Agropecuária Técnica, v. 25, n.

1, 2004

ISSN 0100-7467 - Areia, PB, CCA/UFPB

REVISÃO BIBLIOGRÁFICA

MÉTODOS PARA QUANTIFICAÇÃO DA BIOMASSA

MICROBIANA DO SOLO

MARINICE O. CARDOSO
1

Doutoranda em Agronomia do CCA/UFPB, Campus II, Areia – PB, CEP: 58397-000

1

RESUMO

A biomassa microbiana do solo (BMS) é o principal componente do subsistema de decompositores, que regula

a ciclagem de nutrientes, o fluxo de energia, a produtividade das plantas e dos ecossistemas. Portanto, sua

quantificação é de grande importância para estudos sobre a melhoria ou perda da qualidade do solo. Para quantificação

da BMS muitas e diversificadas técnicas foram criadas. Nos métodos pioneiros contavam-se células microbianas

pela observação direta de lâminas de solo ao microscópio. Foram introduzidas, posteriormente, melhorias como o

uso de corantes vitais e o cálculo da biomassa através do biovolume celular e da densidade média das estruturas

vivas. Outros métodos, baseados na extração e determinação de algum componente celular específico (ácido

murâmico para bactérias, quitina para fungos e ATP para a biomassa total, entre outros) surgiram em grande

número. Entretanto, atualmente, os métodos da respiração induzida pelo substrato, da fumigação-incubação e da

fumigação-extração são os mais utilizados para a quantificação da BMS. Nesta revisão, os principais métodos são

apresentados e discutidos quanto à utilidade e confiabilidade.

Palavras-chave: microscopia direta, constituintes celulares, respiração induzida, fumigação-incubação, fumigação-extração

METHODS FOR QUANTIFYING SOIL MICROBIAL BIOMASS

ABSTRACT

Soil microbial biomass (SMB) is the main component of the decomposers subsystem that regulates nutrient

cycling, energy flow, and productivity of plants and ecosystems. Thus, its quantification is of great importance for

studies aiming to improve or to prevent loss of quality of soils. SMB quantification can be performed by many and

diverse techniques. In the early methods, microbial cells were counted through direct observation of soil smear

(soil samples spread on a microscope slide), under optical microscopy. Lately, improvements were introduced by

using vital stains and subsequent calculation of biomass from cell biovolume and average density of living structures.

Other methods based on extraction and determination of specific cell constituents (muramic acid of bacteria, chitin

of fungi, and ATP of total biomass, among others), appeared to a large extent. However, the current methods of

substrate-induced respiration, and fumigation-incubation and fumigation-extraction, are the most utilized methods

for quantifying SMB. In the present review, the main methods are presented and discussed with respect to their

usefulness and reliability.

Key words: direct microscopy, cellular constituents, induced respiration, fumigation-incubation, fumigation-extraction

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2 M. O. CARDOSO

INTRODUÇÃO 1994), visto que a BMS não é uma estimativa da

atividade dos microrganismos do solo, mas da massa

A biomassa microbiana do solo (BMS) compreende microbiana viva total do solo, com base na concentração

a parte viva da matéria orgânica do solo, excluídas as de algum elemento ou de alguma substância celular,
raízes e organismos maiores do que 5 x 10 µm ,
3 3
considerando-se a população microbiana como uma
contendo, em média, 2 a 5% do carbono orgânico e 1 a entidade única (De-Polli e Guerra, 1999). Ressalva-se
5% do nitrogênio total do solo (Cerri et al., 1992; De-
que as atividades de algumas enzimas podem ser
Polli e Guerra, 1999). Operacionalmente, a BMS atua
relacionadas com a BMS e são auxiliares na
como agente de transformação da matéria orgânica, na
interpretação da condição funcional da BMS total ou de
ciclagem de nutrientes e no fluxo de energia (Wardle e
algum compartimento (Marchiori Júnior e Melo, 1999;
Giller, 1996; Marchiori Júnior e Melo, 1999). A dupla
Taylor et al., 2002; Matsuoka et al., 2003).
função da BMS, de fonte/dreno de nutrientes e de
As possibilidades metodológicas existentes para
catalisador pela execução de processos enzimáticos no
avaliação da BMS são várias e contemplam diferentes
solo, é amplamente aceita (Duxbury et al., 1989; Templer
abordagens. Alguns métodos bastante utilizados têm sua
et al., 2003). A BMS compreende uma fonte potencial
confiabilidade questionada, porque sofrem influência das
de N, P, S e outros nutrientes para as plantas, e os fluxos

através do reservatório microbiano podem ser de condições experimentais (Rodrigues et al., 1994;

particular relevância no solo (De-Polli e Guerra, 1999; Gonçalves et al., 2002). Neste trabalho, foi realizada

Kouno et al., 2002). Através da rápida imobilização de uma revisão de literatura sobre esses métodos, que são

nutrientes, que pode reduzir a disponibilidade de discutidos quanto aos vários aspectos de sua utilidade e

nutrientes para as plantas, a BMS funciona como dreno limitações.

competitivo (Duxbury et al., 1989).

Antecedentes
Constituindo a maior parte da fração ativa da matéria

orgânica, a BMS pode ser enquadrada como o O aumento do interesse em microrganismos de solo

compartimento central do ciclo do carbono, sendo mais e, paralelamente, a necessidade de isolamento,

sensível que o resultado quantitativo do C orgânico e do identificação e enumeração desses agentes

N total para aferir alterações na matéria orgânica do transformadores da matéria orgânica do solo, resultaram

solo (Gama-Rodrigues, 1999). A relação C : na criação e diversificação de muitas técnicas.

microrganismos

C total do solo aumenta e diminui rapidamente Inicialmente, as investigações em bacteriologia de solo

orgânico

conforme ocorram elevação ou redução da matéria foram realizadas com métodos desenvolvidos em

orgânica do solo num sistema ecológico, e a constância bacteriologia médica: amostras de solo eram diluídas com

dessa relação indica o novo equilíbrio desse sistema água esterilizada, disseminadas em placas com gelatina

(Anderson e Domsch, 1989). O estudo quantitativo da e, após incubação, determinava-se o número de bactérias

BMS é de fundamental importância para o estudo da (Grisi, 1984).

extensão dos processos no solo em que atua, bem como

Posteriormente, foi introduzido o método de diluição
para monitoramento e aplicação de modelagens (Leal e
em placas para contagem de bactérias do solo. Nessa
De-Polli, 1999; Turner et al., 2001; Wang et al., 2003).
técnica, diluições da amostra do solo são adicionadas a
Como parâmetro ecológico, a avaliação da BMS permite
tubos contendo meio liquefeito e resfriado, e
obter informações rápidas sobre mudanças nas
posteriormente o conteúdo desses tubos é distribuído
propriedades orgânicas do solo, detectar mudanças
em placas de Petri, e a partir do número de colônias
causadas por cultivos ou por devastação de florestas,
desenvolvidas na placa, é calculado o número de
medir regeneração dos solos após a remoção da camada
organismos vivos por grama de solo (Jackson e Raw,
superficial, e avaliar os efeitos dos poluentes como
1975; Pelczar Jr. et al., 1996; Melloni et al., 2001). Em
metais pesados e pesticidas entre outros (Frighetto,
seguida, por adaptação, foi introduzida a técnica de
2000).
plaqueamento para isolamento de fungos de solo

Até o início da década de 90, os trabalhos sobre BMS (Jackson e Raw, 1975; Grisi, 1984). O método de

tratavam, principalmente, de ajustes metodológicos plaqueamento por gotas é recomendado por Jahnel et

(Gama-Rodrigues, 1999). Neste sentido, deve-se al. (1999) para determinação do número mais provável

distinguir a biomassa de sua atividade (Siqueira et al., de fungos e bactérias do solo.

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 MÉTODOS PARA QUANTIFICAÇÃO DA BIOMASSA MICROBIANA DO SOLO 3

O desenvolvimento de técnicas microscópicas para necessárias para discriminar microrganismos vivos de

exame de microrganismos provenientes de amostras dos mortos, bem como muitas vezes é difícil distinguir

ambientes naturais ocorreu no início do século XX. Os partículas microscópicas do solo de células microbianas
primeiros métodos utilizados consistiam na contagem do (Casida, 1976; Grisi e Gray, 1985; Scheu e Parkinson,
número de células microbianas pela observação direta
1994). Na microscopia direta, os microrganismos podem
de lâminas de solo ao microscópio, sendo introduzido
ser corados por várias formas e observados por
depois o uso de corantes vitais, bem como o cálculo da
diferentes técnicas ópticas (Casida, 1971). Para solos
biomassa através da determinação dos volumes celulares
bem drenados, este método é freqüentemente utilizado
e da densidade média das estruturas vivas (Grisi, 1984;
como padrão, sendo a expectativa geral de que todos os
Grisi e Gray, 1985).
demais métodos apresentem boa correlação com o

Na impossibilidade da obtenção de uma medida mesmo (Seganfredo, 1999).

quantitativa exata da população microbiana total em um

ecossistema, por métodos culturais ou por meio da - Método do trifosfato de adenosina (ATP)

observação microscópica direta, foram desenvolvidas

outras técnicas capazes de avaliar a massa dos Este método inclui-se num grupo de métodos que se

microrganismos, ou seja, a BMS (Pelczar et al., 1980; baseia, para estimar a BMS, na extração e determinação

Haubensak et al., 2002). de constituintes celulares específicos de microrganismos,

como por exemplo, o ácido murâmico, a quitina, a

Métodos para quantificação da biomassa clorofila, ácidos nucléicos e outros, bem como, no caso,

microbiana o trifosfato de adenosina (Grisi, 1984). A técnica do ATP

vem sendo utilizada para estimar a BMS (Tate e

Os métodos da microscopia direta, do trifosfato de
Jenkinson, 1982), em razão de algumas características
adenosina, da respiração induzida pelo substrato, da
favoráveis deste constituinte celular: é degradado
fumigação-incubação e da fumigação-extração são os
rapidamente após a morte das células dos
mais utilizados para quantificação da BMS, destacando-
microrganismos, facilitando a separação entre
se os dois últimos. Convém mencionar a técnica de análise
microrganismos vivos e mortos, além de não ser
de PLFAs (phospholipid fatty acids) totais extraídos para
confundido com as moléculas de ATP provenientes de
estimar a BMS, que tem gerado valores proporcionais
fragmentos de raízes; está presente nas diferentes células
aos obtidos por outros métodos (Fritze et al., 2000; Bailey
microbianas (bactérias, fungos, algas e protozoários); e,
et al., 2002; Fierer et al., 2003). Os métodos de extração
a sua concentração nas células é razoavelmente
dos componentes celulares baseiam-se no fato de que a
uniforme em relação à concentração de carbono celular
célula microbiana quiescente mantém as seguintes
(De-Polli e Guerra, 1999), apontada como sendo de 1:
relações, segundo Paul e Clark (1989): ATP: C: N: P: S,
250 (Paul e Clark, 1989). O método está fundamentado
respectivamente, 1: 250: 40: 9: 2,6.
no princípio de que o ATP pode ser quantificado através

do sistema enzimático luciferina-luciferase (Oades e

- Microscopia direta
Jenkinson, 1979), tendo sido melhorado por Tate e

Jenkinson (1982). O ATP oriundo das células vivas é

No exame microscópico direto, uma diluição da
extraído com solução de H SO 0,3 mol L , ou outros
-1

amostra do solo é espalhada em camada fina sobre uma 2 4

extratores com eficiências de recuperação variáveis, e

lâmina de vidro, e após fixação e coloração do esfregaço,
a emissão luminosa do material, na presença do sistema
os microrganismos podem ser contados pelo exame
enzimático, é medida através de fotômetros comerciais
microscópico (Pelczar Jr. et al., 1996). Como o princípio
disponíveis para esta situação, sendo a quantidade de
básico da metodologia é estimar a biomassa microbiana
luz emitida proporcional à concentração de ATP no
através do biovolume dos microrganismos, há
extrato (De-Polli e Guerra, 1999).
necessidade da estimativa da densidade específica e do

conteúdo de umidade dos microrganismos, para

- Respiração induzida pelo substrato ou fisiologia
conversão de biovolume a biomassa (Alexander, 1977;
da taxa de respiração
Grisi e Gray, 1985; De-Polli e Guerra, 1999). Embora

esse método possa ser utilizado para estimar a população Esse método, proposto por Anderson e Domsch

microbiana total, técnicas de colorações especiais são (1978), é baseado no aumento inicial da taxa de

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respiração da população microbiana, até um máximo, adição da glicose em diferentes solos, visto que em alguns

quando uma fonte de carbono, prontamente ocorre um aumento rápido na respiração, enquanto em

decomponível, é adicionada em excesso ao solo. A fonte outros verifica-se inicialmente uma queda e depois uma

usual é a glicose porque a maioria dos microrganismos elevação da respiração (Anderson e Domsch, 1978; Lin

pode utilizá-la imediatamente como fonte de carbono e Brookes, 1999).

(Grisi, 1984; Lin e Brookes, 1999). O aumento da taxa

- Fumigação-incubação
respiratória (liberação de CO ), antes que o crescimento
2

microbiano ocorra, é acompanhado por algumas horas,

O método de fumigação-incubação se fundamenta
realizando-se em seguida, a conversão para a biomassa.
na ocorrência dos seguintes eventos: interrupção da
Entretanto, há necessidade de calibração, com um
atividade microbiana de uma dada amostra de solo pela
método padrão, para a determinação da biomassa
fumigação com clorofórmio (CHCl ), livre de álcool, que
(Anderson e Domsch, 1978). Originalmente, o flush de 3

provoca o rompimento da célula, seguido por um pico

CO , gerado durante um período de incubação
de CO , devido à decomposição dos organismos mortos
2

predeterminado, foi correlacionado com a BMS, mas a

2

pelos sobreviventes à fumigação, ou pelas novas

equação obtida é válida somente nas condições de
populações a partir de um inóculo de solo fresco
proposição, isto é, mineralização entre 0,35 e 6,5 ml de
introduzido na amostra fumigada (Jenkinson, 1966).
CO 100 g de solo h e temperatura de 22 ± 0,5 C
-1 -1 o

(Anderson e Domsch, 1978). Alternativamente à Os procedimentos envolvem a medida da emanação

proposta original, o uso da glicose sólida foi substituído de CO devido à decomposição da população microbiana
2

por solução de glicose e o analisador de gás para medir na amostra fumigada, e em uma amostra testemunha,

o CO respirado por cromatógrafo a gás (Sparling e não-fumigada (Rodrigues et al., 1994). A biomassa,
2

West, 1988; Lin e Brookes, 1999) ou respirômetro representada pelo carbono microbiano, pode ser

automatizado a partir de microcompensação de O estimada pela relação B = C / k , onde C = C-CO

I CI I 2
2

eletrolítico (Tiunov e Scheu, 2000). Este método facilita liberado do solo fumigado no período de 10 dias de

incubação menos o C-CO liberado do solo testemunha

de modo particular a avaliação do quociente metabólico 2

(Pfenning et al., 1992; Wang et al., 2003). Este termo

ou taxa de respiração específica, que permite verificar
(k ) corresponde ao fator de mineralização do C, isto
o estado de equilíbrio do solo (Wardle, 1994; Mercante, C1

é, à proporção de carbono microbiano liberado na forma

2001). O quociente metabólico microbiano (qCO ) é
2

de CO nos 10 dias de incubação, e é de 0,41 à

calculado como a razão da respiração microbiana em 2

temperatura de 22 C e 0,45 a 25 C (Anderson e Domsch,

o o

relação à biomassa, ou seja, como a quantidade de C-

1978; Siqueira et al., 1994).
CO produzido por unidade de C da biomassa microbiana
2

(Thirukkumaran e Parkinson, 2000; Tiunov e Scheu, No método de fumigação-incubação, o fator k não

C1

2000; Mercante, 2001). é precisamente o mesmo para todos os solos (Stevenson

e Elliott, 1989), e no caso de solos muito diferentes

De acordo com Wardle (1994) é esperado que
daqueles utilizados na determinação dos valores de k
apenas os microrganismos ativos respondam à adição C1

tradicionalmente usados, ele deverá ser determinado para

de glicose, que é justamente o componente de maior
cada tipo de solo (Wardle, 1994). Entretanto, um fator
interesse para os microbiologistas do solo, pois é esse
médio de 0,41 foi proposto para amostras de alguns solos
componente que está reciclando ativamente os nutrientes
no Brasil, visto que o mesmo tende a ser mais baixo em
e é responsável pela decomposição dos restos culturais.
solos ácidos e de textura argilosa das zonas tropicais
Por esta razão, esse método pode ser extremamente
(Sampaio et al., 1986; De-Polli e Guerra, 1999). A
útil como medida relativa da biomassa microbiana. A
respeito do fator de correção, Voroney e Paul (1984)
quantidade de glicose requerida para ativar a máxima
estudaram sua determinação “in situ” para calibração
taxa respiratória inicial varia grandemente, dependendo
desse método. Os procedimentos sobre o método de
das propriedades físicas e químicas dos solos, devendo
fumigação-incubação encontram-se descritos
ser determinada para cada tipo de solo (Lin e Brookes,
detalhadamente em De-Polli e Guerra (1999) e
1999; Fisk et al., 2003). Um grave erro técnico quanto a
Matsuoka et al. (2003).
este método é a realização de medidas de taxas de

respiração após o crescimento microbiano, devendo-se Brookes et al. (1985) e Stevenson e Elliott (1989)

atentar para o fato de que há variações na resposta à explicam a determinação do N da BMS pelo método de

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 MÉTODOS PARA QUANTIFICAÇÃO DA BIOMASSA MICROBIANA DO SOLO
fumigação-incubação e afirmam que o maior problema
para sua estimativa é a desnitrificação ou imobilização
poder alterar as quantidades de N calculadas para as
formas solúveis após a incubação. Portanto, é mais
conveniente mensurar o N da BMS pela fumigação-
extração 24 horas após a fumigação (Brookes et al.,
1985).
- Fumigação-extração
• Carbono da biomassa microbiana
Como alternativa promissora à técnica de fumigação-
i n c u b a ç ã o , Va n c e et al. (1987a) propuseram
substituição da incubação por uma extração do carbono
da biomassa, que é igualmente liberado pela ação do
agente fumigante clorofórmio. Segundo esses autores,
a biomassa microbiana é proporcional ao aumento de
carbono orgânico que se torna extraível do solo após
uma fumigação. Convém ressaltar que a correção da
umidade do solo para 40% da sua capacidade de
saturação é parte do procedimento metodológico, quando
da preparação das amostras de solo para fumigação
(Grisi, 1997), o que é adotado também no método de
fumigação-incubação, antes comentado. A fumigação
do solo com o clorofórmio, além de matar, rompe as
células microbianas liberando o constituinte microbiano
para o solo e permitindo assim sua extração (Frighetto,
2000). O carbono representa cerca de 47% do peso
seco da célula microbiana.
Em termos de procedimento, a amostra é dividida
em subamostras que sofrerão extração imediata (o
controle, sem fumigação) ou fumigação seguida de
extração. O extrato da amostra não-fumigada contém
somente a matéria orgânica extracelular e o extrato
fumigado contém ambos, matéria orgânica intracelular
(biomassa) e matéria orgânica extracelular (Hofman e
Dusek, 2003). O material celular liberado pelo
rompimento das células microbianas é recuperado com
um extrator fraco como o K SO 0,5 M (Tate et al.,
2 4
1988) logo após a fumigação, eliminando-se os dez dias
de incubação do método anterior; e a determinação do
carbono nos extratos fumigado e não-fumigado é feita
por dicromatometria a partir da retirada de uma alíquota
do extrato (Vance et al., 1987a; De-Polli e Guerra, 1999).
Numa modificação do procedimento de fumigação-
extração originalmente proposto, o analisador de carbono
Dohrman DC-180 é utilizado para quantificação do C
extraído (Wu et al., 1990; Aoyama et al., 2000;
5
Hargreaves et al., 2003), ou o analisador de C solúvel
Shimadzu TOC-5000A (Bailey et al., 2002; Zimmermann
e Frey, 2002).
A biomassa, representada pelo carbono microbiano,
pode ser estimada pela relação B = C x 2,64 ou
E
B = C / 0,38, onde C representa o carbono extraído
E E
do solo fumigado menos o carbono extraído do solo
controle (Pfenning et al., 1992), sendo 2,64 ou 0,38, o
fator k para conversão do carbono extraído em
CE
biomassa microbiana (Vance et al., 1987b). Este último
valor de k encontra-se no intervalo proposto (0,33 ±
CE
0,08) por Sparling e West (1988) para solos minerais
a com baixo pH e menos de 10% de carbono orgânico,
recomendação correntemente utilizada (Tate et al.,
1988), inclusive em solos do Brasil para os quais o fator
k não foi determinado (De-Polli e Guerra, 1999).
CE
Os procedimentos para execução da técnica de
fumigação-extração foram explicados detalhadamente
por De-Polli e Guerra (1999) e Frighetto (2000). Na
etapa de fumigação, Ferreira et al. (1999) utilizaram a
irradiação do forno de microondas em substituição ao
clorofórmio, e concluíram que a irradiação durante dois
minutos foi suficiente para estimar o C, e também o N,
presente na biomassa microbiana nos procedimentos de
incubação e extração. Na fase de pré-condicionamento,
para estimar o C e o N da BMS, Roy e Sing (2003)
deixaram as amostras de solo com a umidade do campo
em um recipiente fechado com 100% de umidade, e
com o CO removido, por sete dias em temperatura
2
ambiente, sendo o mesmo aberto diariamente por alguns
minutos para aeração.
• Nitrogênio, fósforo e enxofre da biomassa
microbiana do solo
Os métodos de quantificação da BMS geralmente
baseiam-se na estimativa do C microbiano, pela maior
facilidade na quantificação devido ao seu teor ser mais
elevado na célula. O N, P e S microbianos também
podem ser determinados por fumigação-extração no
mesmo extrato de solo (Brookes et al., 1985; De-Polli e
Guerra, 1999; Roy e Sing, 2003). De acordo com Turner
et al. (2001), a técnica de absorvância ultravioleta (UV)
em 280 nm de extratos de K SO 0,5 M de solos
2 4
fumigados e não-fumigados, para estimar a concentração
de C, N e P da biomassa microbiana, revelou-se rápida,
simples, precisa e relativamente barata para estimar a
BMS, visto que os resultados foram fortemente
correlacionados com aqueles determinados pelos
métodos convencionais.
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Na metodologia convencional, o N da biomassa é valor absoluto, em diferentes condições edafoecológicas.

avaliado à maneira do C da biomassa, mas usando o Dessa forma, é mais conveniente, sempre que possível,

fator k , que tem dois valores amplamente utilizados, a utilização de mais de um método para estudos sobre a
EN

0,45 e 0,54 (Wardle, 1994), sendo 0,54 o do método biomassa microbiana (Gama-Rodrigues, 1999). Os

original. O conteúdo de N microbiano é quantificado métodos extrativos não apresentam os problemas

em extrato de K SO 0,5 M (relação solo:extrator de daqueles que dependem do crescimento microbiano, mas
2 4

1:4, extração por 30 minutos e análise após digestão de estão muitas vezes sujeitos à variabilidade da eficiência

Kjeldahl) a partir do fluxo de N solúvel total de amostras de extração e rompimento das células (Frighetto e

fumigadas e não-fumigadas, e o cálculo é dado pela S c h n e i d e r, 2000). Entre pares de métodos, as

seguinte fórmula: N (mg kg ) = FN / k , sendo N - correlações através de diferentes amostras de solos, ou

-1

mic t N mic

nitrogênio microbiano do solo; FN - fluxo obtido da tipos de solos, são altamente variáveis, sendo razoável
t

diferença entre a quantidade de N total recuperado no esperar que equações de calibração derivadas a partir

extrato da amostra fumigada e o recuperado na amostra de ampla faixa de valores abrangendo maior área

não fumigada; e k - fator de correção (0,54), que geográfica sejam mais consistentes do que na faixa
N

expressa a fração do N da biomassa microbiana do solo estreita de pequena área geográfica (Wardle e Ghani,

recuperada após os processos de fumigação-extração 1985). Smolander et al. (1994) e Fierer et al. (2003)

(Brookes et al., 1985; Joergensen e Mueller, 1996). A discutem em suas pesquisas as razões de estimativas

oxidação de persulfato alcalino para determinação distintas da BMS com os métodos que utilizaram:

automática do N total em extratos da biomassa respiração induzida pelo substrato, fumigação-extração

microbiana, através do autoanalisador Scalar-UV, é e PLFAs totais.

também utilizada (Cabrera e Beare, 1993; Friedel e

Algumas críticas específicas sobre esses métodos
Scheller, 2002).
são apresentadas abaixo:

Procedimentos similares de fumigação-extração,

Microscopia direta. Este método pioneiro é raramente
acima mencionados, têm sido usados para determinação
utilizado em amostras naturais de solo porque apresenta
do P e S da BMS. Para o P da biomassa, o método
enorme dificuldade operacional e maior tempo de
prevê a extração do P inorgânico disponível com resina,
execução dos procedimentos. Entretanto, é útil quando
antes do processo de fumigação com clorofórmio e
se comparam diferentes metodologias para aferição da
extração com NaHCO 0,5 M em pH=8,5; e, fator de
3 biomassa (Martens, 1995; De-Polli e Guerra, 1999). A
correção k =0,4, para compensar a incompleta liberação
p dificuldade para discriminação entre microrganismos
do P microbiano pela fumigação com clorofórmio e a
vivos e mortos se torna uma limitação, visto que na
incompleta extração do P microbiano liberado pelo
estimativa da biomassa microbiana do solo deve ser
extrator, que é somente de 40%; bem como requer o
considerada a massa viva de microrganismos, além de
ajuste na capacidade de adsorção de P pelo solo ser difícil diferenciar partículas microscópicas do solo
(Stevenson e Elliott, 1989; Guerra et al., 1995; Morel et de células microbianas (Casida, 1976; Pelczar Jr. et al.,
al., 1996; Rheinheimer et al., 2000; Conte et al., 2002). 1996).

Uma proposição adaptada para medida do P da BMS,

Método do trifosfato de adenosina (ATP). Apesar da
para solos com alta capacidade de fixação de P, foi a da
variação entre o conteúdo do ATP e o do C da BMS,
membrana de troca de ânions (Kuono et al., 1995). E,
tem possibilitado resultados válidos quando sua execução
dois extratores têm sido utilizados para determinar o S
é cuidadosa. Algumas dificuldades estão a ele associadas
da biomassa, NaHCO 0,1 M e CaCl 0,01 M, com
3 2
como a extração incompleta de ATP das células, a
valores de k de 0,41 e 0,35, respectivamente (Saggar
s
decomposição enzimática, ou a hidrólise química do ATP
et al., 1981; Stevenson e Elliott, 1989).
durante o processo de extração, bem como a adsorção

dessa molécula pelos colóides inorgânicos do solo

Limitações associadas aos métodos
(Martens, 1995). Também, Brookes e Jenkinson (1989)

Muito se discute ainda sobre a confiabilidade dos consideram que os valores de ATP podem não ser

atuais métodos, principalmente quando se deseja estimar indicadores fiéis do estado metabólico de um organismo

a biomassa dos microrganismos “in situ”, de maneira ou de uma população, visto que apenas uma parte da

mais próxima da realidade, ou seja, estimando-se seu população poderá estar em crescimento, e admitem como

Agropecuária Técnica, v.25, n.1, p.1-12, 2004

 MÉTODOS PARA QUANTIFICAÇÃO DA BIOMASSA MICROBIANA DO SOLO 7

melhor indicador a carga energética de adenilato, dada população microbiana (Pfenning et al., 1992; Messias

por [(ATP) + 0,5 (ADP)] / [(ATP) + (ADP) + (AMP)]. et al., 1999). O alto teor de argila protege a matéria

Seu valor, a partir de dados de vários autores é na faixa orgânica da decomposição e torna os microrganismos

de 0,8 a 0,95 (Grisi, 1996). menos ativos pelo confinamento em pequenos poros

( Wa n g et al., 2003), o que pode interferir na

Respiração induzida pelo substrato. É considerado
reconstituição da população microbiana. Também foi
um método prático e rápido para estimar a quantidade
sugerido que as populações microbianas inoculadas nas
de m i c r o rg a n i s m o s vivos do solo. A principal
amostras fumigadas não são capazes de metabolizar
desvantagem deste método está relacionada com o fator
matéria orgânica não-microbiana tão rapidamente
de conversão, que pode variar sensivelmente em
quanto as nativas do solo não-fumigado, o que leva à
diferentes tipos de solo (Grisi, 1984). Por outro lado,
subestimação da biomassa microbiana (Siqueira et al.,
quantifica preferencialmente o rápido crescimento
1994). Esse método, na sua forma padrão, não é
microbiano, ou seja, a porção zimógena da comunidade
adequado para solos alagados, porém Inubushi et al.
microbiana, visto que é aceito ser a BMS proporcional
(1984) sugeriram algumas adaptações para solos sob
à taxa de respiração de curto prazo, medida após a adição
estas condições.
de um substrato lábil, como a glicose, ao solo (Fierer et

al., 2003). Ta m b é m , o seu emprego requer a Fumigação-extração. Neste método, pelo fato da

disponibilidade de equipamento que possa determinar fumigação ser seguida, de imediato, pela extração do

acuradamente o CO respirado (Wardle, 1994). Sobre carbono das amostras, são evitados os fatores químicos
2

isto, Hashimoto (2002) descreveu um método simples e/ou biológicos que interferem na reconstituição da

para medição de um volume pequeno do gás CO usando população microbiana, responsável pelo aumento da
2

um analisador de gás infravermelho, tanto para liberação de CO das amostras fumigadas, como ocorre
2

laboratório como para condições de campo. na fumigação-incubação; os resultados são, portanto,

obtidos mais rapidamente e com menores variações entre

Fumigação-incubação. Diferentes autores fazem
as repetições, o que se reflete em coeficientes de
referência à marcante influência dos fatores ambientais
variação baixos (Pfenning et al., 1992). Os valores do
neste método. Ele não é recomendado para solos ácidos
fator de correção do carbono extraído (k ) não foram
com elevado teor de Al (Siqueira et al., 1994), ou solos
CE

exatamente determinados para solos tropicais (Pfenning

com recente adição de matéria orgânica, que provoca
et al., 1992; De-Polli e Guerra, 1999). Esse método é
uma subestimativa da biomassa microbiana do solo
particularmente útil em solos ácidos e orgânicos de
(Jenkinson, 1966; Sampaio et al., 1986; De-Polli e Guerra,
florestas e em solos secos reidratados, onde o método
1999), bem como aqueles da rizosfera de pastagem
de fumigação-incubação mostra limitações (Wardle,
permanente e solos sob encharcamento ou seca (Tate
1994). O método encontra-se bem padronizado em seu
et al., 1988). Em solos muito secos, a fumigação afeta
protocolo laboratorial por diferentes usuários (Frighetto,
pouco os microrganismos (Frighetto, 2000), e em solos
2000; Gonçalves et al., 2002). Contudo, Haubensak et
encharcados a água poderá proteger os microrganismos,
al. (2002) concluíram pela necessidade de mais estudos
que não são destruídos pelo clorofórmio (Siqueira et al.,
quanto ao tempo de exposição ao clorofórmio, em
1994). Neste sentido, Stevenson e Elliott (1989) afirmam
diferentes condições de umidade, para solos
que o mesmo é inadequado para análises de solos secos
contrastantes de florestas, pois o tempo de exposição
ao ar. Por outro lado, quando uma grande proporção de
afeta a extração de C e N de distintos compartimentos
massa microbiana do solo foi morta pela seca, antes da
da matéria orgânica do solo. Em relação à condição de
amostragem, ocorrerá um fluxo de CO no período de
2 transporte, armazenagem e pré-condicionamento da
zero a 10 dias (estabelecido no método), devido à
amostra anteriormente à fumigação, as regras não estão
decomposição dos microrganismos mortos, sendo
bem definidas (Gonçalves et al., 2002). Por exemplo, os
essencial uma testemunha não-fumigada (Wardle, 1994). efeitos da secagem ao ar sobre bactérias e fungos

Igualmente, em solos com alto teor de argila aliado à dependem dos materiais do solo (Scheu e Parkinson,

umidade foram encontradas dificuldades para 1994). E o pré-condicionamento de curta duração de

determinação da biomassa microbiana com o uso dessa amostras, como terra fina secada ao ar (TFSA), teve

técnica, onde, provavelmente, as aludidas condições dos resultados promissores somente quando níveis e períodos

solos tenham interferido na homogeneidade da adequados de reumedecimento foram adotados

fumigação e na capacidade de reconstituição da (Gonçalves et al., 2002).

Agropecuária Técnica, v.25, n.1, p.1-12, 2004

8 M. O. CARDOSO

CONSIDERAÇÕES FINAIS B A I L E Y, V.L.; PEACOCK, A.D.; SMITH, J.L.;

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Embora as possibilidades metodológicas existentes, biomass determined by chloroform fumigation-extration,

para avaliação da BMS, sejam várias e com diferentes substrate-induced respiration, and phospholipids fatty

abordagens, ainda não são técnicas de fácil manipulação. acid analysis. Soil Biology & Biochemistry, v.34, n.9,

Os métodos mais recentes, da fumigação-incubação e p.1385-1389, 2002.

fumigação-extração, têm sido preferidos por serem, de

BROOKES, P.C.; LANDMAN, A.; PRUDEN, G.;
certa forma, de uso mais fácil e de possibilitarem o
JENKINSON, D.S. Chloroform fumigation and the
acesso às quantidades dos elementos contidos dentro
release of soil nitrogen: a rapid direct extraction method

da BMS. No entanto, não deve ser esperado que esses to measure microbial biomass nitrogen in the soil. Soil

métodos apresentem a precisão e exatidão dos métodos Biology & Biochemistry, v.17, n.6, p.837-842, 1985.

de análises químicas. As informações sobre calibração

BROOKES, P. C . ; JENKINSON, D . S . ATP a n d
desses métodos para solos tropicais ainda são
adenylate energy charge levels in the soil microbial
insuficientes, e em muitos trabalhos de pesquisa
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continuam sendo utilizados fatores de correção dos
SMITHER, R. (Eds.) ATP luminescence. Rapid
métodos originais, gerados em condições temperadas.
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Comumente são identificadas dificuldades técnicas dos
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métodos mais utilizados para quantificação da BMS que
CABRERA, M.L.; BEARE, M.H. Alkaline persulfate
necessitam ser superadas. Portanto, ainda existem
oxidation for determining total nitrogen in microbial
lacunas que devem ser preenchidas no tocante à
biomass extracts. Soil Science Society of America
melhoria das metodologias para determinação da BMS.
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Existe uma expectativa de que, posteriormente, as

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