente en el proceso de extracción.

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Los almidones de los cereales contienen pequeñas cantidades de grasas. Los lípidos
asociados al almidón son, generalmente, lípidos polares, que necesitan disolventes polares
tales como metanol-agua, para su extracción. Generalmente el nivel de lípidos en el
almidón cereal, está entre 0.5 y 1%. Los almidones no cereales, no contienen esencialmente
lípidos.

Químicamente es una mezcla de dos polisacáridos muy similares, la amilosa y la

amilopectina; contienen regiones cristalinas y no cristalinas en capas alternadas. Puesto que
la cristalinidad es producida por el ordenamiento de las cadenas de amilopectina, los
gránulos de almidón céreo, tienen parecido grado de cristalinidad que los almidones
normales. La disposición radial y ordenada de las moléculas de almidón en un gránulo
resulta evidente al observar la cruz de polarización (cruz blanca sobre un fondo negro) en
un microscopio de polarización cuando se colocan los polarizadores a 90° entre sí. El
centro de la cruz corresponde con el hilum, el centro de crecimiento de gránulo.

1.1. Amilosa: es el producto de la condensación de D-glucopiranosas por medio de

enlaces glucosídicos a (1,4), que establece largas cadenas lineales con 200-2500
unidades y pesos moleculares hasta de un millón; es decir, la amilosa es una a-D-
(1,4)-glucana cuya unidad repetitiva es la a-maltosa. Tiene la facilidad de adquirir
una conformación tridimensional helicoidal, en la que cada vuelta de hélice consta
de seis moléculas de glucosa. El interior de la hélice contiene sólo átomos de
hidrógeno, y es por tanto lipofílico, mientras que los grupos hidroxilo están
situados en el exterior de la hélice. La mayoría de los almidones contienen
alrededor del 25% de amilosa. Los dos almidones de maíz comúnmente conocidos
como ricos en amilosa que existen comercialmente poseen contenidos aparentes de
masa alrededor del 52% y del 70-75%.
1.2. Amilopectina: se diferencia de la amilosa en que contiene ramificaciones que le
dan una forma molecular a la de un árbol; las ramas están unidas al tronco central
(semejante a la amilosa) por enlaces a-D-(1,6), localizadas cada 15-25 unidades
lineales de glucosa. Su peso molecular es muy alto ya que algunas fracciones
llegan a alcanzar hasta 200 millones de daltones. La amilopectina constituye
alrededor del 75% de los almidones más comunes. Algunos almidones están

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constituidos exclusivamente por amilopectina y son conocidos como céreos. La

amilopectina de patata es la única que posee en su molécula grupos éster fosfato,
unidos más frecuentemente en una posición O-6, mientras que el tercio restante lo
hace en posición O-3.
2. RETROGRADACCIÓN

Se define como la insolubilización y la precipitación espontánea, principalmente de las

moléculas de amilosa, debido a que sus cadenas lineales se orientan paralelamente y
accionan entre sí por puentes de hidrógeno a través de sus múltiples hidroxilos; se puede
efectuar por diversas rutas que dependen de la concentración y de la temperatura del
sistema. Si se calienta una solución concentrada de amilosa y se enfría rápidamente hasta
alcanzar la temperatura ambiente se forma un gel rígido y reversible, pero si las soluciones
son diluidas, se vuelven opacas y precipitan cuando se dejan reposar y enfriar lentamente.

La retrogradación está directamente relacionada con el envejecimiento del pan, las

fracciones de amilosa o las secciones lineales de amilopectina que retrogradan, forman
zonas con una organización cristalina muy rígida, que requiere de una alta energía para que
se rompan y el almidón gelatinice.[1]

3. ENZIMA

Las amilasas son enzimas que hidrolizan moléculas de almidón dando diversos productos
incluyendo dextrinas y progresivamente pequeños polímeros compuestos por unidades de
glucosa. Las amilasas pueden ser sintetizadas de diversas fuentes incluyendo plantas,
animales y microorganismos.

Las amilasas se pueden dividir en tres grupos: α-amilasas, β-amilasas y glucoamilasas. Las
α-amilasas son unas de las más populares y las más importantes a nivel industrial (Días
2003).

Las amilasas son enzimas las cuales hidrolizan moléculas de almidón dando como
productos dextrinas y polímeros compuestos progresivamente por unidades de glucosa.
Esta familia de enzimas hidrolíticas está compuesta por a proteínas catalíticas: alfa-amilasa,
beta-amilasa; glucoamilasa; isoamilasa. Se encuentran ampliamente distribuidas en tejidos

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vegetales, donde juegan un rol muy importante en la degradación del almidón en la

germinación de las semillas; en tejidos animales, cumpliendo una misión digestiva; y en
diversas especies de microorganismos como hongos y bacterias.(UNIVERSIDAD
PONTIFICIA BOLIVARIANA, 2008).[2]

MATERIALES Y METODOS

1. MATERIALES:
1.1. MATERIALES Y EQUIPO:
 Gradilla para tubos
 Tubos de ensayo (4 u)
 Pipetas : 1 ml(2), 2ml (1), 5 ml (1)
1.2. REACTIVOS Y SOLUCIONES:
 Solución de almidon 1 %, pH 6.9
 Solución de NaCl 0.1 M
 HCl 0.05 N
 Solución yodada
 Reactivo de Benedict cualitativo
 Solución de alfa amilasa 1%.
2. METODOS:
2.1. ETAPA “A”: SISTEMA DE INCUBACION

TUBO 1:

 Agregamos 5 ml de solución de almidón bufferado al 1%, añadimos 1ml de NaCl

0.1 M, 4ml de agua destilada.
 Colocar este sistema de reacción en baño maría a 37°C por 5 minutos.
 Someter a incubación a 37°C por 15 minutos.

TUBO 2:

 Añadir 5 ml de solución de almidón bufferado, 1ml de NaCl 0.1 M, agregar 3ml de

agua destilada.
 Colocar este sistema de reacción en baño maría a 37 °C por 5 minutos.

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 Luego agregar alfa amilasa 1ml, someter a incubación a 37°C por 15 minutos.

2.2. ETAPA “B”. DETERMINACION DE LA ACTIVIDAD AMILOLITICA

2.2.1 EVALUACION DEL SUSTRATO RESIDUAL (Sustrato por desaparecer o
sustrato remanente)

TUBO 1:

 Agregar 5ml de HCl 0.05 N, transferir 0.5 ml del tubo 1 de la etapa A, añadir 0.5 ml
de solución yodada.
 Mezclar uniformemente los contenidos del sistema de reacción.
 Observar el color

TUBO 2:

 Añadir 5ml de HCl 0.05 N, transferir 0.5 ml del tubo 2 de la etapa A, agregar 0.5 ml
de solución yodada.
 Mezclar uniformemente los contenidos del sistema de reacción.
 Observar el color.
2.2.2 DETERMINACION DE LOS PRODUCTOS DE LA REACCION (azucares
reductores)

TUBO 1:

 Transferir 1ml del tubo 1 de la etapa A, agregar 5ml de Benedict cualitativo.

 Someter a ebullición por 10 minutos, al término mezclar uniformemente y observar
el color.

TUBO 2:

 Transferir 1ml del tubo 2 de la etapa A, agregar 5ml de Benedict cualitativo.

 Someter a ebullición por 10 minutos, al término mezclar uniformemente y observar
el color.

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RESULTADOS Y DISCUCIONES

1. RESULTADOS
1.1. ETAPA “A”
 Después de someter a la incubación los sistemas de reacción quedaron incoloro
en ambos tubos.
1.2. ETAPA “B”
CARACTERISTICAS TUBO 1 TUBO 2
COLOR azul amarillo
EFECTO No hidrolisis de almidón Hidrolisis de almidón

2. DISCUSION:
2.1. ETAPA “A”
En el tubo 1 debido a la falta de enzima no se ha dado ninguna reacción por ende
no se pudo degradar el almidón.
En el tubo 2 si tenemos presencia de enzima (a-amilasa) por lo tanto se da la
hidrolisis de almidón, es decir, el almidón es desnaturalizado hasta su estructura
primaria. (fig. 1)
2.2. ETAPA “B”
En el tubo 1 obtuvimos color azul debido a que el almidón permaneció en su
estructura nativa, por esto al momento de agregar la solución yodada este quedo
atrapado en su forma helicoidal evitando así su esparcimiento. Debemos tener
presente que se encuentra a temperatura ambiente, pero si es sometido a altas
temperaturas el calor degradara al almidón hasta su estructura primaria.
En el tubo 2 dado que en la etapa A la enzima degrado a su sustrato hasta una
forma lineal, al agregar la solución yodada, esta reacciona con los productos o
residuos tornándose de color amarillo. (fig. 2)

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CONCLUSIONES

 La enzima alfa amilasa de la muestra, hidroliza el sustrato y almidón. La

cantidad de almidón desdoblado para un determinado tiempo, es la medida de la
actividad enzimática presente en la muestra. Para la cuantificación fotométrica
se utiliza reactivo de iodo, que forma un complejo azul con el almidón, cuya
intensidad de color disminuye al aumentar la actividad de amilasa en la muestra.

REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS

[1] Recuperado de: https://www.ecured.cu/Almid%C3%B3n

[2] Recuperado de:

http://www.academia.edu/9677563/Revisi%C3%B3n_sobre_microorganismos_amilol
%C3%ADticos

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ANEXOS

Fig.2. Almidón permaneció

Fig.1 No se degrado el
en su estructura nativa.
almidón.

Fig.3 General etapa A y B

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