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Imagen Molecular de macrófagos infiltrantes de tumores, en un modelo de ratón preclínicos de

cáncer de mama

evidencia significativa ha indicado que los macrófagos asociados al tumor (TAM) desempeñan un
papel crítico en la proliferación, la invasión, la angiogénesis y la metástasis de una variedad de
carcinomas humanos. En este estudio, se investigó si la imagen de fluorescencia en el infrarrojo
cercano (NIRF) utilizando un receptor de manosa de los macrófagos (MMR; CD206) agente -
targeting podría ser utilizado para visualizar de forma no invasiva y cuantificar los cambios en TAM
en vivo. El agente NIRF CD206-focalización, Tinte-anti-CD206, se preparó y se caracterizó in vitro e
in vivo. Mediante el uso de imágenes NIRF, hemos sido capaces de no invasiva macrófagos
infiltrantes de tumor de imagen en el modelo de cáncer de mama 4T1 de ratón. Es importante
destacar que, de formación de imágenes NIRF longitudinal reveló el agotamiento de los
macrófagos en respuesta a tratamiento con ácido zoledrónico (ZA). Sin embargo, ZA solo no dio
lugar a la inhibición del crecimiento tumoral 4T1. por lo tanto, se combinaron anti-macrófagos ZA
terapia y tumor citotóxico docetaxel terapia (DTX) en el modelo de ratón. Los resultados
demostraron que esta estrategia de combinación podría inhibir significativamente el crecimiento
del tumor, así como metástasis de tumores a los pulmones. Basándose en estos hallazgos,
concluimos que la imagen molecular específica-CD206 puede detectar con sensibilidad los cambios
dinámicos en los macrófagos infiltrantes de tumor, y que la combinación de agotamiento de los
macrófagos y la terapia citotóxica es una estrategia prometedora para el tratamiento eficaz de
tumores sólidos.

Palabras clave: Imágenes ópticas, CD206, macrófagos asociadas con el tumor, el agotamiento de
los macrófagos, la terapia guiada por imágenes.

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Introducción

El cáncer de mama es una enfermedad maligna diagnosticada con frecuencia en las mujeres y es
una causa principal de muertes relacionadas con el cáncer en todo el mundo . La mortalidad
asociada al cáncer de mama como resultado en gran parte de la diseminación metastásica de las
células tumorales a los órganos vitales como los pulmones, el hígado y la detección temprana del
hueso y la mejora de las estrategias de tratamiento podrían aumentar considerablemente las
probabilidades de curar o controlar esta enfermedad .

Los tumores sólidos, incluidos los de cáncer de mama, comprenden no sólo las células de tumores
malignos, pero también muchas células circundantes de diversos tipos que crean un
microambiente único; este microambiente regula las propiedades neoplásicas de los tumores .
macrófagos asociados a tumores (TAM) son un conjunto de macrófagos que residen en el
microambiente tumoral, y TAM promover la migración de células tumorales y la invasión mediante
la secreción de citocinas y quimiocinas . Cada vez más pruebas a partir de estudios clínicos y
preclínicos se ha indicado que TAM promover la invasión tumoral celular, la proliferación, la
supervivencia y metástasis en sitios locales y distantes . Varios estudios clínicos han demostrado
que el aumento de la infiltración de macrófagos en tumores confiere pronóstico potencial de
metastásica en cáncer de mama . los papeles importantes de TAM en cánceres sugieren que es
importante desarrollar nuevas terapias que se dirigen a estas células . Además, de imagen no
invasiva de infiltrados de macrófagos sería de gran ayuda en la progresión del cáncer mejor
comprensión y en la evaluación del tratamiento del cáncer eficacia.

TAM se consideran macrófagos principalmente polarizadas-M2, también conocido como (


"activados alternativamente") macrófagos no inflamatorias, que son distintos de los macrófagos
inflamatorios (M1, o "clásicamente activado") . La evidencia ha demostrado que el receptor de
manosa de macrófagos (MMR; CD206) no se expresa en los macrófagos M1; Por lo tanto, CD206
sirve como un marcador útil para distinguir M2 de los macrófagos M1 . Esto sugiere la posibilidad
de formación de imágenes TAM-dirigida de CD206, así como terapias dirigidas. Un estudio reciente
demostró que una CD206 de metas de nanocuerpos puede ser utilizado con éxito para la
tomografía computarizada por emisión de fotón único (SPECT) de formación de imágenes marcado
radiactivamente de los macrófagos en tumores sólidos in vivo. Además, este radiotrazador
también se puede utilizar para obtener imágenes de inflamación de las articulaciones en un ratón
modelo de la artritis reumatoide .

El ácido zoledrónico (ZA) es un bisfosfonato que contiene nitrógeno de tercera generación que ha
sido aprobado por la Administración de Alimentos y Fármacos de Estados Unidos para el
tratamiento de la enfermedad ósea inducida por el cáncer . ZA previene y trata las metástasis
óseas en pacientes con tumores sólidos mediante la orientación osteoclastos , que son macrófagos
que casa con el hueso . ZA reduce el número de macrófagos asociados al tumor y la cantidad de
vascularización, reduciendo así la carga de metástasis .

En este estudio, se preparo un agente formador de imágenes de fluorescencia en el infrarrojo


cercano (NIRF) que se dirige a CD206, y lo caracterizó in vitro e in vivo. Nuestro objetivo era
investigar si las imágenes NIRF CD206-dirigida puede ser utilizado para visualizar de forma no
invasiva y cuantificar los macrófagos infiltrantes de tumor, y para guiar la terapia anti-macrófagos
basados en ZA. Además, hemos desarrollado una estrategia terapéutica que combina anti-
macrófagos (ZA) y de células anti-tumor (docetaxel; DTX) terapias, y se investigó si esta estrategia
de combinación podría ser utilizado como un tratamiento eficaz para el cáncer de mama en un
modelo de ratón.

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Materiales y métodos
Preparación del agente de imagen NIRF CD206-focalización

El agente de formación de imágenes NIRF CD206-orientación (Figura Figure11A) se generó


mediante la conjugación de un anticuerpo anti-ratón de CD206 (clon C068C2; IgG2a, κ isotipo;
BioLegend, San Diego, CA) con el éster de succinimidilo DyLight680 (Pierce, Rockford, IL) de
acuerdo con el protocolo estándar como se describió previamente 20. en pocas palabras, el
anticuerpo se mezcló con el éster de colorante en tampón de bicarbonato (pH 9,0) a una relación
molar 6: 1. Después de incubación durante 1 h a temperatura ambiente, el conjugado anticuerpo-
DyLight680 (tinte de anti-CD206) se purificó con una columna de desalación PD-10 (GE Healthcare,
Piscataway, NJ) utilizando solución salina tamponada con fosfato (PBS) como el fago móvil. La
pureza de tinte-anti-CD206 se determinó por electroforesis en dodecilsulfato de sodio-gel de
poliacrilamida (SDS-PAGE), seguido de formación de imágenes NIRF usando un sistema de
imágenes IVIS pequeños animales (Xenogen, Alameda, CA). El agente de formación de imágenes
de control NIRF tinte-IgG se generó mediante la conjugación de IgG de control de isotipo (IgG2a, κ
isotipo; BioLegend, San Diego, CA) con DyLight680 utilizando el mismo protocolo.

Figura 1

Figura 1

(A) El esquema de síntesis del Tinte-anti-CD206. (B) SDS-PAGE y formación de imágenes NIRF de
anti-CD206 anticuerpo y tinte-anti-CD206. (C) CD206 y F4 / 80 tinción de las células RAW 264.7 de
macrófagos murinos. (D) tinción de fluorescencia directa de RAW 264.7 y células 4T1 usar tintes de
anti-CD206 ...

Cultivo de células y tinción de las células

El cáncer de mama 4T1 murino y 264.7 de macrófagos murinos RAW (CD206-positivo 7) se


adquirieron de la American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA). Las células fueron
cultivadas en medio RPMI 1640 (Invitrogen, Carlsbad, CA) suplementado con 10% de suero bovino
fetal (FBS) a 37 ° C en una atmósfera humidificada que contiene 5% de CO2.

Para la tinción de superposición de CD206 y F4 / 80, las células RAW 264.7 cultivadas en 35 mm
MatTek placas de cultivo de vidrio de fondo se incubaron con la rata anti-ratón de CD206
(BioLegend, San Diego, CA) y de conejo anti-ratón de F4 / 80 (Abcam, Cambridge, MA) anticuerpos
primarios durante 1 h a temperatura ambiente, y después se incubaron con anticuerpos
secundarios conjugados de colorante durante 1 h. Las células se montaron con medio que
contiene DAPI (Vector Laboratories, Burlingame, CA) y se examinan bajo un microscopio confocal
(Wetzler, Heidelberg, Alemania).
Para determinar la inmunorreactividad de tinte-anti-CD206, RAW 264.7 o células 4T1 se incubaron
con tinte-anti-CD206 (10 nmol / L en PBS) o tinte-IgG (10 nmol / L en PBS) durante 1 h a
temperatura ambiente . Después de lavar con PBS y montaje con medio que contiene DAPI, se
examinaron las células bajo un microscopio confocal.

NIRF imágenes de animales pequeños

Todos los experimentos con animales se realizaron de acuerdo con las directrices de la
Universidad de Pekín Cuidado de Animales y el empleo Comisión. El modelo de ratón 4T1
portadores de tumores fue establecido por vía subcutánea inoculación de 2 x 106 células en los
flancos delanteros derecho de / c ratones normales BALB (4 ~ 5 semanas de edad; Departamento
de Animales de Laboratorio de Ciencias, Universidad de Pekín). Para determinar la especificidad
del tumor in vivo de tinte-anti-CD206, cada ratón 4T1 tumor-cojinete se inyectó por vía
intravenosa con 0,2 nmol de colorante-anti-CD206 (n = 5) o tinte-IgG (como control; n = 5) . A las
2, 8, 24, y 48 h después de la inyección (p.i.), los ratones fueron NIRF imagen usando un sistema de
imágenes IVIS pequeños animales (Xenogen, Alameda, CA). Para cada análisis, una parte alícuota
con una cantidad conocida de solución inyectada Se obtuvieron imágenes de forma simultánea. La
región de interés (ROI) se ha elaborado para cada tumor de las imágenes utilizando software
Image habitable (Xenogen, Alameda, CA) como se describió anteriormente 20, 21. Los resultados
se expresaron como el porcentaje de la intensidad de fluorescencia mediante la normalización de
los valores de captación tumoral ([p / seg / cm2 / sr] / [/ cm2 mu W]) a la dosis total de inyección.

Para ex vivo NIRF de imágenes, dos grupos (n = 4 por grupo) de 4T1 ratones portadores de tumor
se inyectaron por vía intravenosa con 0,2 nmol de colorante-anti-CD206 y tinte-IgG,
respectivamente. A las 24 h p.i., los ratones se sacrificaron, y se recogieron la sangre, tumor y los
órganos principales de cada ratón, se pesaron, y se colocan en un papel en blanco, junto con una
parte alícuota de una cantidad conocida de producto inyectado. a continuación, se llevó a cabo
formación de imágenes NIRF, y los resultados se presentaron como el porcentaje de dosis
inyectada por gramo (% ID / g).

Para imágenes NIRF longitudinal de la respuesta tumoral a ZA usar tintes de anti-CD206, se


utilizaron dos grupos de 4T1 ratones portadores de tumor (n = 5 por grupo). Cada ratón se inyectó
por vía intraperitoneal con ZA (150 mg / kg en PBS, diariamente) o PBS (control vehículo) durante
7 días (del día 0 a 6) después de completar la exploración de imágenes de línea de base NIRF (día
0). Los animales se NIRF con imagen formada de nuevo en los días 3, 7 y 11. Para cada exploración,
se inyectaron ratones a través de la vena de la cola con 0,2 nmol de colorante-anti-CD206, y de
formación de imágenes NIRF se realizó a 24 h p.i.
microbiodistribution intratumoral

Para investigar la microdistribución de tinte-anti-CD206 en tejidos tumorales 4T1, un ratón BALB /


c portadores de tumores 4T1 se inyectó por vía intravenosa con 1 nmol de colorante-anti-CD206. A
las 24 h p.i., se sacrificó el ratón; el tumor se cosechó, se congelaron inmediatamente en óptimo
de reducción de temperatura (OCT) medio, y luego se corta en rodajas de 5 micras de grosor. Las
rodajas tumorales se incubaron con anticuerpo de conejo anti-ratón de F4 / 80 de anticuerpos
(Abcam, Cambridge, MA) durante 1 h a temperatura ambiente, y luego se visualizaron utilizando
isotiocianato de fluoresceína (FITC) conjugado con anticuerpo secundario bajo un microscopio
confocal. El microdistribución intratumoral de tinte-IgG (como control) también se determinó
usando el mismo protocolo.

proliferación celular y de colonias ensayos de formación

Se realizaron ensayos de viabilidad celular y la formación de colonias para investigar el efecto de


ZA, DTX, o ambos en la citotoxicidad de células 4T1 tumorales. Para el ensayo de viabilidad celular,
las células 4T1 (2 × 103 / pocillo) se sembraron en placas de 96 pocillos y se incubaron a 37 ° C
durante la noche. Las células se trataron entonces con concentraciones crecientes de ZA o DTX
(con o sin la combinación de 1 M ZA). Después de incubación a 37 ° C durante 72 h, la viabilidad
celular se determinó usando el Cell Counting Kit-8 (Dojindo Laboratories, Kumamoto, Japón).

Para el ensayo de formación de colonias, las células 4T1 (1 x 103 / pocillo) se sembraron en una
placa de 12 pocillos y se incubó a 37 ° C durante la noche. Las células se trataron con medio de
cultivo que contiene el control del vehículo, ZA (10 nM), DTX (10 nM), o ambos ZA (10 nM) y DTX
(10 nM) durante 48 h. Después, medio de cultivo celular se cambió, y se dejó que las células
crecieran durante otros 120 horas a 37 ° C hasta que las colonias de células eran visibles. Las
células fueron teñidas con 0,1% de Coomassie Brilliant Blue y se examinaron por microscopía.

En la terapia de tumores in vivo y el examen metástasis de pulmón

los ratones con tumores de aproximadamente 150 mm3 fueron separados en cuatro grupos 4T1
portadores de tumores: el control del vehículo (n = 24), el tratamiento ZA (n = 24), el tratamiento
DTX (n = 8), y ZA además DTX tratamiento (n = 8) grupos. Los animales fueron inyectados por vía
intraperitoneal con el control del vehículo, ZA (150 mg / kg en PBS, diariamente), DTX (5 mg / kg
en 13% de etanol, al día), y las dos ZA (150 mg / kg en PBS, diariamente) y DTX ( 5 mg / kg en 13%
de etanol, al día) durante 7 días (del día 0 al día 6). El crecimiento tumoral se midió usando un
calibrador, y el volumen del tumor se calculó usando la fórmula: volumen = longitud x anchura2 /
2. Cuatro ratones de cada uno de los grupos control del vehículo y de tratamiento ZA fueron
sacrificados cada día en los días 0, 3, 7, y se cosecharon 11. Los tejidos tumorales, se congelaron
en medio PTU, y se cortan en rodajas de 5 micras de grosor. Se realizó a continuación, tinción de
inmunofluorescencia para determinar CD206 y F4 / 80 niveles de expresión.

Al final (día 12) del estudio de terapia in vivo, se recogieron tejidos tumorales de cada grupo, y el
corte congelado en rodajas 5-m de espesor para la tinción de inmunofluorescencia de los niveles
de Ki67. metástasis de tumor de pulmón se examinó utilizando un anteriormente descrito método
de 22. En resumen, los pulmones de cada ratón se rellenan con tinta India 15% a través de la
tráquea superior y se fijaron en solución (100 ml de 70% de alcohol de Fekete, 10 ml de formalina
al 4%, y 5 ml de ácido acético glacial). Las lesiones metastásicas aparecen como nódulos blancos
en las superficies del pulmón negro después de este procedimiento. Después de ser fotografiado,
los pulmones se incluyeron en parafina, corte en secciones, y se sometieron a hematoxilina y
eosina (H & E) tinción.

la tinción de inmunofluorescencia de tejidos

Ex vivo la tinción de inmunofluorescencia de tumor 4T1 o tejidos normales se realizó para validar
los resultados de los estudios in vivo. Se llevaron a cabo los experimentos, y los resultados de la
tinción fueron analizadas por dos investigadores (D. y C. Gao Zhang) que fueron cegados a los
resultados del tratamiento de imágenes y de tumores in vivo NIRF.

Para CD206 y F4 / 80 tinción de superposición, tumor 4T1, músculo, hígado, o cortes de tejido de
bazo se incubaron con la rata anti-ratón de CD206 (BioLegend, San Diego, CA) y de conejo anti-
ratón de F4 / 80 (Abcam, Cambridge, MA ) anticuerpos primarios durante 1 h a temperatura
ambiente, y luego se visualizaron con Cy3 o anticuerpos secundarios conjugados con FITC con un
microscopio confocal. Para la tinción de Ki67, las rodajas tumorales se incubaron con anticuerpo
de conejo anti-Ki67 (Millipore, Billerica, MA). Las rodajas se visualizaron luego con el anticuerpo
secundario conjugado con Cy3 bajo un microscopio confocal. Después de la tinción, se
seleccionaron 10 vistas aleatorias en las rodajas de tumores para los análisis. El nivel de expresión
CD206 murino se calculó mediante la medición de la densidad óptica integrada de imágenes de un
área equivalente utilizando un método descrito previamente 23. El índice de proliferación de
células tumorales se calculó como el porcentaje de células Ki67 positivas 24.

análisis estadístico
Los datos cuantitativos se expresan como medias ± SD. Los datos se analizaron usando GraphPad
versión 5.0 (GraphPad Software, San Diego, CA). Las diferencias se analizaron mediante prueba t
de Student o ANOVA, y los resultados se consideraron estadísticamente significativas en los
valores de p <0,05.

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resultados

Síntesis de tinte anti-CD206

Hemos sintetizado el agente de formación de imágenes NIRF CD206-focalización, Tinte-anti-


CD206, conjugando directamente el anticuerpo anti-CD206 con un colorante NIRF (Figura
Figure11A). La relación de colorante a la proteína para el tinte-anti-CD206 se calculó que era 3,2
en base a mediciones ultravioletas de A280 y A684. Por SDS-PAGE y formación de imágenes NIRF
posterior, no se observó tinte libre en el producto final (Figura Figure11B), lo que demuestra su
alta pureza.

En la tinción de células vitro

A continuación se investigó la inmunorreactividad in vitro de tinte anti-CD206. Desde CD206 se


expresa en la superficie de los macrófagos en los tejidos tumorales y no en las mismas células
tumorales, elegimos 264.7 células de macrófagos de ratón RAW como una línea de células
tumorales CD206-positivo. Nuestros resultados de la tinción de células confirmaron claramente
que las células RAW 264.7 fueron CD206-positivo, y que estas células altamente expresado F4 / 80
(Figura Figure11C), otro biomarcador de macrófagos. luego teñidas las células RAW 264.7 CD206
positivas usar tintes de anti-CD206. Como se muestra en la Figura Figure11D, Tinte-anti-CD206
puede etiquetar específicamente a las células RAW 264.7 CD206-positivo, mientras que Tinte-IgG
fue capaz de teñir estas células, demostrando la especificidad de CD206-tinte-anti-CD206. Las
células 4T1 se incubaron con tinte-anti-CD206 no mostraron tinción, lo que confirma que CD206
no se expresa en la superficie celular 4T1 tumor.

Biodistribución de tinte anti-CD206 in vivo

A continuación se determinó la vivo tumor en la selección de características de tinte-anti-CD206


en 4T1 ratones BALB / c portadores de tumores. imágenes de fluorescencia representativas en
diferentes momentos después de la inyección de tinte anti-CD206 se muestran en la Figura
Figure22A. Tinte-IgG se utilizó como control. Los tumores 4T1 eran claramente visibles con alto
contraste con respecto al fondo a partir de las 8 h p.i. Tinte-IgG mostró captación tumoral baja,
debido a la falta de focalización de este agente. La captación tumoral cuantificada de tinte-anti-
CD206 fue significativamente mayor que la de tinte-IgG en los puntos de todos los tiempos
examinados (P <0,001; Figura Figure22B).

Figura 2

Figura 2

(A) En vivo NIRF de imágenes de 4T1 ratones normales BALB / c portadores de tumor a los 2, 8, 24,
y 48 h después de la inyección intravenosa de colorante-anti-CD206 o tinte-IgG. Los tumores se
indican por los círculos de trazos. (B) Cuantificación y la cinética de las características de
orientación tumorales in vivo ...

Para investigar la biodistribución de tinte anti-CD206 o tinte-IgG en las 4T1 tumores y tejidos
normales, se realizó ex vivo de imágenes NIRF a las 24 h p.i. en otro estudio. Blood, tumor, y los
órganos normales se pesaron, se determinó el total de la señal de fluorescencia, y se calculó el% ID
/ g. Como se muestra en la Figura Figure22C, D, la absorción de tinte-anti-CD206 en la mayoría de
los órganos normales era comparable a la de tinte-IgG. Sin embargo, la captación tumoral de tinte-
anti-CD206 fue significativamente mayor que la de tinte-IgG (13,23 ± 2,78% vs. 7,30 ± 0,84%, P
<0,01), que es consistente con los datos de imagen en vivo NIRF en ratones vivos . Se observó que
la absorción de tinte-anti-CD206 en el hígado fue también significativamente superior a la de tinte-
IgG (19,07 ± 4,12% vs. 11,55 ± 3,03%, P <0,05).

La tinción de inmunofluorescencia

Se investigaron los patrones de expresión de CD206 en tejidos tumorales 4T1 mediante tinción de
inmunofluorescencia. Como se muestra en la Figura Figure33A, tejidos tumorales 4T1 fueron
positivos tanto para F4 / 80 y CD206. tinción de superposición mostró que la mayoría de la zona de
CD206-positivo también se tiñeron para F4 / 80, como se esperaba en los macrófagos. Los
resultados confirmaron la expresión positiva de CD206 en los macrófagos de los tejidos tumorales
4T1. Para examinar el tejido normal, el músculo no expresó F4 / 80 o CD206, mientras que el
hígado y el bazo expresan altos niveles de F4 / 80 y CD206 (Material complementario: Figura S1).

figura 3

figura 3

(A) Superposición de la tinción de inmunofluorescencia de F4 / 80 y CD206 en 4T1 tejido tumoral.


(B) La tinción de inmunofluorescencia de F4 / 80 en tejidos tumorales 4T1 recogidas de ratones
portadores de tumores 24 h después de la inyección de tinte-anti-CD206 o tinte-IgG. El color verde
del FITC para ...

microbiodistribution intratumoral de tinte anti-CD206


Además, investigó la microdistribución intratumoral de tinte anti-CD206 en tejidos tumorales 4T1.
Se cosecharon el tejido del tumor de un ratón 4T1 portadores de tumores a las 24 h p.i. de tinte
anti-CD206. Los tejidos tumorales se tiñeron para F4 / 80 para localizar los macrófagos. Como se
muestra en la Figura Figure33B, en comparación con las señales de tinte-IgG, se observaron
señales de DyLight680 más fuerte en los tejidos tumorales 4T1. Es importante destacar que la
mayor parte de la zona de tinte-anti-CD206-positivo también fue positiva para F4 80 de tinción /,
mientras que la ubicación de tinte-IgG no mostró evidente co-localización con F4 / 80. Estos
resultados demostraron la localización de macrófagos-dirigida de tinte anti-CD206 en 4T1
tumores.

NIRF de imágenes longitudinal de tinte anti-CD206 in vivo

Se realizó formación de imágenes NIRF serie utilizando tinte-anti-CD206 en el modelo de ratón


portador de tumor 4T1 para determinar si se puede utilizar para controlar dinámicamente la
expresión de CD206 durante la terapia anti-macrófagos utilizando ZA. exploraciones NIRF tanto de
control y ratones tratados tumorales 4T1-ZA se adquirieron en los días 0, 3, 7, y 11. Como se
muestra en la Figura Figure44A, Tinte-anti-CD206 mostró la captación de alto contraste en el
control y tratados 4T1-ZA tumores en el día 0. con el tratamiento ZA, la intensidad de
fluorescencia del tinte-anti-CD206 en los tumores tratados con ZA disminuyeron gradualmente en
relación con la de los tumores de control. La captación tumoral cuantificada de tinte-anti-CD206
en los tumores tratados con ZA fue significativamente menor que en los tumores de control en los
días 3 (5,27 ± 0,86% vs. 7,22 ± 1,36%, P <0,05), 7 (5,40 ± 0,69 % vs. 7,63 ± 0,85%, P <0,01), y 11
(6,27 ± 0,11% frente a 7,76 ± 0,84%; p <0,05) (Figura Figure44B). La captación tumoral inferior de
tinte-anti-CD206 en los tumores tratados con ZA comparación con la de los tumores de control
sugiere una disminución en la expresión de CD206.

Figura 4

Figura 4

Longitudinales imágenes in vivo NIRF (A) y captación tumoral cuantificada (B) de 4T1 ratones
portadores de tumores a las 24 horas después de la inyección de tinte anti-CD206 en los días 0, 3,
7 y 11 después del ácido zoledrónico (ZA; 150 mg / kg en PBS al día durante 7 días) o PBS
tratamiento (control). ...

Para validar los resultados de las imágenes dinámicas en vivo, hemos realizado ex vivo tinción de
inmunofluorescencia tanto CD206 y F4 / 80. Los resultados de la tinción de superposición de
CD206 y F4 / 80 se muestran en Material complementario: Figura S2, y los resultados de tinción
para CD206 sólo se muestran en la Figura Figure44C. La expresión de CD206 en los tumores
tratados con ZA fue significativamente menor en los días 3 (33.41 ± 6.03% vs. 82.99 ± 20.73%, p
<0,001), 7 (51,29 ± 19,50% frente a 113,43 ± 28,04%, P <0,01) y 11 (42,08 ± 10,91% vs 104.89 ±
30.49%, p <0,01) en comparación a la de los tumores de control (Figura Figure44D), que confirmó
la reducción de la expresión de CD206 en el tumor después del tratamiento 4T1 ZA. Estos
resultados demostraron que el tratamiento ZA de hecho puede resultar en el agotamiento de los
macrófagos CD206-positivo, y este agotamiento se pueden visualizar de forma no invasiva in vivo
mediante formación de imágenes de tinte anti-CD206 NIRF.

La terapia combinada utilizando ZA y DTX

La citotoxicidad in vitro de ZA y DTX se determinó en células 4T1 tumorales. Como se muestra en


la Figura Figure55A, el tratamiento con ZA sí solo no tiene un efecto evidente sobre la
proliferación de células 4T1, lo que sugiere que ZA no tiene ningún efecto citotóxico sobre las
células tumorales. En contraste, se observó un notable efecto anti-proliferación de tratamiento
con DTX solo, con la viabilidad celular de menos de 30% del control después del tratamiento con
dosis mayores de 10 nM. La terapia combinada utilizando DTX y ZA mostró una curva de inhibición
de células tumorales casi idéntica a la de DTX solo, lo que sugiere que no hubo un incremento en
el efecto antitumoral cuando se combina el tratamiento DTX y ZA in vitro.

Figura 5

Figura 5

(A) efecto citotóxico in vitro de ácido zoledrónico (ZA), docetaxel (DTX), o ZA más DTX en 4T1
células tumorales. (B-C) Fotografía de la placa de pocillos 12 (B) y el examen de microscopía (C) de
la formación de colonias de células 4T1 tratadas con el control del vehículo, ...

Se observaron resultados similares en el ensayo de formación de colonias de células 4T1. Como se


muestra en la Figura Figure55B, C, en el grupo de tratamiento ZA, las colonias de células formadas
eran comparables con la del grupo de control. Sin embargo, DTX o ambos DTX y el tratamiento ZA
condujeron a una inhibición significativa en la formación de colonias de células 4T1. En general, los
vitro de proliferación celular y la formación de colonias en los estudios demostraron que ZA no
tener un efecto anti-tumoral, mientras que DTX tuvo notable citotoxicidad in vitro.

A continuación cambiamos a los estudios de terapia in vivo combinados en los ratones portadores
de tumores 4T1. Elegimos una dosis relativamente baja (5 mg / kg) de DTX con el fin de observar el
efecto antitumoral de la terapia combinada. Como se muestra en la Figura Figure55D, la curva de
crecimiento del tumor en el grupo tratado con ZA era casi idéntica a la del grupo control.
tratamiento DTX condujo a la inhibición del crecimiento tumoral leve en el día 8, pero no se
encontró ninguna diferencia estadísticamente significativa en el crecimiento del tumor en
comparación con la del grupo control. En contraste, el tratamiento con DTX más ZA comenzó a
mostrar una tendencia del efecto terapéutico en el día 4, y mucho menos el crecimiento del tumor
se observó desde el día 10 (286,84 ± 93,42 frente a 657,09 ± 377,98 mm3; P <0,05) al día 12
(349,18 ± 100,58 810,97 ± 431,91 vs. mm3; P <0,01) en comparación con la del grupo control.
Estos hallazgos sugieren que la depleción combinada macrófagos (ZA) y la terapia citotóxica (DTX)
ejercen un fuerte efecto terapéutico contra 4T1 tumores in vivo.

La validación de la eficacia de la terapia combinada

Se realizó la tinción de inmunofluorescencia Ki67 para examinar la proliferación celular en los


tumores que reciben ZA, DTX, o ambos tratamientos ZA y DTX. Como se muestra en la Figura
Figure66A, B, tratamiento ZA no causó una disminución significativa en el índice de proliferación
celular (P> 0,05). En contraste, el índice de proliferación celular en el grupo de terapia combinada
ZA y DTX (5,38 ± 1,07%) fue significativamente menor que en el control (46,24 ± 7,15%, p <0,001) y
se trató-DTX (17,97 ± 4,76%; P <0,05) tumores.

Figura 6

Figura 6

(AB) La tinción de inmunofluorescencia de Ki67 (A) y las células Ki67 positivas por ciento (B) en los
tejidos 4T1 tumorales cosechadas en el día 12 de ratones tratados con vehículo (control), el ácido
zoledrónico (ZA), docetaxel (DTX), o ZA plus DTX. (C-E) Las fotografías de la India lleno de tinta ...

células 4T1 son células de cáncer de mama altamente metastásicas, que pueden conducir a la
metástasis evidente en los ratones después de la inoculación 25, 26. Por lo tanto, se investigó aún
más el efecto anti-metastática de ZA, DTX, y ZA más DTX en los ratones portadores de tumor 4T1.
Las imágenes representativas de los pulmones y los números contados de las lesiones
metastásicas en los diferentes grupos se muestran en la Figura Figure66C y la Figura Figure66D,
respectivamente. En el grupo de control, todos los ratones tenían una amplia metástasis de
tumores en los pulmones en el día 12. Los números contados de tumores en los pulmones fueron
11,67 ± 1,52, 2,00 ± 1,73, 8,00 ± 2,00 y 0,67 ± 0,58 para el control, ZA, DTX , y los grupos más ZA
DTX, respectivamente. tratamiento ZA condujo a la formación de un número significativamente
menor de las lesiones metastásicas pulmonares en comparación con la del grupo de control (P
<0,001). No se observó ninguna metástasis de pulmón evidente en el grupo de tratamiento ZA más
DTX. El examen histológico mediante tinción H & E confirmó la reducción en las lesiones tumorales
después del tratamiento con ZA ZA o ambos y DTX (Figura Figure66E). Estos resultados sugieren
que ZA tuvo efectos significativos sobre la inhibición de la metástasis tumoral, y que ZA más DTX
metástasis inhibió casi completamente de los tumores a los pulmones.
Ir:

Discusión

En este estudio, hemos preparado un agente de imagen NIRF-dirigida de CD206 de ratón, Tinte-
anti-CD206, y demostró su potencial en la visualización no invasiva de TAM en vivo por imágenes
NIRF usar tintes de anti-CD206. Se evaluó la eficacia de tinte anti-CD206 en el modelo de cáncer de
mama 4T1 de ratón, en el que tanto los macrófagos y las células tumorales eran de origen murino.
Creemos que este modelo imita mejor la situación clínica en comparación con un modelo de ratón
que lleva xenoinjertos de tumores humanos. Se observó que la línea celular de macrófagos RAW
264.7, pero no las células tumorales 4T1, expresa CD206. Con los estudios microdistribución
intratumoral, se confirmó que el tinte anti-CD206 localiza en los macrófagos de los tejidos
tumorales 4T1 (Figura Figure33B).

Debido a los papeles fundamentales de TAM en la progresión, invasión y metástasis de cánceres,


recientemente se han realizado varios estudios pioneros para desarrollar agentes radiomarcados
para la formación de imágenes molecular de TAM en modelos animales. Movahedi et al. 14
informaron el desarrollo de nanocuerpos anti-CD206 99mTc-labled in vivo para SPECT de TAM.
Alta especificidad de CD206 nanocuerpos anti-CD206 99mTc-labled se observó en los tumores
sólidos, lo que demostró la posibilidad de formación de imágenes CD206-selectiva de
subpoblaciones de TAM en vivo 14. Además de los anti-CD206 nanocuerpos, varias nanopartículas
modificadas por el ligando natural de CD206, manosa , también se investigaron para la imagen-
dirigida de TAM 27 y la entrega guiada por imagen molecular de los fármacos químicos 28. en
comparación con radiotrazadores que se han descrito previamente 14, 15, 27, agentes de imagen
NIRF como tinte anti-CD206 son un costo relativamente bajo. Su síntesis es también sencilla y no
conlleva el riesgo de exposición a la radiación. Por otra parte, la imagen de fluorescencia es
policromática, lo que permite obtener imágenes multicolor usando fluoróforos con diferentes
longitudes de onda de emisión 29, 30. Agentes para orientar las células tumorales 4T1 no estaban
disponibles para nosotros; Por lo tanto, decidimos probar la imagen de dos colores en el portador
de un tumor A549 modelo de ratón desnudo, en el que las células A549 son epidérmico humano
receptor del factor de crecimiento 2 (HER2) -positivo 31, y los macrófagos infiltrantes de tumores
son CD206-positivo ( material complementario: Figura S3 B). A través de HER2-específica
simultánea (mediante DyLight755 etiquetado anticuerpo anti-HER2 [Dye755-anti-HER2]) y CD206-
específica (usando tinte anti-CD206) de imágenes NIRF, podríamos simultáneamente las células
tumorales de imagen y macrófagos in vivo (Figura S3 A) . Por ex vivo tinción de fluorescencia,
hemos demostrado que no se encontró ninguna superposición entre HER2 y CD206 (Figura S3B), lo
que confirma la expresión distinto de estos marcadores en las células tumorales y los macrófagos
infiltrantes de tumor, respectivamente. Estos resultados confirmaron además que el agente de
imagen del tinte-anti-CD206 se une in vivo a TAM pero no a las células tumorales.
Mediante el uso de imágenes in vivo NIRF en, hemos demostrado la orientación específica de
tinte-anti-CD206 en tejidos tumorales 4T1, como lo demuestra la captación tumoral
significativamente mayor de tinte-anti-CD206 en comparación con la de tinte-IgG (Figura
Figure22A, B ). Desde imágenes de fluorescencia tiene limitaciones en la penetración en el tejido y
la intensidad de fluorescencia de cuantificación de 32 años, hemos realizado estudios de
biodistribución ex vivo para validar los resultados de las imágenes en vivo. Ex vivo resultados de
biodistribución fueron consistentes con los resultados de formación de imágenes in vivo en los
animales vivos, que muestra la absorción de tumor significativamente mayor de tinte-anti-CD206
en comparación con el control de isotipo (Figura Figure22C, D). Un estudio previo 14 usando
nanocuerpos anti-CD206 99mTc-labled han demostrado alta captación en el bazo, debido a la alta
expresión de CD206 en este órgano (Material complementario: Figura S1). Sorprendentemente, en
el estudio de biodistribución ex vivo no se observó una captación significativa de tinte anti-CD206
en el bazo. Este resultado fue consistente con el de un estudio recientemente publicado 28, que
también mostró baja captación de un agente de CD206 orientada en el bazo in vivo, a pesar del
bazo que muestra una fuerte tinción para CD206. Este fenómeno puede explicarse por diferentes
cinéticas de las sondas CD206 orientada en el tumor y el bazo, debido a las propiedades
fisiológicas distintas (por ejemplo, el flujo sanguíneo, la permeabilidad vascular, y la presión
fisiológica) de estos órganos. Los macrófagos CD206-positivo en el tumor y el bazo también
pueden diferir significativamente como resultado de las diferencias en sus microambientes.
Además, sólo hemos determinado la biodistribución in vivo de tinte anti-CD206 en un punto
temporal (24 h), que pueden no haber captado la captación máxima de esta sonda en el bazo. En
estudios futuros, la observación a largo plazo (por ejemplo, desde 1 h hasta 240 h) de los
comportamientos in vivo de tinte anti-CD206 puede ser necesaria para caracterizar mejor la
absorción de esta sonda de imagen óptica en los órganos normales.

En contraste con el bazo, el hígado, otro CD206-expresión de órgano alto (Material


complementario: Figura S1), mostró la acumulación de alta y específica de tinte-anti-CD206, como
lo demuestra la significativamente mayor captación de tinte-anti-CD206 en comparación con la de
tinte-IgG en este órgano (Figura Figure22D). Niu et al. 28 recientemente también mostraron que el
agotamiento de los macrófagos por ZA condujo a una reducción en la señal de las nanopartículas
fluorescentes dirigidos-CD206 en el hígado. Sin embargo, en un estudio reciente 33, se demostró
que la gran mayoría de las células CD206 positivas en el hígado son células endoteliales CD31-
positivo (en lugar de macrófagos) y que el agotamiento de los macrófagos no dio lugar a reducción
de la señal en el hígado. Una posible explicación de la discordancia en estos resultados es que el
hígado no es sólo un órgano CD206-positivo, pero también un órgano de aclaramiento, de manera
que las macromoléculas portadoras de señal, tales como el anticuerpo intacto (utilizado en este
estudio) y nanopartículas (utilizado en el 28) se borran a través de la vía hepática.
En este estudio, hemos examinado el efecto del tratamiento con ZA en el modelo de ratón
portador de un tumor 4T1. ZA se ha demostrado que disminuir el número de macrófagos tumor
infiltrante 34, 35; también, más concretamente, para poder agotar TAM por revertir la
polarización de los macrófagos de un M2 a un fenotipo M1 36, 37. Mediante la tinción de
inmunofluorescencia, se observó que el tratamiento ZA llevó a la depleción de CD206-positivo
macrófagos (Figura Figure44C ).lugar a la inhibición del crecimiento tumoral 4T1. por lo tanto, se
combinaron anti-macrófagos ZA terapia y tumor citotóxico docetaxel terapia (DTX) en el modelo
de ratón. Los resultados demostraron que esta estrategia de combinación podría inhibir
significativamente el crecimiento del tumor, así como metástasis de tumores a los pulmones.
Basándose en estos hallazgos, concluimos que la imagen molecular específica-CD206 puede
detectar con sensibilidad los cambios dinámicos en los macrófagos infiltrantes de tumor, y que la
combinación de agotamiento de los macrófagos y la terapia citotóxica es una estrategia
prometedora para el tratamiento eficaz de tumores sólidos

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