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ANTÍGENO-ANTICORPO
Detecção, quantificação e
caracterização dos
anticorpos e seu uso como
ferramenta para pesquisa e
diagnóstico
RESPOSTA DE ANTICORPOS
Quantidade
N° de células B x taxa de síntese do Ac x persistência após sua
produção.
Isotipo
Determina a persistência (meia vida in vivo diferente).
A composição determina a função dos Ac e os locais onde são
encontrados.
Diversidade
Valência
Características das interações Ag-Ac
Avidez
Especificidade
Reação cruzada
-
Dois Ag diferentes apresentam epítopos estruturalmente
semelhantes
- Ac específicos para um epítopo se ligam a um epítopo não
relacionado, mas com propriedades químicas similares.
INTERAÇÕES
Reações reversíveis.
2) Reagentes marcados
• RIA
• ELISA
• Imunofluorescência
• Western Blotting
MÉTODOS
PRECIPITAÇÃO APLICAÇÕES
- Imunodifusão dupla
- Imunodifusão radial
- Imunoeletroforese - Pesquisa
AGLUTINAÇÃO - Diagnóstico
- Aglutinação direta e indireta - Soroepidemiologia
- Inibição da aglutinação
- Teste de Coombs
IMUNOENSAIOS
- RIA
- ELISA
- Imunofluorescência e Citometria de Fluxo
- Western Blotting
PRECIPITAÇÃO X AGLUTINAÇÃO
Precipitação:
Formação de complexos Ag/Ac.
Aglutinação:
É o agrupamento de partículas, usualmente por moléculas
de Ac que se ligam a Ag na superfície de partículas
adjacentes.
PRECIPITADO
É importante levar-se em conta como ocorre a
ligação Ag-Ac em diferentes concentrações
dos mesmos. Observe abaixo:
Anticorpo livre + - -
Antígeno livre - - +
100%--
Percentual
de
complexo
imune
Zona de excesso Zona de Zona de excesso
precipitado de anticorpo equivalência de antígeno
Quantidade de antígeno adicionado
TÉCNICAS DE PRECIPITAÇÃO EM GEL
IMUNODIFUSÃO
Imunodifusão Dupla:
Ac
IMUNODIFUSÃO DUPLA
As soluções sofrem difusão e, quando o Ag e o Ac se
encontram em zona de equivalência, se observa a reação pela
formação de uma linha de precipitação:
Pode ser visualizada pós lavagem do gel , para remoção das
proteínas solúveis, por coloração dos arcos de precipitação com
corante
Utilização: muito usada em
pesquisa e diagnóstico de
algumas doenças, como
Ag Ag cisticercose
Ac
Ag Ag Ag Ag
Ac Ac
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Precipitação em gel
Imunodifusão Dupla
IMUNODIFUSÃO RADIAL
Permite a quantificação do
antígeno ou do anticorpo.
O processo continua até ser
atingida a zona de equivalência,
com os complexos precipitando-
se em um anel (halo) em torno
do orifício.
Utilização: dosagem
Poços onde são
de IgG, IgA e IgM e
colocados padrões
proteínas séricas.
e amostras a serem
dosados
Agarose
contendo Halo de precipitação
anticorpos IgG – anti-IgG
anti-IgG humana
IMUNOELETROFORESE
Pode-se fazer comparação de misturas complexas de Ag que são
separados em gel de agarose, pela aplicação de uma corrente elétrica.
As moléculas migram para o pólo negativo, distribuindo-se no gel de
acordo com os seus PM e cargas elétricas.
Uma canaleta é recortada entre os poços e preenchida com Ac, que se
difunde.
Ag e Ac formam arcos de precipitação.
1- Separação de antígenos 2- Anti-soro na canaleta
coluna
Ag
canaleta
+ -
Ag
3- Difusão e precipitação
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REAÇÕES DE AGLUTINAÇÃO
Ac + Ag multivalente particulado
Título: maior diluição que ainda causa aglutinação
(semi-quantitativo)
Prozona: excesso de Ac
Potencial Zeta: alguns Ag podem apresentar carga
elétrica (repulsão)
Agregação visível de
partículas = Eritrócitos,
bactérias, fungos e látex
Teste de Aglutinação Passiva
Ag livres
são
agrupados
com
partículas
carreadoras
com Ac
específicos
AGLUTINAÇÃO DIRETA
Células ou partículas insolúveis + Ac = Aglutinação
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AGLUTINAÇÃO DIRETA
4) Mistura-se:
3) Controle negativo:
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AGLUTINAÇÃO DIRETA
5) Leitura do resultado:
negativo positivo
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AGLUTINAÇÃO INDIRETA (PASSIVA)
Ag solúveis associados a outras superfícies
(Partículas de látex ou superfície de hemácias)
A capacidade de
hemaglutinação de
um vírus é
bloqueada quando
esse vírus reage
com o anticorpo
específico
INIBIÇÃO DA AGLUTINAÇÃO
Exemplo: presença de hCG na urina (gravidez)
+ Resultado negativo:
Urina Soro anti - hCG (ausência de hCG na
urina).
Adicionam-se Partículas Ocorre aglutinação,
revestidas com hCG pois os anticorpos
São incubados e
colocados numa anti-hCG não são
placa bloqueados na
incubação inicial,
porque não havia o
hormônio na urina.
Resultado positivo:
(presença de hCG
Livres, podem
na urina): não ocorre aglutinar as partículas
aglutinação. revestidas de hCG.
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TESTE DE COOMBS
Ac antiimunoglobulinas (Robert
Coombs);
DHRN – mãe produz IgG anti-Rh;
Não aglutinam os eritrócitos;
Direto: Ac ligados aos
eritrócitos fetais;
Indireto: Ac anti-Rh não
aglutinantes no soro materno.
Permite detectar
incompatibilidades Rh, prevenindo
contra DHRN.
Teste de Neutralização
Os vírus infecciosos
quando interagem
com o anticorpo
específico são
neutralizados e por
conseguinte perdem a
capacidade de infectar
células permissivas
Teste de Fixação do Complemento
O complemento, um
agente lítico, é fixado
por um complexo Ag-
Ac.
1ª fase: o Ac, Ag e o
complemento são
misturados e
incubados.
2ª fase: O complexo
formado por hemácia-
Ac anti-hemácia é
adicionado a mistura
IMUNOENSAIOS
Reagentes marcados (enzimas,
fluorocromos, isótopos)
Tipos:
- RIA
- ELISA
- IFA / CITOMETRIA DE FLUXO
- WESTERN BLOTTING
IMUNOFLUORESCÊNCIA (IFA)
Princípio da técnica:
fluorescência emitida
luz UV atinge o ma- chega ao observador
terial examinado
Teste de Imunofluorescência Direta
Um conjugado de
especificidade
conhecida é adicionado
às células infectadas
por vírus que estão
fixados numa lâmina de
microscópio, ocorrendo
formação de complexo
Ag-Ac que é
visualizado pela
imunofluorescência
Imunofluorescência Direta
Aplicações:
- Detecção direta de microrganismos
(secreções, urina, cortes de tecidos);
- Identificação de subpopulações de
linfócitos;
- Fenotipagem de células tumorais
Aplicações:
- Detecção de anticorpos específicos contra
diversos microrganismos;
- Diagnóstico de doenças auto-imunes;
Fosfatase alcalina
Peroxidase
B-galactosidase
Vantagens:
Teste de alta sensibilidade
Permite quantificar Ag ou Ac das amostras
Seguros e de baixo custo
RADIOIMUNOENSAIO - RIA
Marcações:
I125: emite raios gama
Aplicações:
Triagem vírus da hepatite B em doadores de sangue, Hormônios,
proteínas séricas, drogas, vitaminas e Ac. Pesquisa
Radioimunoensaios
Utilizam Ac conjugados com radioisótopos
para quantificar os ensaios.
• Vantagens:
– Reprodutibilidade
– Alta sensibilidade(em torno de 10-12g)
– Especificidade
– Permite medidas rápidas e precisas
• Desvantagens:
– Custo
– Vida média dos reagentes
– Risco operacional (radiação)
Eletroforese
Consiste na separação,
através do tamanho molecular,
dos segmentos genômicos dos
microrganismos em gel . Os
seguimentos podem ser
visualizados após a coloração
do gel.
WESTERN BLOTTING