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PARÁMETROS
Intervalo de fraccionamiento: Es un determinado tipo de gel como los valores extremos
(máximo y mínimo) de pesos moleculares entre los cuales el gel tiene capacidad de
separar.
APLICACIONES
Además de utilizarse para la separación de sustancias de distintos pesos moleculares o
para la purificación de proteínas, se emplea para la determinación de pesos moleculares
de proteínas. Para una gran variedad de tipos de geles se ha comprobado que existe una
relación lineal entre el volumen de elución y el logaritmo del peso molecular de las
proteínas.
Usos
• Purificación de proteínas.
Es un método suave y rápido para transferir una proteína de un buffer a otro. También se
usa para desalar una muestra, es decir pasarla de un buffer de alta fuerza iónica a uno de
baja fuerza iónica.
MATERIAL Y REACTIVOS
Material
.- Columna de cromatografía .
- Pipetas Pasteur .
- Tubo graduado .
- Vaso o Erlenmeyer
Reactivos.
- Sephadex .
- Ferricianuro potásico.
- Ditionito sódico.
PROCEDIMIENTO
Preparación del hemolizado:
Se añaden 25 ml de tampón fosfato por gramo de gel. Se deja hasta el día siguiente. De
este modo, se consigue la estructura de retícula tridimensional que permite la
separación de las moléculas de la muestra ya que cada bolita de gel seco absorbe el
tampón, aumentando su volumen . Se partirá del gel hinchado.
Empaquetado de la columna:
Con la llave de la columna cerrada se comienza a añadir, usando una pipeta Pasteur,
aproximadamente 15 ml de suspensión del gel, dejándola resbalar por la pared de la
columna para evitar que se formen burbujas de aire en el interior del gel. Con el
tiempo, el gel va sedimentando.
Importante:
Dejar fluir el tampón hasta que el menisco alcance el lecho del gel, evitando que éste
se seque. Cerrar la llave. Añadir cuidadosamente con la pipeta Pasteur 2 gotas de la
solución de azul de dextrano. Abrir la llave hasta que la banda de azul dextrano entre
completamente en el gel y cerrar de nuevo.