Resumo:

No zebrafish, o pallium medial do telencephalon dorsal representa uma estrutura

homologa à amigdala, que está envolvida crucialmente na aprendizagem emocional associativa
e memória. Similar à amigdala do mamífero, o pallium medial contem uma alta densidade do
receptor CB1 do sistema endocannabinoide. Para explicar o papel do sistema sistema
endocannabinoide do zebrafish na aprendizagem associativa, nós testamos a influência da
administração aguda e crônica dos agonistas do receptor (THC, WIN55,212-2) e de antagonistas
(Rimonabant, AM-281) em dois paradigma de aprendizagem diferentes. Em um paradigma bem
escolhido de two-alternative ,no appetitively motivado, os animais aprenderam associar alguma
cor com uma recompensa do alimento. Em uma segunda instalação, em um aquário shuttle-box,
animais associou o início de um estímulo claro com a ocorrência de um choque eléctrico
subseqüente (condicionamento de esquiva). Uma vez que os peixes com sucesso tinha
aprendido a resolver essas tarefas comportamentais, a ativação ou inativação ( aguda)do
receptor não teve efeito sobre a recuperação da memória, sugerindo que as memórias
associativas estabelecidas foram estáveis e não modificáveis pelo sistema endocanabinóide. Em
ambas as tarefas de aprendizagem, o tratamento crônico com antagonistas dos receptores
melhorou aquisição de aprendizagem, e, adicionalmente, facilitou aprendizado de reversão,
durante discriminação de cor. Entretanto, a ativação de CB1 impediu a aquisição/aprendizagem
na busca motivada aversivelmente, enquanto os efeitos diferentes foram encontrados na
aprendizagem/aquisição appetitively motivado. Enquanto THC significativamente melhorou o
desempenho comportamental, WIN55,212-2 significativamente prejudicaram a associação de
cores.

Introdução:

Aprendizagem associativa é definida como a capacidade de adquirir e

consolidar a relação entre a ocorrência de um estimulo sensorial particular e uma consequência
subsequente, o qual pode ter uma relevância positiva ou negativa [1,2]. Normalmente
recompensas de alimentos são consequências positivas para a aprendizagem associativa,
enquanto choques elétricos e substâncias nocivas são aplicados para a punição ou desconfortos
viscerais [3,4]. Ambos os tipos de aprendizagem associativa foram investigadas no zebrafish [5-
7], que envolve diferentes modalidades sensoriais. Muitas vezes, os animais foram treinados em
tarefas de associação visuais [8-11], mas também olfativa [12] e gustativa [13], aprendizagem
associativa base foi investigada.

Achados de desenvolvimento e hodológico sugerem que o medial palio (Pm) representa

uma estrutura homóloga à amígdala do telencéfalo dorsal dos mamíferos[14-17]. Esta suposição
é suportada por estudos de lesões em goldenfish (Carassius auratus). A destruição de Pm
resultou numa retenção diminuída de uma estratégia previamente adquirida, durante
evasão condicionada ativa [18-20]. Além disso, o mapeamento de actividade neuronal por
medição da expressão de c-fos mRNA revelaram que o PM serve como um centro de cérebro
para o comportamento emocional guiado no zebrafish [21]. Assim, o Pm é uma estrutura
essencial para a aprendizagem associativa.
O receptor de canabinóide 1 (CB1) representa o principal alvo para os canabinóides
endo e exógenos no sistema nervoso central dos vertebrados [22,23]. Lam et ai. [24] investigada
a distribuição da expressão de mRNA de CB1 no cérebro de adulto do zebrafish. Ao nível do
telencéfalo dorsal, o PM apresentou coloração mais intensa em relação a outras regiões. Isso
levou à suposição de que o sistema endocanabinóide é crucialmente envolvida em processos
relacionados ao Pm, como estado emocional do peixe ou memória associativa. Na verdade, o
tratamento agudo do zebrafish, treinado em um paradigma de discriminação de cor com o
agonista CB1 THC (tetrahidrocanabinol) não afetou a recuperação da memória, quando o efeito
dose dependente ansiolítica foi sugerida.
O presente trabalho teve como objetivo determinar a influência do tratamento agudo e
crônico com agonistas CB1 e antagonistas, no desempenho comportamental, aprendizagem
associativa e recuperação da memória no zebrafish, treinado tanto em uma tarefa appetitively
motivado, discriminação de cor ou em um paradigma de aversividade em um aquário shutlle-
box.
2- Material e método
2.1- Animais:

Os peixes (n = 132; D. rerio, AB estirpe selvagem, o corpo de 30-40 mm

comprimento, um ano de idade, de ambos os sexos) foram criados em casa e acondicionadas em
comunidade (no máximo n = 100) em 200 (aquários com água gaseificada e filtradas em 25-27
◦C, um substrato de areia e esconderijos diferentes lugares (plantas, pedras e cacos de cerâmica).
Os animais foram submetidos a um ciclo luz / escuro 12:12 h de luz e mantidos numa dieta
diária de alimentos pellet fish food (Sera, Heinsberg, Alemanha). antes de começar
de aprender Experimento 1 (ver secção 2.3), participando indivíduos (n = 85) não foram
alimentados por quatro dias. Durante os experimentos, os animais não obteram comida extra
além de recompensas dos testes. Zebrafish (n = 47), tomada para experimento 2 aprendizagem
(ver secção 2.4), não foram privados de alimentos.
Antes de início dos experimentos, zebrafish foram transferidos para o laboratório de
testes e foram alojados em grupos de cinco animais em 12 l aquários equipados com um
aquecedor e um fi ltro. Metade da água do aquário foi trocada uma vez por semana. As
experiências que começaram depois de um período de aclimatação de três dias. Todos peixe
foram droga ingênuo antes dos experimentos.
Os experimentos seguiram as diretrizes das leis de protecção dos animais e foram aprovados
pelo Comitê de Cuidado e Uso.
 2.2- Aplicação das drogas:

Para verificar como a ativação ou inativação de receptores de canabinóides muda

performances comportamentais nas duas tarefas de aprendizagem, zebrafish foram
administrados agonistas CB1 o THC (THC-Pharm GmbH, Alemanha) ou WIN55,212-2
(Sigma-Aldrich, Alemanha), ou o CB1 antagonistas rimonabant (THC-Pharm GmbH,
Alemanha) ou AM-281 (Tocris, RU), como descrito anteriormente [25]. Para o tratamento de
drogas animais foram nadar em um copo contendo 100 drogas nm de 2,5 litros de água corrente
durante uma hora. Para alcançar a concentração desejada, de 250 µl de uma solução de estoque
1 mM (3,14 mg THC ou 5,23 mg de WIN55,212-2, 268,6 µl de etanol, 700 µl de Cremophor, 9
ml aquadest; 4,6 mg Rimonabant ou 5,57 mg de AM-281, 300 µl de etanol, 700 µl de
Cremophor, 9 ml aquadest) foi adicionado à água do aquário. Os animais de controlo foram
mantidas em água corrente.
Peixe-zebra ou foram testados para um efeito agudo e tratados apenas uma vez, ou que
foram usadas para a investigação das influências farmacológicas crónicas e recebeu um
tratamento diário antes de cada formação.
2.3 Experimento 1
O paradigma discriminação de cor seguiu o mesmo protocolo como descrito anteriormente [25]
e é aqui descrito apenas brevemente: O set-up para a aprendizagem de discriminação de cores
foi um 50-l aquário que foi dividida em três compartimentos. Uma câmara central de partida é
separado a partir de dois-compartimentos de escolha por paredes cinzentas PVC, contendo cada
um uma central de porta com fechadura. Nos lados exteriores dos compartimentos de escolha,
folhas coloridas removíveis foram fixadas às paredes do aquário. Cada folha era iluminada por
uma lâmpada de luz por trás, colorindo o compartimento respectivo escolha e proporcionando,
assim, um estímulo para a aprendizagem de cor. As intensidades de luz de cores nos dois
compartimentos de escolha foram criados igualmente a 500 lx.
Em uma tarefa de escolha de dois alternativa, peixe-zebra aprenderam a associar uma
cor verde estímulo (S +) com uma recompensa de alimentos. Em primeiro lugar, os animais
foram habituados ao ambiente desconhecido durante dois dias. Todos os indivíduos de um
grupo foram colocados em conjunto na câmara de partida, durante 30 min, com ambas as portas
abertas e com duas idênticas cor verde-estímulos. O grupo poderia explorar livremente o
aquário. Cada vez que uma porta foi aprovada, os animais foram recompensados com comida
pequenos pedaços de vermes de sangue. Nos dois dias seguintes, os animais foram ajustados
individualmente para dentro da câmara de partida, enquanto que o procedimento foi o mesmo
que de outra forma nos dias anteriores. Após o período de habituação, peixe-zebra foram
treinados individualmente pela liberação único peixe para a câmara iniciar. Após dois minutos
de aclimatação, o primeiro teste começou abrindo ambas as portas simultaneamente. Peixe
aprendeu a discriminar entre duas cores (verde e vermelho), nadando para a cor definida como
positiva (verde: S +) para obter uma recompensa alimentar. Se um peixe nadando para o
negativo da cor (vermelho: S-), não foi recompensado, e devolvido para a câmara de partida.
Antes de um novo teste começar, as duas lâminas coloridas para S + e S-foram re-organizadas
de acordo com um cronograma pseudo-aleatório [26]. A mesma combinação de cores de S + e
S-foi utilizado durante cada dia de treinamento. Sessões diárias consistiu de 4-8 ensaios para
cada indivíduo. Decisões corretas ou erradas eo tempo de abrir as portas até que o peixe nadou
através de uma das portas foram anotadas em cada teste. Uma vez que o grupo tinha alcançado o
critério de aprendizagem de mais de 70% de escolhas correctas em três dias consecutivos, foram
realizados testes com tratamento farmacológico agudo (n = 14 THC teste, n = 13 teste
rimonabant).
Para investigar o efeito do tratamento farmacológico crónico em aprendizagem e
memória, outros grupos de peixe (n = 11 controlo, n = 11 veículo, n = 8 THC, n = 9
WIN55,212-2, n = 10 rimonabant, n = 9 AM-281) foram tratados com as drogas, antes de cada
teste, durante 13 dias. Os peixes foram treinados como descrito acima, durante sete dias,
seguido de seis dias de treinamento de reversão, durante o qual escolha do anteriormente na cor
correta (vermelho) foi agora recompensado e a cor previamente correta (verde) foi agora
incorreta. O procedimento de formação ocorreu diariamente, e foram medidas a mesma que a
utilizada na aprendizagem discriminação anterior.
2.4. Experimento 2 - aprendizagem esquiva ativa
Para evitar a aprendizagem ativa, peixe-zebra individuais foram treinados em uma caixa de
peixe-shuttle modificado após Pradel et al. [5]. Um tanque de 12-L foi dividido por uma barreira
opaca em dois compartimentos iguais. A barreira foi de 10 cm de altura e o nível da água foi
ajustado a 12 cm para permitir que os animais passem livremente através da barreira a partir de
um compartimento para o outro. Houve uma folha vermelha no final de cada uma das paredes
do tanque iluminado por um LED branco por trás dele. Em cada um dos compartimentos com os
lados maiores do tanque, havia duas placas de eléctrodos de aço (13 cm x 16 centímetros). Os
eléctrodos de aço estavam ligados a uma unidade de choque composto por um accupulser
(Modelo A310, instrumentos de precisão do mundo, Sarasota, EUA) e um gerador de estímulo
(Modelo 395, Wavetek, San Diego, EUA). Um espelho foi montada acima da caixa de
transporte para permitir a observação do comportamento do peixe.
O paradigma experimental consistiu na apresentação de um estímulo neutro (luz
vermelha), seguido por choques elétricos leves no intervalo de 6 s (125 mA, 200 ms),servindo
como estímulo incondicionado. O sinal de luz foi mantido durante cada teste durante 30 s. Em
um segundo momento, o estímulo neutro e o estímulo incondicionado foi trocado para o outro
lado da shutlle-box. O período de treino diário durou durante 15 min e composta por 30 ensaios
por dia. O peixe tinha a associar o em conjunto do estímulo neutro com o estímulo acima, vindo
não condicionado, e para evitar os choques eléctricos nadando para o outro lado do tanque
dentro de 6 s após o aparecimento de luz vermelha. Antes do treinamento, determinou-se o nível
de chance de zebrafish transportando para o outro compartimento dentro de 6 s após, no
conjunto da luz estímulo vermelho sem o consequente aparecimento do estímulo
incondicionado. Os animais testados (n = 29) mostraram vaivém no comportamento, em 29%
dos ensaios. Devido a esta frequência vaivém espontâneo, definimos o critério de aprendizagem
como 45%, reações de evitação, que diferiram significativamente do nível chance de 29% (teste
exato de Fisher, SPSS 21, SPSS Inc., Chicago, EUA).
Antes da experiência começar, peixe-zebra foram habituados ao ambiente desconhecido
durante dois dias. Os peixes foram definidos como um grupo shuttle-box sem quaisquer
estímulos neutros ou não condicionados. Os animais tinham liberdade para nadar no tanque e
poderim explorar a barreira, bem como os dois compartimentos. No terceiro dia, os animais
foram colocados individualmente em shuttle-box e após um período de aclimatação de um
minuto, começou o teste. Quando a luz vermelha ligada, um peixe poderia evitar os impulsos
elétricos por atravessar a barreira antes do primeiro pulso elétrico (ou seja, no prazo de 6 s). Se
ele se hospedaram no compartimento mais de 6 s, que poderia ou executar uma ação escapar,
nadando para o outro lado durante / após o primeiro impulso elétrico ou responder com o
comportamento de congelamento e permanecer no compartemento choque. Foram anotados
todos os diferentes tipos de comportamentos. Uma vez que o grupo alcançou o critério de
aprendizagem de alcançar mais 45% de respostas de evitação em três dias consecutivos, foram
realizados os testes com o tratamento farmacológico aguda (n = 15). Para testar um efeito do
tratamento crónico com THC ou rimonabant na aprendizagem e memória, peixe (n = 6 veículo,
n = 5 rimonabant, n = 6 THC) obteve tratamento diário ao longo do curso do experimento. O
procedimento de formação medidas diariamente e foi o mesmo como mencionado acima.

2.5. As análises e estatísticas

Todos os dados obtidos em experiências comportamentais foram expressos como médias e erro
padrão da média (±). Os dados de indivíduos investigados foram agrupados de modo a avaliar o
desempenho comportamental para cada dia de ensaio e analisados por meio do teste de
normalidade Kol-mogorovSmirnov, seguido por ANOVA de um factor de dois ou wayANOVA
com medidas repetidas (SPSS 21, SPSS Inc., Chicago, EUA). Post-hoc análises foram
realizadas por Bonferroni-correção. A significância estatística foi aceita se p <0,05.

Resultados
3.1.1. Tratamento agudo - Experimento 1
Os resultados da experiência associativa discriminação de cor indicou que peixe-zebra de ambos
os grupos (THC e grupos rimonabant) desenvolveu uma forte preferência para a natação a S +
depois de vários dias de treinamento. Durante a aquisição, o número de escolhas correctas
aumentaram, enquanto a escolha de latência diminuiu de um dia até ao dia seis (Fig. 1A e B).
Nessa fase experimental, os animais inspecionou as duas opções por repetitivamente nadar para
enfermarias as portas abertas antes de entrar em uma câmara de escolha. ANOVA detectaram
uma significativa sobre todos no vinco em número de escolhas correctas (F (12,169) = 3,6, p
<0,001) e uma diminuição na latência de decisão (F (12,714) = 6,6, p <0,001), ao longo da
experiência para o grupo de THC. O grupo Rimonabant começou em um nível superior em
número de escolhas corretas, inicialmente nadando em 70% a S +. Devido a isso, ANOVA não
indicam um aumento significativo no número de escolhas correctas (F (9,117) = 1,5, p = 0,1),
enquanto que as latências escolha diminuiu significativamente (F (9,484) = 2,0, p <0,05)
durante este período da experiência. Nos dias sete e oito, os ensaios farmacológicos foram
realizados e no dia onze houve o controlo do veículo. Neste ponto, peixe-zebra tinha atingido
cerca de 80% escolhas corretas e precisava de 4-6 s para uma decisão. Nos dias de THC aguda,
Rimonabant ou administração de veículos, o número de escolhas corretas ou as latências de
decisão não se alterou significativamente em comparação com os dias anteriores ou posteriores,
indicando que os tratamentos não teve efeitos significativos sobre o comportamento dos peixes
(Bonferroni, p = 1,0 ). (Fig. 2).
3.1.3. O tratamento crônico - Experimento 1

Em seguida testou-se o efeito do tratamento crónico com agonista CB1 e antagonista

sobre a aprendizagem e de memória utilizando os mesmos paradigmas de aprendizagem tal
como descrito acima. No experimento discriminação de cor, cinco dos seis grupos de teste
mostrou preferência escolha bem sucedida para S + durante a aquisição (dias 1-7), apenas os
animais tratados com agonistas CB1 WIN não conseguiu resolver a tarefa associação cor.
Durante reversão aprendizagem (dias 8-13) encontramos deficiências comportamentais
significativas nos grupos tratados com agonistas CB1, enquanto ambos os antagonistas CB1
testados facilitou significativamente resolver a tarefa de memória (Fig. 3). Tratamento
farmacológico diário com o veículo não teve nenhum efeito sobre a associação cor do peixe-
zebra testado em comparação com controlos não tratados (Fig. 3a). ANOVA com medidas
repetidas mostrou que a quantidade de acertos não foi significativamente diferente entre o
controle eo veículo grupo ou para período de aquisição (FGROUP (1,18) = 0,01, p = 0,8; Fdays
(6108) = 3,4, p <0,01; FGROUP × dia (6108) = 2,0, p = 0,07) ou para a reversão aprendizagem
(FGROUP (1,20) = 0,3, p = 0,6; Fdays (5100) = 1,0, p = 0,4; FGROUP × dias (5100) = 1,1, p =
0,4).
No entanto, o tratamento crónico com os dois agonistas WIN e THC conduziu a
diferenças significativas no comportamento dos animais tratados (Fig. 3B) de aprendizagem.
ANOVA com medidas repetidas determinou que o número de escolhas corretas diferiu
significativamente entre os grupos durante a aquisição (FGROUP (2,24) = 22,43, p <0,001;
Fdays (6144) = 1,4, p = 0,2; FGROUP × dias (12.144) = 0,7, p = 0,8). Análises posteriores
utilizando a correção de Bonferroni revelaram que a aplicação de THC melhorou
significativamente o desempenho comportamental em relação ao do grupo controle (p = 0,001)
e o grupo WIN (p <0,001), e houve uma diferença significativa entre o controle e o grupo WIN
(p <0,05), o qual foi o único grupo que falhou para adquirir uma associação cor. Além disso, os
animais tratados com WIN só mostrou aumento tigmotatismo como preferiam a nadar ao longo
das paredes da câmara antes de começar eles escolheram para nadar em um compartimento de
escolha. Todos os outros peixes testados nadadores no centro da câmara de partida, a partir de
vaivém entre as paredes.
Grupos tratados com ambos os antagonistas CB1 mostrou aquisição superior,
aprendendo sobre o grupo controle (Fig. 3C). ANOVA com medidas repetidas determinou que o
número de escolhas corretas diferiu significativamente entre os três grupos (FGROUP (2,26) =
8,18, p <0,01; Fdays (6156) = 2,4, p <0,05; FGROUP × dias (12.156) = 0,8 , p = 0,7). Análise
post hoc Bonferronifound depois que a aplicação do rimonabant, bem como AM-281 melhorou
significativamente desempenhos comportamentais maior que a do grupo de controlo (p = 0,01),
ao passo que não houve diferença significativa entrea tratamento com ambos os antagonistas (p
= 1,0).
A partir da aprendizagem reversa fez o grupo WIN alcançar escolhas mais corretas do
que o controle, e o grupo THC, mas esse efeito certamente foi baseada no fato de que os animais
tratados com WIN não resolveu a tarefa de memória associativa original antes; seu desempenho
comportamental ficado em torno do nível chance de 50% para todo o período do experimento
(Fig. 3B). Durante aprendizagem reversa, o grupo THC realizado em um nível muito baixo e
não melhorou o seu desempenho. Estes animais mostraram significativamente menos respostas
corretas do que o grupo controle. Para aprendizagem reversa, análise de variância com medidas
repetidas revelou que o número de escolhas corretas diferiu significativamente entre THC, WIN
e grupos de controle (FGROUP (2,23) = 13,4, p <0,001; Fdays (5115) = 1,2, p = 0,3; FGROUP
× dias (10,115) = 1,3, p = 0,3). Um teste post hoc depois de Bonferroni mostraram que o THC
significativamente prejudicada a aprendizagem reversa, em comparação com a WIN (p <0,001)
e o grupo controle (p <0,05), enquanto o desempenho comportamental dos controles diferiu
significativamente da WIN de animais tratados (p <0,05).
Em contraste, os grupos tratados com ambos os antagonistas alcançados escolhas
significativamente mais corretas do que o grupo controle durante a aprendizagem reversa.
ANOVA com medidas repetidas revelou que o número de escolhas corretas diferiu
significativamente entre Rimonabant, AM-281 e grupo controle (FGROUP (2,25) = 12,1, p
<0,001; Fdays (5125) = 4,4, p <0,001; FGROUP × dias (10,125) = 1,2, p = 0,3). O teste de
Bonferroni post hoc revelou que os antagonistas melhorou significativamente a aprendizagem
reversa sobre o grupo controle (p <0,01), enquanto não houve diferença entre o desempenho
comportamental de Rimonabant e AM-281 animais tratados (p = 1,0).
3.1.4. O tratamento crônico - Experimento 2
Em contraste com a aprendizagem associação cor, tratamento farmacológico crônico
influenciado esquiva ativa aprendendo de uma maneira diferente. Em comparação com os
controlos não tratados, tratamento diário com solução veículo comportamento de aprendizagem
ligeiramente afectadas do peixe-zebra (Fig. 4A). O grupo controle realizado ligeiramente
melhor do que o grupo do veículo, mas ANOVA com medidas repetidas após a correção de
Greenhouse-Geisser determinou que o número de evitações não diferiram significativamente
entre os dois grupos (FGROUP (1,18) = 1,3, p = 0,3; Fdays (4.8,86.2) = 10,0, p <0,001;
FGROUP × dias (4.8,86.2) = 1,1, p = 0,39). Em contraste, o tratamento crônico com THC ou
Rimonabant afetou significativamente a aprendizagem ea memória em shuttle-box o peixe (Fig.
4B). Todos os três grupos atingida inicialmente baixo número de respostas de evitação. Embora
o grupo de controlo melhoraram o seu desempenho continuamente, atingindo o critério de
aprendizagem após seis dias, o grupo rimonabant mostrou uma aprendizagem mais rápida,
como os animais atingiram o critério de aprendizagem já onthe segundo dia e permaneceu no
nível elevado até ao fim da experiência. Apenas o grupo de THC não conseguiu atingir o
critério de aprendizagem. Os animais não apresentaram um claro aumento em respostas de
evitação no decurso da experiência. Em vez disso o peixe apareceu cada dia como se tivessem
sido confrontados com o paradigma comportamental, pela primeira vez. Se, por vezes, um
animal mostrou um elevado número de evitações no dia um, o mesmo indivíduo não conseguiu
manter este elevado desempenho e alcançou apenas um baixo número de evitações no dia
seguinte.

ANOVA com medidas repetidas após a correção de Greenhouse-Geisser mostrou que o

número de evitações diferiu significativamente entre o THC, Rimonabant e grupos de controle
(FGROUP (2,20) = 4,6, p <0,05; Fdays (5.3,105.5) = 6,5, p <0,001; FGROUP × dias
(10.5,105.5) = 1,5, p = 0,1). Teste post-hoc de Bonferroni revelaram que após rimonabant
melhorou significativamente o desempenho comportamental em comparação com o grupo
tratado com o THC (p <0,05), ao passo que não houve diferença significativa entre o controlo e
os grupos de THC (p = 0,8). A diferença entre o Rimonabant e o grupo controle não foi
significativa, mas mostrou forte tendência (p = 0,07).
4. Discussão
Este estudo examinou os efeitos do tratamento agudo e crônico com receptor canabinóide 1
(CB1) agonistas (THC, WIN55,212-2) e antagonistas (rimonabant, AM-281) sobre as funções
de aprendizagem associativa e memória, appetitively e aversivamente motivados, no zebrafish.
Os resultados dos testes de tratamento farmacológico agudo após a aquisição mostraram que
nem o desempenho na tarefa de alimentar recompensado discriminação de cor, nem em shuttle-
box o peixe foi interrompido por THC ou Rimonabant. Isto indica que a recuperação a partir da
memória associativa, uma vez estabelecida parece funcionar de forma independente do sistema
endocannabinoid no peixe-zebra. Em contraste, o tratamento crónico com antagonistas de CB1 e
agonistas tinha um efeito sobre ambas as tarefas de aprendizagem. Na tarefa de associação de
cor, os dois agonistas teve efeitos opostos sobre a associação de cor: o tratamento com THC
melhorada associação cor enquanto WIN prejudicada desempenho comportamental nesta tarefa
de memória. Os dois antagonistas CB1 Rimonabant e AM-281 tanto melhorou aquisição e
reversão, como facilitou o aprendizado na tarefa associação cor. No paradigma esquiva ativa,
tratamento crônico com o CB1 antagonista Rimonabant melhorou significativamente o
comportamento de aprendizagem de peixe-zebra, enquanto o THC agonista do receptor
prejudicada aprendizagem de evitação.(avoidance)
4.1. O tratamento agudo
A aprendizagem associativa exige a aquisição de um relacionamento causal e/ou
temporal entre um comportamento conduzido estímulo (natação a S+) e uma conseqüência
positiva ou negativa subseqüente, ou entre dois estímulos, um estímulo incondicionado (US) e
um estímulo neutro que durante o acondicionamento se transforme um estímulo condicionado
(CS). No caso da experiência 1, o paradigma da discriminação de cor, nadando à cor verde (S+)
foi associado com uma recompensa do alimento, quando a cor vermelha foi evitada porque era
associada sem a recompensa. Ao contrário, durante o acondicionamento ativo da vacância da
experiência 2, um choque eléctrico suave seriu como os U.S., quando o estímulo da luz
vermelha era o CS.

O conhecimento sobre os substratos neuronais para a aprendizagem associativa em peixes tem

origem principalmente a partir de estudos de lesões. Especialmente destruição do pálio medial
(PM) no telencéfalo dorsal de teleósteos prejudicada aprendizagem emocional, por exemplo,
aprendizagem aversão ao sabor [13]. Além disso, as lesões do Pm resultou na retenção
interrompido de respostas de evitação condicionada (CAR) em um shuttle-box [18]. As análises
de expressão gênica e hodológico, bem como achados neurofisiológicos sugerem fortemente
que entre as áreas pallial, o Pm em peixes é funcionalmente homóloga para a amígdala de
mamíferos, enquanto o pálio lateral (Pl) representa uma estrutura hipocampo homólogo
[16,21,28-30 ]. Como encontrado para a amígdala e o hipocampo, e Pm Pl do telencéfalo peixe-
zebra possuem uma elevada densidade de receptores CB1 [24,31-33]. No entanto, nem ativação
aguda nem inativação aguda de CB1 no nosso peixe-zebra recuperação influenciada a partir da
memória associativa em ambas as tarefas de aprendizagem e as concentrações testadas (ver
também [25]). Estes resultados diferem em parte a partir dos resultados de estudos comparativos
conduzidos com mamíferos. Em tarefas de aprendizagem motivados appetitively, ou seja, em
experimentos premiados condicionado, tais como o nosso Experimento 1, foram obtidos
resultados semelhantes com mamíferos. Uma vez que uma associação visual ou olfativa
recompensados foi criada em roedores, parecia não ser afetado pela ativação ou inativação do
sistema endocanabinóide.
 Em contraste, os resultados obtidos na Experiência 2 diferem daqueles obtidos com
mamíferos. Embora o tratamento Rimonabant aguda não tem qualquer efeito sobre a
recuperação da memória de ratos em um shuttle-box [36], a administração aguda de THC com
diferentes doses (2,5-7,5 mg / kg) em ratos, que foram treinados em um instrumental
pavloviano-to-transferir procedimento evasão ou CAR no shuttle-box, reduziu
significativamente o número de CAR.
Talvez, os diferentes resultados entre peixe-zebra e mamífero varredura ser explicado
por uma dose-dependência de ativação CB1. Agonistas de receptor de canabinóides, tais como
THC, muitas vezes dependente da dose, induzem efeitos opostos comportamentais [40,41] em
mamíferos. CB1 localizados em terminais GABAérgicos são activados por concentrações mais
baixas dos agonistas de receptores localizados nos terminais glutamatérgicos [42], que
eventualmente conduz a regulação em função da dose de GABAérgica e neurónios
glutamatérgicos na recuperação da RCA [43]. Daqui decorre que o THC exerce um controle
bifásico de estratégias de enfrentamento do medo, com doses inferiores e superiores
favorecendo respostas activas e passivas, respectivamente [43]. Também no peixe-zebra, o
número de CAR pode diminuir com doses mais elevadas do que o THC, 100 nM foi utilizado
no presente estudo, em uma maneira similar como foi mostrado para ratos: 20 mg / kg de resina
de cannabis com concentração de THC de 17% não o fez inibir CAR em cima do aparelho de
escalada pólo, onde, como aplicação de 100 mg / kg induziu a supressão completa do CAR.
O tratamento crônico e aprendizagem reversa
Aprendizagem associativa discriminação visual e reversão discriminação tem sido investigado
no peixe-zebra [6,8,45-47]. Além WIN, todos os grupos testados em nossos experimentos
mostraram associação cor, como os indivíduos poderiam discriminar com êxito entre um
recompensados e uma cor não-recompensados. Conforme relatado na literatura sobre os
mamíferos, os antagonistas CB1 pode induzir a melhoria da memória em várias tarefas de
aprendizagem [48], isto é, teste de reconhecimento social [49], e tarefas de memória espacial
[50,51]. Em contraste, o uso de agonistas de CB1 tais deficiências de memória causa asTHC em
mamíferos [52]. Em nosso estudo, o tratamento crônico com os dois agonistas CB1 tiveram
efeitos diferentes sobre a associação de cores. THC aumentou significativamente a
aprendizagem de aquisição, mas WIN animais tratados não conseguiu associar uma cor com
uma recompensa alimentar (Fig. 3B). Este achado é paradoxo e sugere que as diferenças entre
ambos os agonistas CB1 pode ser causado por farmacocinética desviantes e -dynamics. Ao
contrário de THC, WIN é um agonista total de CB1 com actividades intrínsecas relativas mais
elevadas e afinidade para o receptor, que fica a cerca de 40 vezes mais elevada do que a de THC
[53-56] .Assim, o tratamento com 100 nM de WIN pode ser mais eficaz na 100 CB1than nM
THC, provocando um déficit na aprendizagem associativa. Além disso, a influência da WIN em
tigmotatismo poderia ser interpretada como um elevado nível de medo de ser responsável pelo
comportamento de aprendizagem prejudicada [57,58], embora WIN foi encontrado para agir
sobre o comportamento do peixe-zebra anxiolytically [59]. O tratamento com o outro agonista
CB1 THC levou a conclusões opostas, ou seja, que melhorou significativamente a
aprendizagem associativa. As investigações sobre os mamíferos relatado que os níveis elevados
de endógena anandamida CB1 ligando aumentou a taxa de aquisição de aprendizagem em
diversos paradigmas [60-62]. Com base nestes achados, foi proposto que uma actividade de
modulação subtil CB1 pode alterar estados emocionais ou motivacionais que conduzem à
melhoria de aquisição de memória. Assim, 100 nM THC melhoria da aprendizagem aquisição
podia ser uma característica especificamente atribuída ao sistema endocannabinoid peixe-zebra,
ou se originou a partir de um efeito comparável nootrópico que foi encontrado para os níveis
elevados de anandamida em mamíferos.

Início do aprendizado de reversão, mudando a cor reforçado com a cor alternativa

anteriormente unrewarded diminuiu o número de escolhas corretas em todos os grupos. Em um
estudo realizado por Colwill et al. [9], peixe-zebra treinado em um paradigma de discriminação
de cor precisou de quatro dias ou até mais tempo para a aprendizagem de reversão. Embora
tenha sido utilizado um processo de correcção, durante o qual cada tentativa incorreta foi
repetida com a opção de escolha incorreta bloqueado, alguns animais necessários mais de sete
dias para a reversão da discriminação. No presente estudo, nós não utilizar um procedimento de
correção comparável e descobriu que o nosso peixe-zebra mostrou pobre aprendizagem de
reversão, nem mesmo atingindo o nível chance de 50% de acertos após seis dias de treinamento
(exceto WIN, que não conseguiu associar uma cor com uma recompensa de alimentos e,
consequentemente, não mostrou aprendizagem de reversão). Enquanto os controles não tratados
melhorou ligeiramente o seu desempenho comportamental durante este período, a reversão de
aprendizagem no grupo de THC foi significativamente prejudicada. Mesmo depois de seis dias
de treinamento, os animais ainda estavam escolhendo a cor anteriormente recompensado em
mais de 80% dos ensaios. Em contraste com isto, os animais tratados com ambos os
antagonistas de CB1 foram mais flexíveis no seu comportamento e pode adaptar-se melhor ao
regime alterado. Eles alcançado o critério de aprendizagem já depois de quatro dias de formação
(Fig. 3C). Estes resultados estão de acordo com investigações feitas com mamíferos.
Rimonabant facilitou a reversão de uma discriminação olfativa aprendido anteriormente em
ratos, ao mesmo tempo que foi prejudicada pela THC.

Estudos de lesões destacou o córtex orbitofrontal (OFC) como substrato neuronal

reversão determinação de aprendizagem em ratos [64-67]. Concluiu-se que a reversão
discriminação prejudicada surgiu através de um efeito de canabinóides sobre OFC circuitos,
estar envolvido no controle de impulso e na atualização de associações afetivas entre estímulos
e valor reforço [63,68]. Especialmente destruição das projecções ascendente serotoninérgicos do
tálamo medial dorsal para o OFC prejudicada especificamente reversão discriminação no mar-
Moset (Callithrix jacchus) [69-71] e em ratos [72], sugerindo que a ascensão de entrada
serotonérgica pode ser crucialmente envolvido no flexibilidade comportamental em mamíferos.
Investigações sobre homologia funcional entre mamíferos e peixes-zebra anatomia do cérebro
definida a zona central (PC) das divisões pallial dorsal do peixe-zebra como estrutura
correspondente ao isocórtex mamíferos [16], que inclui os acima mencionados OFC. O
tubérculo posterior representa uma coleção de tálamo como estações retransmissoras em
diencéfalo caudal do peixe-zebra, com as projeções ascendentes quantitativamente mais
importantes para pallial são como incluindo Pc [73-76]. Experiências de marcação encontrado
neurônios serotoninérgicos e alta expressão do receptor CB1 no tubérculo posterior [24,77,78].
Assim, pode ser possível que a modulação cannabinergic de projeções serotoninérgicas
ascendentes do diencéfalo para o telencéfalo dorsal foram responsáveis por déficits de
aprendizagem reversa peixe-zebra.

4.3. O sistema endocanabinóide e neurotransmissores de aprendizagem e memória

Estudos anteriores sobre os mamíferos mostrou que o sistema endocanabinóide controla
seletivamente aquisição e armazenamento de memórias aversivas. Especialmente as influências
de CB1 de eliminação e os antagonistas dos receptores sobre a aprendizagem extinção após o
condicionamento do medo foram os temas de várias investigações [79-81]. Foi relatado que a
+deleção genética ou a inibição farmacológica de CB1-tarefa especificamente
interrompido aprendizagem extinção, sendo eficaz em aversivo e ineficaz em apetitivas
aprendizagem paradigmas [82] .Consequently, a activação de agonistas dos receptores CB1 por
endo- / exógenos poderia aumentar a extinção de aversivo memórias. No presente estudo, o
tratamento crônico de peixe-zebra com Rimonabant exibiram reforçada aquisição de
aprendizagens evasão, enquanto a ativação crônica do CB1 prejudicada nesse processo. Este
achado é consistente com relatórios sobre os mamíferos. A administração sistêmica da WIN
impedido eyeblink condicionamento clássico em ratinhos [83], enquanto que os animais CB1
knockout apresentaram um aumento significativo de carro quando treinado em um shuttle-box.
Diferentes hipóteses têm sido usadas para explicar os mecanismos moleculares que
determinam canabinóides induzida deficiências de aprendizagem e memória [85]. Abordagens
electrofisiológicos caracterizado agonistas CB1 para afetar a potenciação de longo prazo (LTP)
no hipocampo [86-88] e para modular redes inibitórios na amígdala [79], enquanto que os
antagonistas de maneiras opostas [89]. A acetilcolina, GABA e glutamato são três sistemas de
neurotransmissores por meio da qual pode canabinóides exercem os seus efeitos no hipocampo
e na amígdala de mamíferos [31,33,85,90-94] .Principally semelhantes aos mamíferos,
telencéfalo dorsal do peixe-zebra também contém glutamatérgica como neurónios
GABAérgicos [95,96] .Em peixe-zebra, o glutamato foi encontrado para ser essencialmente
envolvida na aprendizagem evitação inibidora de um único ensaio, bem como na discriminação
visual aprendizagem [97,98], enquanto que foi demonstrado que o piracetam, um derivado de
GABA, pode melhorar a aprendizagem espacial [99]. Ainda mais, não estão ascendendo
projeções colinérgicos do núcleo lateral ventral do telencéfalo para o Pm e Pl [100,101] que
estão envolvidos em processos de aprendizagem e memória no peixe-zebra [102]. Além disso, a
estimulação eléctrica do Pl induz plasticidade sináptica, em Pm [30], sugerindo que a
perturbação canabinóide de comunicação Pl-Pm pode inibir os processos de aprendizagem
semelhantes aos mecanismos observados entre hipocampo e amígdala em ratos [103]. Pode ser
possível que os mecanismos neuroquímicos de efeitos de canabinóides sobre a aprendizagem e
memória em peixe-zebra assemelham aos hipótese para os mamíferos. Assim, peixe-zebra pode
ser um sistema modelo promissor para o estudo da fisiologia e fisiopatologia do sistema
endocanabinóide e seu envolvimento na aprendizagem e memória.