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DE AREQUIPA
FACULTAD DE INGENIERÍA DE PROCESOS
ESCUELA PROFESIONAL DE INGENIERÍA QUÍMICA
AUTORES:
Dr. Ing. Raúl Omar Gallegos Jara
Ing. Marcia Juana Quequezana Bedregal
AREQUIPA-PERÚ-2018
NIVERSIDAD NACIONAL DE SAN AGUSTÍN DE
AREQUIPA
AUTORES:
Dr. Ing. Raúl Omar Gallegos Jara
Ing. Marcia Juana Quequezana
Bedregal
AREQUIPA-PERÚ-2018
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PROLOGO
Los Autores
4
ÍNDICE
PROLOGO
ÍNDICE
Pgs.
RECOMENDACIONES GENERALES… ................................................................................................... 6
PRÁCTICA 1 : BIOSEGURIDAD; MICROSCOPIA ..................................................................... 7
PRÁCTICA 2 : RECONOCIMIENTO DE ALGAS PROTOZOOS Y CIANOBACTERIAS
IN VIVO, COLORACION VITAL ...................................................................... 12
PRÁCTICA 3 : PREPARACIÓN DE UN FROTIS BACTERIANO: COLORACIONES:
SIMPLE Y DIFERENCIAL, TINCION Y MORFOLOGIA DE
HONGOS .................................................................................................................... 17
PRÁCTICA 4 : EQUIPO Y MATERIAL DE LABORATORIO, ACONDICIONAMIENTO
Y ESTERILIZACIÓN ............................................................................................ 31
PRÁCTICA 5 : MEDIOS DE CULTIVO ........................................................................................ 36
PRÁCTICA 6 : SIEMBRA DE MICROORGANISMOS ............................................................... 48
PRÁCTICA 7 : CARACTERÍSTICAS CULTURALES: MORFOLOGÍA DE
COLONIAS……........................................................................................................ 57
PRÁCTICA 8 : CURVA DE CRECIMIENTO ............................................................................... 62
PRÁCTICA 9 : CONTEO DIRECTO DE CÉLULAS MICROBIANAS .................................. 67
PRÁCTICA 10 : AISLAMIENTO DE BACTERIAS POR EL MÉTODO DE DILUCIÓN EN
PLACA.......................................................................................................................... 70
PRÁCTICA 11 : OBTENCIÓN DE ÁCIDO ALGÍNICO A PARTIR DEL ALGA Lessonia 70
PRÁCTICA 12 : AISLAMIENTO Y SELECCIÓN DE MICROORGANISMOS DE
INTERÉS INDUSTRIAL......................................................................................... 70
PRÁCTICA 13 : AISLAMIENTO Y CULTIVO DEL rhizobium..................................................... 81
PRÁCTICA 14 : OBTENCION DE ALCOHOL POR Sacharomyces cerevisae ................................ 83
PRÁCTICA 15 : DESARROLLO DE TRABAJOS DE INVESTIGACION FORMATIVA .. 86
5
Recomendaciones Generales
6
PRÁCTICA
BIOSEGURIDAD; MICROSCOPIA
I. OBJETIVOS
2.1 BIOSEGURIDAD
La bioseguridad es el conjunto de medidas preventivas de sentido común que tienen la finalidad de
proteger la salud, la integridad física, la seguridad de las personas en un ambiente determinado, frente a
diferentes riesgos biológicos físicos, psicológicos y mecánicos.
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2. La piel
• Cortaduras o rasguños.
• Transferencia indirecta de microorganismos a través de los dedos o utensilios contaminados
(lápices, bolígrafos, etc.).
3. Los ojos
• Salpicaduras de materiales infecciosos.
• Transferencia indirecta de microorganismos a través de los dedos contaminados.
4. Los pulmones
• Inhalación de microorganismos transportados por el aire (aerosoles).
2.2 MICROSCOPIA
El microscopio permite la observación de estructuras muy pequeñas que no pueden ser vistas a
simple vista. El poder de resolución de un microscopio está en relación inversa a la longitud de onda
de la luz usada.
1. Parte mecánica:
- Pie
- Columna (pilar, charnela y brazo)
- Tubo: Revólver
- Tornillo macrométrico o sistema de movimiento rápido
- Tornillo micrométrico o sistema de movimiento lento
- Platina: Pinzas sujetadoras de láminas y mandos coaxiales
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- Subplatina: Pieza que asciende y desciende condensador, anillo porta filtros, diafragma
iris y soporte para el espejo
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III. PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL
Proceda a enfocar una muestra, con objetivo 4X, 10 X, 40 X y 100X.
IV. CUESTIONARIO
V. OBSERVACIONES
VI. CONCLUSIONES
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PRÁCTICA
RECONOCIMIENTO DE ALGAS PROTOZOOS Y
CIANOBACTERIAS IN VIVO, COLORACION VITAL
I. OBJETIVOS
12
6. Luego, coloque una gota de colorante vital (rojo neutro o azul de metileno) en su preparado y observe
nuevamente los organismos unicelulares.
7. Haga un dibujo de lo observado y coloque los nombres correspondientes.
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III. EXAMEN EN FRESCO DE MICROORGANISMOS
1. Examen en Fresco
Es la forma más simple de realizar la preparación de un espécimen para su examen microscópico.
Las preparaciones en fresco se utilizan para observar microorganismos vivos.
b. Gota pendiente
Consiste en colocar una gota de líquido con microorganismos en un cubreobjetos y cubrirlo con un
portaobjetos (de forma invertida) con una excavación central (portaobjetos excavados). Se debe sellar
la preparación con vaselina alrededor de la excavación.
La ventaja de esta preparación es que no se seca y puede ser observada durante un tiempo más largo.
2. Coloraciones Vitales
Son los montajes de materia viva teñidos. Suelen utilizarse para ello, determinados colorantes (azul
de metileno, rojo neutro) a muy baja concentraciones (1/1000, 1/10000). Su objetivo es facilitar la
observación, mediante el colorante de la morfología y la estructura bacteriana, pero sin provocar
alteraciones celulares ni destruir la bacteria.
Material
- Microscopio
- Láminas cubreobjetos
- Láminas portaobjetos
- Agua destilada
- Asas de Kolle
- Muestra de levaduras in vivo
- Muestras fermentadas
- Cultivo de microorganismos
Metodología
- Si la muestra proviene de un líquido, con un asa de kolle se coloca una gota de líquido
sobre un portaobjeto, sobre el que se coloca un cubreobjeto.
- Si la muestra proviene de un cultivo sólido, se deposita primero una gota de suero
fisiológico sobre el portaobjetos, para luego con la ayuda del asa de kolle realizar una
suspensión y colocar un cubreobjetos.
- Observar al microscopio con objetivo 40X.
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Grafique la Observación y Resultados
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COLORACIONES VITALES
Estos tipos de exámenes pueden considerarse como preparaciones en fresco o como técnicas
intermedias entre éstas y las preparaciones fijadas y coloreadas. Son montajes de materia viva
teñidas.
Procedimiento
- Sobre el portaobjeto colocar una gota de colorante azul de metileno (l/l000).
- Colocar una gota de la muestra a examinar y con ayuda de una asa de kolle mezclar. Seguir
el procedimiento (muestra liquida o sólida).
- Observar al microscopio con el objetivo de 40X.
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OBSERVACION DE CIANOBACTERIAS
INTRODUCCION
Las bacterias y cianobacterias carecen de muchas de las estructuras internas propias de las
células eucarióticas. Así, el citoplasma de las procarióticas está rodeado por una membrana
plasmática y una pared celular (como en las células vegetales), pero no hay membrana nuclear
ni, por tanto, núcleo diferenciado. Las moléculas de ADN están en contacto directo con el
citoplasma. Además carecen de mitocondrias, retículo endoplasmático, cloroplastos y aparato
de Golgi. Aunque, en general, las células procarióticas carecen de estructuras internas
delimitadas por membrana, las cianobacterias, sí contienen numerosas membranas llamadas
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tilacoides, que contienen clorofila y pigmentos fotosintéticos que utilizan para captar la energía
de la luz solar y sintetizar azúcares (fotosíntesis).
Materiales:
Muestra biológicca: Nosstoc (murmunta hidratada)
Procedimiento Experimental
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V. CUESTIONARIO
VI. OBSERVACIONES
VII. CONCLUSIONES
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PRÁCTICA
PREPARACIÓN DE UN FROTIS BACTERIANO:
COLORACIONES: SIMPLE Y DIFERENCIAL -
TINCION Y MORFOLOGIA DE HONGOS
I. OBJETIVOS
- Observar células muertas en frotis seco y teñidas con diferentes procedimientos de coloración.
- Distinguir las características macroscópicas y las estructuras microscópicas de los Aspergillus,
Penicilium y Rhizopus
- Conocer mediante las características macroscópicas y microscópicas las especies de Aspergillus,
Penicilium y Rhizopus
- Conocer la aplicación de los géneros Aspergillus, Penicilium y Rhizopus en la industria.
Debido a que las bacterias y otros microorganismos son pequeños y su protoplasto posee un índice
de refracción cercano al agua, se requiere generalmente tinciones biológicas para visualizarlos
adecuadamente o demostrar el detalle de sus estructuras internas.
Los colorantes están constituidos en su mayoría por el anillo bencénico, y difieren uno de otro en
cuanto al número y disposición de estos anillos y a la sustitución de los átomos de hidrógeno por
otras moléculas. Algunos de los grupos cromóforos más comunes hallados en los colorantes son:
C=C, C=O, C=S, C=N, N=N, N=O, NO2.
La intensidad de coloración de colorante es proporcional al número de radicales cromóforos del
compuesto.
PARED CELULAR
El espesor oscila generalmente entre 0.150 m y 0.500 m de espesor, pudiendo incluso
alcanzar 0.8 m (Lactobacillus). Las paredes de las células jóvenes son más delgadas que las
células de cultivo antiguo.
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GRAMNEGATIVAS. Presentan 3 capas de envoltura distintas, dispuestas de manera laxa,
estas incluyen la membrana externa (ME), con voluta, arrugada con surcos u ondulante, que
contiene el antígeno o somático conocido como lipopolisacárido LPS, una capa densa
intermedia, y la membrana plasmática interna. Un espesor de 0.0075 m.
Los pasos a seguir para la realización de una preparación fijada y coloreada son:
c. Fijación. La fijación tiene como objeto la inmovilización de las estructuras del material a
estudiar en un estado lo más próximo posible al estado vivo. Consiste en una muerte rápida de
los microorganismos, debida a la coagulación de las albúminas protoplásmicas. Existe un gran
número de fijadores, tanto en forma simple (etanol, ácido pícrico). Las formas más habituales
de fijación son: por el calor y alcohol en frío.
a. Según su estructura química. Pueden clasificarse como Ácido o Básico, término que no
índica sus reacciones de pH en solución, sino, si una parte de la molécula es aniónica o
catiónica.
Los colorantes básicos, tiñen estructuras de naturaleza ácida, como la cromatina nuclear
de las células. Ej: Cristal violeta, Violeta de Genciana, Verde de Malaquita. Safranina.
Los colorantes ácidos, reaccionan con sustancias básicas, tales como estructuras
citoplásmaticas, y como colorante de contraste. Ej: ácido pícrico.
Los colorantes neutros, cuando se asocia un colorante ácido con uno básico. Ej: Wright,
Giemsa, Hematoxilina - Eosina.
Los colorantes indiferentes, suelen ser insolubles en agua y solubles en alcohol. Ej:
Sudán III.
a. Tinciones Simples. Son las que utilizan un solo colorante y permiten conocer la morfología
y tipo de agrupación bacteriana. ejplo. Tinción azul de metileno, Tinción fucsina.
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b. Tinciones Diferenciales. Utilizan más de un colorante y sirven para poner de manifiesto las
características de afinidad de los microorganismos por ciertos colorantes como; Tinción Gram,
Tinción ácido-alcohol resistente.
- Flamee el asa para siembra hasta que se ponga al rojo vivo. Sostenga el asa inmediatamente
arriba de la porción azul de la flama. Ponga el asa tan cerca de la posición vertical como
sea posible. Déjela enfriar (cuente hasta 20).
- Tome una porción de la muestra que se va examinar, colocando el asa en posición plana
en la superficie del líquido.
- Coloque el asa sobre el portaobjeto y aplánese ligeramente en el centro de éste (el
portaobjeto deberá estar numerado).
- Sosteniendo todavía el asa aplanada sobre el portaobjeto muévala trazando una espiral del
centro a la periferia. Debe dejar cierto espacio entre la muestra y cada uno de los 4 lados
del portaobjetos.
- Flamee de nuevo el asa hasta que esté al rojo vivo para destruir cualesquiera bacterias que
se encuentren en ella.
Fijación
- Confirme que el frotis se ha secado completamente al aire libre.
- Pase el portaobjeto tres veces a través de la llama del mechero de Bunsen, con la muestra
hacia arriba.
- Déjelo enfriar antes de aplicar la tinción.
Procedimiento
- Tome una lámina portaobjeto limpia, coloque una gota de agua destilada para hacer un
frotis.
- Con él esa tome una pequeña porción del cultivo en medio sólido y disuelva en la gota de
agua (cuando el cultivo es medio liquido no necesita de agua). Los frótices que se obtengan
no deben ser ni muy gruesos m muy finos.
- Deje secar a temperatura ambiente o pasando por la llama suavemente para obtener la
fijación del frotis.
- Cubrir la preparación con el colorante (2 o 3 gotas) y se deja actuar de unos 5 minutos.
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- Lavar bien con agua corriente, evitando que el chorro de agua caiga directamente sobre el
frotis, hasta quitar el exceso de colorante.
- Secar al aire, a temperatura ambiente.
- Observar al microscopio con lente de inmersión. (100X) y con aceite de inmersión.
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TINCIÓN DE SAFRANINA
Procedimiento
- Tome una lámina portaobjeto limpia, coloque una gota de agua destilada para hacer un
frotis.
- Con el asa tome una pequeña porción del cultivo en medio sólido y disuelva en la gota de
agua (cuando el cultivo es medio liquido no necesita de agua). Los frótices que se obtengan
no deben ser ni muy gruesos ni muy finos.
- Deje secar a temperatura ambiente o pasando por la llama suavemente para obtener la
fijación del frotis.
- Cubrir la preparación con el colorante de safranina (2 ó 3 gotas) y se deja actuar de unos
5 minutos.
- Lavar bien con agua corriente, evitando que el chorro de agua caiga directamente sobre el
frotis, hasta quitar el exceso de colorante.
- Secar al aire, a temperatura ambiente.
- Observar al microscopio con lente de inmersión. (100X) y con aceite de inmersión.
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3.3. COLORACIONES DIFERENCIALES
Material. Microscopio, Láminas portaobjetos, Set para la coloración de Gram, Asas de platino,
Gérmenes diferentes, Aceite de inmersión.
TINCIÓN GRAM
El cristal violeta actúa como un colorante primario, que se une a la pared celular bacteriana
luego de un tratamiento con una solución débil de iodo (Mordiente). Algunas bacterias debido
a su naturaleza química de sus paredes celulares, poseen la capacidad de retener el cristal violeta,
aún luego del tratamiento con un decolorante orgánico, tal como una mezcla de alcohol y
acetona. Tales bacterias se denominan Grampositivas.
Las bacterias Gramnegativas debido a su mayor contenido lipídico en su pared celular, pierden
la coloración primaria del cristal violeta cuando son tratadas con el decolorante. El colorante
secundario o de contraste utilizado es la safranina. Las bacterias Gramnegativas que han
perdido el cristal violeta, aparecen rojas o rosadas vistas al microscopio, habiendo fijado la
safranina como contracolor a sus paredes celulares.
Las bacterias aparecen de color azul, aunque el grado de absorción del colorante por los
diferentes microorganismos es variable, y algunas estructuras como las esporas absorben el
colorante con dificultad son así fácilmente diferenciables.
Reactivos
- Solución de Cristal Violeta(Cristal violeta= 1.0 g, Alcohol 95º = 20 ml, Agua destilada
csp=100 ml)
- Solución de Lugol (Yodo en cristales, 1.0 g, Yoduro de potasio= 2.0 g, Agua destilada=
100 ml)
- Decolorante (Acetona= 50 ml, Etanol= 50 ml) ó Etanol comercial
- Safranina ( Safranina= 0.25 g, Alcohol 95º= 10 ml, Agua destilada csp=100 ml)
Procedimiento
- Coloque una asada de caldo nutritivo que contiene una mezcla de bacterias Grampositivas
y Gramnegativas sobre una lámina portaobjeto limpia.
- Deje secar a temperatura ambiente o pasando por la llama suavemente para obtener la
fijación del frotis, con la finalidad de que el material no sea arrastrado durante el proceso
de tinción.
- Colocar el preparado sobre un soporte de tinción y cubrir la superficie con solución de
cristal violeta por 1 minuto. Lavar bien con agua de caño.
- Cubrir el preparado con Iodo de Gram durante 1 minuto. Lavar con agua.
- Sostener el portaobjeto entre el pulgar y el índice y bañar la superficie con unas gotas del
decolorante acetona-alcohol hasta no arrastrar más colorante violeta. Se requiere unos 10
segundos más o menos. También puede utilizar etanol comercial como decolorante , en
este caso dar más tiempo aproximadamente 1 minuto.
- Cubrir la superficie con la safranina durante 1 minuto. Lavar con agua de caño.
- Secar al aire, a temperatura ambiente.
- Observar al microscopio con lente de inmersión. (100X) y con aceite de inmersión.
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1. ASPERGILLUS
A. CARACTERISTICAS MICROBIOLOGICAS
Características morfológicas del hongo: tamaño y forma de las cabezas conidiales, Morfología de los
conidióforos, fiàlides y metulas, y en la presencia de células de Hulle y de esclerocios. En la siguiente
figura se muestra las principales estructuras morfológicas del género Aspergillus:
B. APLICACIONES INDUSTRIALES
INVERTASA O SACARASA.
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Origen y acción'. La hidrólisis de la sacarosa en glucosa y fructosa (azúcar invertido) puede ser realizada
por dos enzimas: la betafructosidasa, que actúa sobre el extremo fructosa de la molécula de sacarosa,
y la alfa-glucosidasa, que la ataca por el extremo de la glucosa. Actualmente, se entiende generalmente
por "invertasa" la beta-fructosidasa, que es producida por levaduras (Sacaromyces cerevisiae,
Candida), mientras que la alfa-glucosidasa constituye preferentemente las invertasas intestinales y de
hongos (Aspergillus oryzae).Rango de pH: 4-6.
• Lipasas: Las lipasas deben mezclarse con los lípidos para romperlos por hidrólisis, pero las
lipasas son solubles en agua y los lípidos son insolubles en agua. Por lo tanto, la hidrólisis sólo
ocurre en la interfase entre la gota lipídica y la fase acuosa, lo que causa que la reacción sea
relativamente lenta e inefectiva. Se busca desarrollar lipasas que permitan la remoción de manchas
de grasas a bajas temperaturas de lavado. Una combinación de búsqueda y manipulación genética
ha conducido a la introducción reciente de lipasas en los jabones en polvo. Un ejemplo es la lipasa
Hamicola , que se logró producir en Aspergillus otyzae y que se conoce como "Lipolasa".
El efecto de una enzima cruda obtenida de Aspergillus fumigatus, con actividad mixta principalmente
celulasa, hemicelulasa, quitinasa, xilanasa, pectinasa y proteasa; sobre el rendimiento en la extracción
de aceite a partir de las semillas de ajonjolí, de cacahuate y de girasol. Los niveles de porcentaje de
aceite extraído fueron de 51.4 a 56.7 % para el aceite de ajonjolí, de 51.0 a 53.2 % en el caso del aceite
de cacahuate y de 55.3 a 57.1 %
2. PENICILLIUM
Las especies de Penicillium son reconocidas por su denso cepillar como las estructuras de la espora-
cojinete.
Los conidióforos son simples o ramificados y son terminados por los racimos de fíales en forma de
botella.
Las esporas (conidios) se producen en cadenas secas de las extremidades de los fialides, con la espora
más joven en la base de la cadena, y son casi siempre verdes.
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La ramificación es una característica importante para identificar especie del penicillium. Algunos son no
ramificados y llevan simplemente un racimo.de fialides en la tapa del estípite. Otros pueden tener un
racimo de ramas, cada cojinete un racimo de fialides. Un tercer tipo tiene ramas el llevar de una segunda
pedido de ramas, llevando alternadamente un racimo de fialides. Estos tres tipos de sistemas del cojinete
de la espora (penicilli) se llaman monoverticillate, biverticillate y terverticillate respectivamente.
Colonias de crecimiento rápido, vellosas, aterciopeladas, verdosas con una corona radial ancha y blanca,
a 25 °C (no crecen o crecen pobremente a 37 °C) (Figura 66). Puede haber gotas de exudado sobre la
superficie de la colonia. Reverso habitualmente amarillento o cremoso. Esporulación abundante. Olor
aromático, especiado o afrutado (a manzanao a pina).
ECOLOGIA
El Penicillium es género grande y difícil encontrado casi por todas partes, y generalmente el género más
abundante de hongos en suelos. La ocurrencia común de la especie del Penicillium en alimento es un
problema particular. Unas ciertas especies producen las toxinas y pueden hacer el alimento no comestible
o aún peligroso. Es una buena práctica desechar los alimentos que demuestran el desarrollo de cualquier
moho.
Se le encuentra en el polvo doméstico, en los edificios húmedos y mohosos donde deteriora diferentes
materiales de construcción, entre los que resaltan el papel de decoración (crece bien en la cola empleada
para su adhesión a las paredes). No muestra una notable variación estacional. Las máximas
concentraciones de conidios en el aire se alcanzan en invierno y primavera (mayores en las áreas urbanas
que en las rurales).
3. RHYZOPUS
Las especies del Rhizopus son hongos filamentosos cosmopolitas encontrados en suelo, fruta que se
decae y las heces del vehículo, animales, y el viejo pan. En ciertas especies del Rhizopus son causas
ocasionales del zygomycosis (phycomycosis). Pueden causar infecciones serias (y a menudo fatales) en
seres humanos y animales debido a su tarifa de crecimiento rápida. En ciertas especies son patógeno de
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la planta, y uno, oligosporus del Rhizopus, se utiliza en la producción del tempeh, un alimento fermentado
derivado de las sojas.
Las especies del Rhizopus producen las esporas de dos diversas maneras. Los sporangiospores son el
interior producido a pinhead-como la estructura, el esporangio, y son genético idénticos a su padre, los
zygospores se producen después de que dos mycelia se fundan durante la reproducción sexual, y dan
lugar a las colonias que pueden ser genético diferentes de sus padres.
EL GÉNERO MUCOR
Se caracteriza por no formar estolones ni rizoides. Por estos motivos, sus especies invaden lentamente
los medios de cultivo.
EL GÉNERO RHYZOPUS
Posee estolones y rizoides, razón por la cual invaden rápidamente los medios de cultivo. En este Género
los esporangióforos nacen en los nudos de los estolones, o sea sobre los rizoides.
EL GENERO ABSIDIA
Los esporangióforos derivan internodalmente de segmentos de hifas entre rizoides.
APLICACIONES INDUSTRIALES
Importancia económica, síntesis de productos industriales: producción de ácidos láctico, cítrico,
succínico, oxálico, etc. Y alimentos populares orientales: su-fu y tem-pe
Mucor racemosus: Se presenta en dos formas según el medio en que se desarrolle. Una forma típica o
filamentosa, en medios sólidos y otra forma atípica o levaduriforme que por lo general aparece en los
medios líquidos y que es aprovechada en la industria para obtener etanol por fermentación de mostos
azucarados, en cambio, la forma típica se usa para obtener enzimas (amilasas).
Mucor rouxil: Hidroliza el almidón posteriormente y posteriormente fermenta los azúcares formados
en la hidrólisis anterior produciendo etanol en forma lenta, por lo cual es conveniente sembrar una
levadura a las 24 horas de desarrollo de Mucor para facilitar la fermentación alcohólica. Esto es en síntesis
lo que se conoce con el nombre de proceso amilo. La forma típica se emplea para la fabricación de
amilasas.
Rhyzopus nigricans: Es un hongo de bajo poder amilolítico, puede hidrolizar el almidón y producir
etanol, pero en menor proporción que otras especies, por lo cual no se lo aplica en la industria de
fermentación alcohólica, en cambio, en los últimos años se
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IV. PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL: TINCION Y MORFOLOGIA DE HONGOS
A. MATERIAL
B. MATERIAL BIOLOGICO
Muestras de alimentos con hongos
Cultivo de Aspergillus niger
Cultivo de Penicillium
C. REACTIVOS
2. CULTIVOS
A. FUNDAMENTO
Es un medio recomendado para el aislamiento de hongos, particularmente a aquellos asociados a
infecciones dermatológicas. Su bajo pH inhibe el desarrollo de muchas bacterias contaminantes que
pueden estar presentes en la muestra.
B. COMPOSICION
C. PREPARACION
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I. RESULTADOS
A. ASPEGILLUS NIGER
B. ASPERGILLUS FUMIGATUS
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C. ASPEGILLUS FLAVUS
D. PENICILLIUM
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a. RHYZOPUS
b. MUCOR
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V. CUESTIONARIO: COLORACION SIMPLE Y DIFERENCIAL
VI. OBSERVACIONES
VII. CONCLUSIONES
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PRÁCTICA
EQUIPO Y MATERIAL DE LABORATORIO;
ACONDICIONAMIENTO Y ESTERILIZACIÓN
I. OBJETIVOS
1) Dar a conocer al estudiante las técnicas para el acondicionamiento y esterilización de materiales y
equipos más empleados en un laboratorio de microbiología industrial.
El mecanismo por el cual los organismos son destruidos se basa en los efectos letales del calor seco
debido a la desecación en general, lesión por oxidación y efectos tóxicos de los niveles de electrólitos.
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a) Flameo o Llama Directa. Consiste en exponer los materiales a esterilizar (asas y agujas de
kolhe, espátulas, pinzas, tijeras, etc.) al contacto de la llama de un mechero para eliminar
rápidamente los microorganismos del entorno; Ejemplo: mechero de Bunsen.
b) Aire Caliente. Para ello se utiliza un horno bacteriológico u horno Pasteur, donde se esteriliza
el material a temperaturas de 170º-180ºC por 2 horas. Es generalmente empleado para esterilizar
material de vidrio.
Se usa el vapor, tanto porque las bacterias se mueren más rápidamente cuando se encuentran
húmedas como porque el vapor proporciona un medio de distribuir el calor uniformemente en todas
partes del recipiente de esterilización, el vapor debe conservarse a una presión de 1000g/cm3 sobre
la presión atmosférica para obtener una temperatura de 121ºC. Se produce también rupturas de
cadena única en el ADN, y la pérdida de la viabilidad de las células expuestas a calor leve puede
correlacionarse con la introducción de estas rupturas. La lesión de ADN parece ser enzimática,
como resultado de activación o liberación de una nucleasa.
a) Por Ebullición. Se coloca el material a esterilizar en agua hirviendo (100ºC) por 15-35 minutos.
b) Vapor de agua sin Presión. Se coloca el material a esterilizar a la acción del vapor de agua y a
temperatura no mayor de 100ºC; para ello puede hacer uso del autoclave con la espita abierta.
Se utiliza para materiales termolábiles como es el caso de algunos medios de cultivo.
c) Vapor de agua con Presión. Se realiza en un autoclave a 15 libras de presión y 121ºC por 15-
20 minutos. Se emplea para esterilizar medios de cultivo y todos aquellos materiales que no
pueden esterilizarse por calor seco. Se puede usar; autoclave, pasteurización o tindalización.
♠ Caldera de material resistente, fondo cóncavo cubierta de una camisa metálica cilíndrica.
♠ Dispositivos para la instalación de la fuente calorífica (gas, electricidad o vapor de agua).
♠ Orificios superiores para purga de gases de combustión.
♠ Tapa con válvula de seguridad, espita, manómetro.
♠ Canastilla para colocar el material a esterilizar.
Consiste en hacer pasar las sustancias líquidas o gaseosas a esterilizar a través de membranas porosas
que retienen a los microorganismos; sirve para la esterilización de sustancias termolábiles. El
material filtrante puede ser de porcelana, tierras de infusorios, acetato de celulosa, etc.
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Poseen efectos letales y mutagénicos en las bacterias presentando su mayor efectividad como agente
bactericida en la región espectral de alrededor de los 260 nm. de longitud de onda, éste método
presenta muchas dificultades técnicas.
- Los tubos, matraces y frascos antes de su esterilización deben llevar sus tapones de algodón
respectivamente, los cuales deben cerrar suavemente no muy flojos ni apretados, ni largos
ni cortos, preparados según el método siguiente:
- De acuerdo al tapón a confeccionar se toma el pedazo convenientemente de algodón de
fibra, extendida, rectangular
- Practicar un dobles de 1/3 a lo largo de la fibra.
- Enrollar de un extremo, presionando sobre si mismo hasta completar toda la longitud.
- Rotar con los dedos el trozo confeccionado aplastando para dársele la forma de cono
truncado, con el diámetro a la medida del recipiente a taponar, el tapón debe entrar en el
recipiente hasta la mitad, y el otro medio quedar fuera. Se pueden preparar los tapones
envueltos en gasa para evitar el hilachamiento.
Tubos de Ensayo
- Formar un paquete de tubos de ensayo taponados, empaquetarlos con papel kraft y
amarrarlos, en su defecto se le envuelve con papel sólo la zona de las bocas.
Frascos y Matraces
- Los frascos y matraces se taponan con algodón, se cubre con papel kraft y se amarra con
hilo pabilo.
- Colocar el nombre del medio de cultivo
- Rotular la fecha de preparación.
El procedimiento de esterilización por aire caliente sólo se puede emplear con utensilios de vidrio
o metal.
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V. CUESTIONARIO
2. ¿Cree usted que es importante acondicionar y esterilizar los materiales antes del control
microbiológico, por qué?
3. Cite en forma ordenada cada uno de los pasos a seguir para poner en funcionamiento el
autoclave.
4. Compare la resistencia al calor de las células vegetativas con esporas bacterianas. Y explique a
que se debe tal diferencia.
VI. OBSERVACIONES
VII. CONCLUSIONES
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PRÁCTICA
MEDIOS DE CULTIVO
I. OBJETIVOS
a. Identificar las diferentes condiciones de un medio de cultivo para que pueda llevarse a cabo un
crecimiento microbiano.
b. Describir los medios de cultivo más empleados en bacteriología.
c. Conocer las aplicaciones y utilidades de los medios de cultivo más corrientes.
d. Saber manejar el material que se emplea en la elaboración de cualquier medio de cultivo.
El medio proporciona los elementos necesarios para el crecimiento microbiano. De acuerdo con
esto, siempre se requerirá una fuente de energía y una fuente no energética como son las sales,
factores de crecimiento, etc., que sin proporcionar energía son necesarias para su desarrollo.
A. FUENTES DE CARBONO
En la mayor parte de los casos, la fuente de carbono corresponde a azúcares en forma de mono o
disacáridos, como glucosa, lactosa, maltosas etc., e incluso hay microorganismos que pueden utilizar
azúcares más complejas para obtener energía., como es el caso del almidón.
Existen también bacterias capaces de utilizar el gas carbónico CO2 hecho que es característico de
las bacterias fotosintetizantes y quimiolitótrofas.
Otros microorganismos pueden crecer a expensas del metano, benceno e, incluso hidrocarburos
como fuente de energía: Ejemplo: Cladosporium.
Por último, existen especies como Pseudomonas que pueden utilizar como fuente de energía un gran
número de componentes hidrocarbonados diferentes.
B. FUENTE DE NITROGENO
Pueden presentarse como proteínas completas, que sería el caso de la gelatina o incluso proteínas
aún más complejas, como es el caso de los extractos de carne, sales de amonio, o como peptonas
etc.
Es frecuente encontrar peptonas como fuente de nitrógeno que corresponden a péptidos o
polipéptidos dependiendo de su complejidad pero en cualquier caso son también proteínas que
están parcialmente hidrolizadas, aunque no se las deba considerar como tal.
El bio-Thione, es una denominación comercial correspondiente a una peptona pépsica de carne.
La caseína en forma de peptona tripsica de caseína se usa para estudiar la formación de indol por
parte de la bacteria debido al alto contenido de triptófano que posee este tipo de peptona. También
es utilizada para estudiar la reducción de los nitratos e incluso para el cultivo de algunos protozoos.
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La peptona papaínica de soja, es una fuente de nitrógeno especialmente para hongos y ciertos
gérmenes como Neisserias.
Otra fuente de nitrógeno serian: nitratos, nitrógeno orgánico, amoniaco, sales de amonio,
aminoácidos, etc.
A. FUENTE DE AZUFRE
Todos los microorganismos que utilizan en su metabolismo azufre lo hacen mayoritariamente en
forma de sulfatos, a veces en forma de tiosulfatos y en otras ocasiones lo pueden obtener a partir
de algún aminoácido, ejemplo: metionina, cisterna, tiamina, etc.
Ejemplo de medios de cultivo: TSI, LIA, SIM, SS.
B. FUENTE DE FÓSFORO
En general, las bacterias que utilizan el fósforo lo suelen hacer en forma de fosfato.
C. IONES METÁLICOS
Son utilizados por las bacterias bajo la forma de iones a concentraciones muy bajas. Por ej: el Sodio,
el Potasio, Magnesio, Hierro, etc.
También se encuentra otro tipo de iones metálicos Cobalto, Molibdeno.
Estos iones son esenciales para el crecimiento microbiano y dependiendo de su concentración
pueden inhibir el ‘crecimiento de otros, como el caso del sodio que a concentraciones altas inhibe
el crecimiento de un tipo de microorganismo y facilita el crecimiento de otros.
- Agar Manitol Salado, contiene 7.5% ClNa permite el crecimiento de Staphylococous.
- Agar Streptococus KF contiene 6.5% ClNa permite el crecimiento del Enterococus.
D. FACTORES DE CRECIMIENTO
Existen bacterias que aún con los medios antes descritos no crecen o, si lo hacen, es muy
lentamente. A este tipo de bacterias les hace falta además una serie de componentes definidos que
no son capaces de fabricar por sí solas.
A este tipo de componentes se denomina factores de crecimiento y van a corresponder a algún tipo
de aminoácido de bacterias muy exigentes o incluso vitaminas, bases púricas o pirimidinicas, etc.
Ejemplo de medios de cultivo y microorganismos:
- Agar sangre enriquecido con metionina, ácido glutámico y ácido nicotinico para el crecimiento
de Xanthomonas.
- El Agar Chocolate permite el desarrollo de colonias húmedas, lisas y grises del Haemophylus
influenzae. Este medio contiene hematina (factor X) y está enriquecido con otros cofactores,
como el NAD (factor V), que permite el desarrollo de este microorganismo.
- Agar Sangre enriquecido con Glicerol - papa (Bordet Gengou) para crecimiento de Bordetella
pertusis. Se observa colonias en “gotas de mercurio” brillantes es fácil de apreciar.
- Agar sangre enriquecido con nitrógeno suplementario y vitaminas del complejo B para el
crecimiento del Flavobacterium.
E. FACTORES INHIBIDORES
Son componentes que van a impedir el crecimiento de algún tipo de microorganismo por bloqueo
de sus procesos metabólicos.
Los antibióticos son agentes inhibidores o destructores de la propia bacteria.
La azida sódica inhibe el crecimiento de los Gramnegativos.
Algunos colorantes: Eosina Azul de metileno impide el crecimiento bacteriano de los
Grampositivos.
Cristal Violeta impide el crecimiento de los Grampositivos.
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Las sustancias inhibidoras son muy útiles para la identificación y tipificación de pruebas
bioquímicas de las bacterias.
B. GRADO DE HUMEDAD
Va a corresponder a la cantidad de agua que va a necesitar la bacteria para su crecimiento.
En general, cualquier medio sólido o líquido requiere cierta proporción de agua.
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En medios sin agua es muy difícil el crecimiento bacteriano: de ahí que la liofilización y cualquier
método de deshidratación, sea un buen medio de conservación.
C. pH
Cada especie tiene un rango definido de pH para su crecimiento y un pH óptimo de crecimiento.
- Los acidófilos tienen un valor de pH óptimo de crecimiento entre 0 y 5.5.
- Los neutrófilos, entre 5.5 y 8.0
- Los alcalófilos prefieren un rango de pH entre 8.5 y 11.5
La mayoría de las bacterias y protozoos son neutrófilos.
La mayoría de hongos prefieren medios ligeramente ácidos, con valores de pH de 4 a 6.
Variaciones intensas en el pH pueden dañar a los microorganismos alterando la membrana plasmática
o inhibiendo la actividad de las enzimas y las proteínas transportadoras.
El pH óptimo en la mayoría de los casos es cercano a la neutralidad.
Los tiobacilos pueden crecer mejor a pH muy ácido, a pH próximo a 0.
Los bacilos ureasa positivo tal como Proteus crece a pH cercano a 8.
El Vibrio Cholerae crece bien a pH 9.
En un medio de cultivo pueden aparecer variaciones de pH como consecuencia de los metabolitos
que se producen por la degradación de los nutrientes por parte de las bacterias. Es típico que en la
fermentación glucídica se produzca acidificación del medio o en la degradación proteica utilizando la
bacteria sales amónicas como fuente de energía se alcalinice el medio.
Siempre es necesario tamponar el medio de cultivo, al menos al comienzo para mantener el pH dentro
de los límites fisiológicos.
Límite Límite
Microorganismo pH óptimo
inferior superior
Picrophilus oshimae 0 0.7 SD
Thiobacillus thiooxidans 0.5 2.0-3.5 6.0
Sulfolobus acidocaldarius 1.0 2.5 4.0
Lactobacillus acidophilus 4.0-4.6 5.8-6.6 6.8
Staphylococcus aureus 4.2 7.0-7.5 9.3
Proteus vulgaris 4.4 6.0-7.0 8.4
Escherichia coli 4.4 6.0-7.0 9.0
Clostridium sporogenes 5.5-5.8 6.0-7.6 8.5-9.0
Pseudomonas aeuriginosa 5.6 6.6-7.0 8.0
Nitrosomonas 7.0-7.6 8.0-8.8 9.4
Bacillus pasteurii 8.5 SD SD
Bacillus alcalophilus 8.5 10.6 11.5
D. PRESIÓN OSMÓTICA
Se suele trabajar en condiciones de isotonia (300 miliosmoles) aunque existen muchas bacterias que
pueden crecer a concentraciones algo superiores.
Las bacterias pueden mantenerse vivas y crecer en medios muy acuosos e hipotónicos; este hecho es
debido a su pared rígida que permite que el agua no penetre en la bacteria y ésta se rompa.
En las bacterias halófilas, su crecimiento so produce especialmente a concentraciones muy altas de
cloruro sódico; Ej: Staphylococus.
Como la concentración osmótica de un hábitat tiene efectos tan marcados sobre los microorganismos,
es de gran utilidad expresar cuantitativamente el grado de disponibilidad del agua. Se emplea la
actividad de agua (aw).
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1.00 (agua pura) Sangre Mayoría de Gramnegativos
no halófilos
0.95 Pan Bacilos Grampositivos, Basidiomycetes
0.90 Jamón Cocos, Bacillus, Fusarium, Mucor, Rhizopus
0.85 Salami Staphylococus, Saccharomyces
0.80 Conservas Penicillum
0.75 Lagos salados Halobacterium, Aspergillus
Pescado salado Actinospora
0.70 Cereales, dulces Aspergillus
0.60 Chocolate Saccharomyces
Leche Xeromyces
deshidratada
E. CONCENTRACION DE OXÍGENO
Un organismo que puede crecer en presencia de oxígeno atmosférico es AEROBIO, mientras que
otro puede crecer en su ausencia, es ANAEROBIO.
Los ANAEROBIOS FACULTATIVOS no precisan de Oxigeno para crecer, pero lo hacen mejor
en su presencia.
Los ANAEROBIOS AEROTOLERANTES como Enterococcus faecalis pueden crecer bien tanto
en su presencia como en su ausencia.
Por el contrario los ANAEROBIOS ESTRICTOS U OBLIGADOS, ejemplo: Bacteroides.
Fusobacterium, Clostridium, no toleran en absoluto el oxigeno y mueren en su presencia.
Los anaerobios tolerantes y los estrictos no pueden producir energía mediante la respiración aerobia
y deben utilizar vías de fermentación o respiración anaerobia para este objetivo.
Finalmente existen unos pocos microorganismos como el Campylobacter, que son
MICROAEROFILOS que son dañados por el nivel de oxigeno atmosférico 20% precisando para
su crecimiento niveles del 2 al 10% de Oxígeno.
Existen muchos tipos distintos de medios de cultivo, así como diferentes clasificaciones. De acuerdo
con esto y según criterios se podrían dividir en:
A. MEDIOS SÓLIDOS
Corresponden a aquellos medios donde la proporción en agar está siempre por encima del 15%.
La importancia, de los medios sólidos es muy grande, pues permite el aislamiento, purificación y
visualización del crecimiento en colonias, así como su posible identificación a través de medios
específicos y diferenciales de caracteres, sólidos elaboración de antibiogramas, etc.
Ejemplo de medios de cultivo:
- Agar Mac Conkey, permite el crecimiento de microorganismos Gramnegativos.
- Agar EMB, permite el crecimiento de coliformes.
- Agar Chapman, permite el crecimiento de Staphylococcus.
- Agar Sabouraud, permite el crecimiento de hongos.
- Agar Nutritivo, permite el estudio de la morfología de las colonias.
B. MEDIOS LÍQUIDOS
También denominados caldos, no contienen agar. Son de gran utilidad para la realización de recuentos
bacteriológicos por turbidimetría, especialmente útil en levaduras, para la realización de inóculos, para
obtener metabolitos primarios o secundarios, de los microorganismos como: antibióticos, ácidos
lácticos, etc.
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Ejemplo de medios de cultivo:
- Caldo MRVP, para investigar la ruta utilizada en la degradación de glucosa.
- Caldo Peptona, para investigar la producción de Indol.
- Caldo Lactosado, para investigar la formación de ácido y gas
- Caldo BHI, permite el crecimiento de microorganismos considerados difíciles de cultivar.
C. MEDIOS SEMISÓLIDOS
Son medios intermedios entre los líquidos y los sólidos; su proporción en agar suele ser inferior al 5%
pero siempre presentan una cierta cantidad que le proporcione consistencia semisólida. Son útiles
para algunas pruebas bioquímicas:
- Agar SIM, estudiar movilidad, producción de H2S, Indol.
- Agar MIO, estudiar movilidad, producción de Indol y Ornitina.
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C. MEDIOS DE MANTENIMIENTO DE CEPAS
Son medios que suelen tener los nutrientes necesarios para mantener a las cepas vivas durante
períodos de tiempo relativamente largos manteniéndose tales medios generalmente a temperaturas lo
suficientemente bajas en cada caso como para impedir su crecimiento. Ejemplo, leche descremada
que congelada se utiliza a menudo para mantener cepas durante meses.
d. MATERIAL REQUERIDO
- Matraces 250 ml, 100 ml. 50 ml Probetas de 50ml, 100 ml. Baguetas. Balanza. Espátula.
Agua destilada. Placas Petri .Tubos de ensayo.
e. MEDIOS DE CULTIVO
- Agar nutritivo. Agar TSI. Agar Citrato de Simmons. Agar Mac Conkey
Agar Sabouraud. Agar LIA .
4.1. PREPARACIÓN
- Para la preparación de medios de cultivo se usa agua destilada.
- El medio de cultivo a preparar debe ser pesado, según la cantidad que está indicada en la
etiqueta del medio de cultivo.
- Agregar el medio de cultivo en el matraz, y añadir la mitad del volumen de agua que se
requiere, agitar suficientemente para conseguir una suspensión homogénea, después
incorporar el agua restante, aprovechando esta adición para desprender e incorporar al
conjunto las partículas del medio de cultivo que hubieran quedado adheridas a la pared
interna del recipiente.
- Los medios nutritivos que contienen agar deben ser calentados para conseguir su disolución.
- Para reconocer que se ha alcanzado una disolución completa, al agitar no debe adherirse el
medio a la pared interna del recipiente; la solución es viscosa y resbala libremente.
- Tapar el matraz con el tapón de algodón, envolver con papel Kraft y pabilos.
4.2. ESTERILIZACION
- Se esterilizará el medio de cultivo, ya disuelto en el autoclave en caso de ser necesario.
- El tiempo es de 15 minutos a 121ºC.
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4.3. REPARTICION DE LOS MEDIOS DE CULTIVO
- Debe verterse el medio de cultivo a una temperatura de 45-55ºC.
- Previamente hay que remover el medio de cultivo haciéndolo oscilar en sentido circular su
recipiente para garantizar la homogeneidad del medio.
- Los tubos llenos con medios de cultivo esterilizado, todavía líquido, se colocan en la
posición deseada:
o Pico y Fondo o Pico de flauta o semi inclinado
o Pico o inclinado
o Fondo
o El medio de cultivo se deja solidificar en la posición lograda.
- Repartir:
o En Placas (aproximadamente 16 a 20 ml) los siguientes medios de cultivo:
Agar nutritivo
Agar Mac Conkey
Agar EMB
Agar Sabouraud
o En Tubos: la posición de pico y fondo (aproximadamente 4 ml)
Agar TSI
Agar LIA
o En Tubos: la posición de pico (aproximadamente 2 a 3 ml)
Agar Citrato de Simmons
o En tubos: la posición de Fondo (aproximadamente 3 ml)
Agar SIM
4.4. ALMACENAMIENTO
- Los medios de cultivo deshidratados deberán conservarse en lugar seco, protegidos contra
la luz, a una temperatura de 15ºC a 30ºC, y en envases bien cerrados.
- Los medios de cultivo preparados, listos para su uso, tienen un sólo tiempo limitado de
conservación. Cuando no se indique otra cosa y bajo condiciones adecuadas de conservación
es de varios meses. Se recomienda temperatura de 4 – 8ºC.
- Las placas Petri, preparadas con el medio de cultivo, deberán pre encintarse con cinta
adhesiva su borde lateral, para impedir fugas entre el cuerpo de la placa y la tapa.
AGAR NUTRITIVO
Composición
Peptona, 17.0 g. Extracto de carne, 3.0 g. Cloruro de sodio, 5.0 g
Agar – Agar, 12.5 g. Agua destilada, 1000 m
Preparación
Pesar 2,3 gramos de agar nutritivo y enrasar a 1000ml con agua destilada.
Preparación
MEDIO EMB.
Composición
Fosfato dipotásico, 1.0 g. , 5.0 g. Sulfato de magnesio, 0.2 g, peptona, azul de metileno, lactosa,
sacarosa, caseina, Agar – Agar, 12.5 g. Agua destilada, 1000 ml
Preparación
OBSERVACIONES
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Dilución de los medios de cultivo:
45
Esterilización:
46
AGAR TSI
AGAR LIA
SIMONS
SIM
47
MC
AN
EM
48
CONCLUSIONES
49
50