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Phyllomedusa 14 (2): 89-97, 2015´

© 2015 Universidad de San Pablo - ESALQ


ISSN 1519-1397 (impresión) /ISSN 2316-9079 (en línea)
doi: http://dx.doi.org/10.11606/issn.2316-9079.v14i2p89-97

La evidencia de la contribución paterna múltiple en


Podocnemis sextuberculata (testudines:
Podocnemididae) detectada por los marcadores de microsatélites
Cleiton Fantin 1 Dorothy Ivila Melo Pereira 1, Jorge Frank Ferreira 1, Paulo Cesar Andrade
Machado 2, Tomas Hrbek 2, Luiz Alberto Santos Monjeló 2, y Izeni Pires Farías2
1 Departamento de Biología, Universidad del Estado de Amazonas, Av. Djalma Batista, 2470, 69050-010, Manaus, AM,
Brasil. E-mail:cleitonfantin@hotmail.com.
2 Departamento de Biología, Laboratorio de Genética Animal e Evolução, Universidade Federal do Amazonas, Av.

Rodrigo Octávio Jordão Ramos, 3000,69077-000, Manaus, AM, Brasil.

Abstract
Evidence of multiple paternity in Podocnemis sextuberculata (Testudines:
Podocnemididae) detected by microsatellite markers. We found evidence of multiple
paternity in a sample of 12 Podocnemis sextuberculata nests including seven nests (80
hatchlings) collected along the Amazonas River, in the municipality of Barreirinha, AM,
Brazil and five nests in the Abufari Biological Reserve, Tapauá, AM, Brazil (54 hatchlings).
As observed in other species of the genus, P. sextuberculata also presented polyandric
behavior. By means of allelic frequency and variation in six microsatellite loci for each
location, the occurrence of multiple paternity in sampled nests of this species was inferred,
even though the maternal genotype was unknown. For one of the nests, a minimum of four
males contributed to the clutch, whereas for nearly all remaining nests at least two males
contributed. Only one of the twelve nests did not show clear evidence for contributions
from more than one male. This is the first genetic evidence of multiple paternity in P.
sextuberculata.

Keywords: mating system, paternity, Podocnemis, reproduction, turtles.

Resumen
La evidencia de la contribución paterna en Podocnemis sextuberculata (testudines:
Podocnemididae) detectada por los marcadores de microsatélites. Encontramos evidencias
de paternidad múltiple en una muestra de 12 nidos de Podocnemis sextuberculata, incluyendo 7
nidos(80 crías) recolectados a lo largo del rio Amazonas, ene el municipio de Barreirinha, AM,
Brasil; y 5 nidos en la Reserva Biologica de Abufari, Tapauá, AM, Brasil (54 crías).
Como se observó en otras especies del género, P. sextuberculata también presentó un
comportamiento poliandríco. Mediante la frecuencia alélica y la variación en seis loci de
microsatélites para cada ubicación, se infirió la ocurrencia de paternidad múltiple en nidos
muestreados de esta especie, aunque el genotipo materno era desconocido. Para uno de los nidos, un
mínimo de cuatro machos contribuyeron a la nidada, mientras que para casi todos los nidos
restantes contribuyeron al menos dos machos. Solo uno de los doce nidos no mostró evidencia clara
de contribuciones de más de un macho. Esta es la primera evidencia genética de paternidad múltiple
en P. sextuberculata.

Palabra clave: sistema de apareamiento, la paternidad, Podocnemis, reproducción, tortugas.


Introducción erythrocephala y P. unifilis (Pearse et al. 2006,
Fantin et al. 2008, Fantin et al. 2010). P. expansa
La fauna de tortugas de América del Sur es rica y las hembras muestran un comportamiento
variada, comprende alrededor del 20% de las poliándricas que varía las tasas de paternidad
especies que viven en el mundo (Pritchard, 1975). múltiple entre diferentes localidades (Valenzuela
2000, Pearse et al. 2006).
El género Podocnemis comprende seis especies,
incluyendo Podocnemis sextuberculata (Cornelia, Fantin et al. (2008), encontraron paternidad
1849), conocido popularmente como tortuga múltiple en los estudios de nidos en P. unifilis; y
cupiso. La coloración del caparazón varía de claro Fantin et al. (2010) informó de paternidad
a marrón oscuro. El macho adulto es más pequeño múltiple en nidos de P.erythrocephala. Sin
que la hembra y, en individuos jóvenes plastrón embargo, las observaciones sobre la patrón
tiene seis tubérculos de color gris o marrón, que reproductivo en P. sextuberculata aún no han sido
da a la especie su nombre (IBAMA 1989). Su reportados.
distribución geográfica se extiende a lo largo de la
cuenca del río Amazonas en Brasil, Perú y Los datos moleculares se han utilizado
Colombia (Ernst y Barbour 1989, Iverson 1992). ampliamente para estudiar los sistemas de
apareamiento de quelonios (DeWoody et al. 2000,
Realizan nidos en los río y playas, una o dos Neff et al. 2000, Valenzuela 2000, Myers y
veces al año, ponen de 8-19 huevos elípticos Zamudio 2004, Pearse et al. 2006). Entre las
(Ferri 2002).P. sextuberculata su carne ha sido técnicas moleculares disponibles, marcadores de
intensamente consumido y comercializado microsatélites han sido la herramienta más
ilegalmente en la región amazónica, que frecuentemente aplicada y con éxito para
contribuyó a la inclusión de esta especie en la lista determinar patrones de paternidad en las especies
roja de especies amenazadas como vulnerables. de tortugas.
En este estudio, se utilizó marcadores
Los estudios de los sistemas de apareamiento de microsatélites para determinar el sistema de
las tortugas han avanzado sustancialmente en las apareamiento en dos P. sextuberculata
últimas décadas (Galbraith 1991, Galbraith et al. poblaciones.
1993, Bowen y Karl 1996, Rieder 1996, Curtis
1998, FitzSimmons 1998, Crim et al. 2002, Moore Pusimos a prueba la hipótesis de que el sistema
y la bola de 2002, Jensen et al. 2006, Zbinden et reproductivo de esta especie es poliándricas como
al. 2007, Refsnider 2009, Theissinger et al. 2009, se observa en otras especies de este género. Este
Fantin et al. 2010, Stewart y Dutton 2011, Lasala estudio proporciona información valiosa para los
et al. 2013, Todd et al. 2013). Sin embargo, el programas de conservación y gestión. Proporciona
hecho de que la mayoría de las especies son una mejor comprensión de la biología
acuáticas el comportamiento en la naturaleza y es reproductiva de la especie y se espera estimular a
responsable de la falta de información para la otros estudios de la biología de P. sextuberculata
mayoría de las especies (Carpenter y Ferguson y especies afines.
1977).
Materiales y métodos
Ciertos aspectos de la reproducción de quelonios,
como la fidelidad del sitio de nidación, pero Se estudiaron un total de 12 nidos de dos
muchos investigaron el uso molecular, pero localidades para este informe. 80 crías reciente de
muchos otros todavía permanecen sin estudiar P. sextuberculata fueron recolectadas a lo largo
(Bowen y Karl 1996). El análisis de parentesco de del río Amazonas en Barreirinha-AM (03°03 ' 25 ''
los nidos de tortuga puede revelar aspectos S, 57°10 ' 28 '' W) (Figura 1), y 54 crías se
fundamentales de la biología de la reproducción recogieron en la Reserva Biológica Abufari,
dentro de una población, pero la mayoría de los Tapauá-AM. El permiso para recolectar muestras
esfuerzos están limitados por el pequeño tamaño de tejido fue concedida por la RAN / IBAMA (nº
de la muestra y / o marcadores ambiguos, y no 113/2006).
queda claro si la paternidad múltiple es la
excepción o la regla. La colección de las crías se hizo con el apoyo de
los miembros del proyecto Pé-de-Pincha (UFAM),
Trabajos recientes han demostrado múltiples que seleccionaron al azar los nidos. Los nidos
paternidad en P. expansa, P. erythrocephala y P. fueron trasplantadas a un lugar conocido como “el
vivero”, protegido por la comunidad local. Para La extracción de ADN se realizó utilizando una
evitar la mezcla de las crías de diferentes nidadas, Kit GFX (GEHealthcare), De acuerdo con las
los nidos fueron separados unos de otros por instrucciones del fabricante. La paternidad se
pequeñas vallas. analizó mediante el uso de seis loci de
microsatélites diferentes para cada ubicación. Para
Una vez comenzó la eclosión, obtenido a través de las crías del río Amazonas, Barreirinha-AM,
la punción de la vena femoral usando una jeringa cuatro de los primeros pares utilizados para la
de 1 mL hasta 500μL de sangre. Las muestras se amplificación de ADN fueron inicialmente
almacenaron en tubos Eppendorf con 500 ml de desarrollados para la amplificación de ADN
etanol absoluto. para P. unifilis por Fantin et al. (2007), el
Los animales fueron puestos en libertad en los
quinto fue desarrollado para P. expansa por
sitios donde habían sido recogidos. El total de
nidos y crías por nido se enumeran en la Tabla 1.
La muestra de sangre materna no se
recolectó, por lo que genotipo materno fue
desconocido.

Figura 1. Mapa que muestra la ubicación de los sitios Barreirinha y Tapauá para los nidos de
Podocnemis sextuberculata estudiados en el presente trabajo.
Tabla 1. Número de alelos maternos inferido / número de alelos para cada locus se encontró en nidos de
Podocnemis sextuberculata. Los alelos maternos se infiere por la presencia de homocigotos jóvenes, y
los resultados en negrita indican la presencia de aporte extra de par.

Número de
Nido Método simple de conteo alélico
Crías

Número de
hermano completo
familias

Sites Jr. et al. (1999) y el último fue 0,3 μL LGC Biotecnología Taq ADN
desarrollado para P.expansa por Valenzuela polimerasa (1 U / l), y el ADN 1! l (10 ng).
(2000). Para individuos de la Reserva La temperatura de desnaturalización inicial
Biologica Abufari, Tapaúa- AM, los seis fue de 94 o C durante 1 min, seguido por 25
primeros pares fueron desarrollados por ciclos a 94 o C durante 30 s, 55 o C durante
Fantin et al. (2007). Las reacciones en cadena 30 s, Cy 68 o C durante 30 s. Entonces, 20
de la polimerasa de genotipo (PCR) siguió el ciclos a 94 o C durante 30 s, 50 o C durante
protocolo económico descrito por 30 s y 68 o C durante 30 s con una extensión
Schuelke(2000). Todos los loci se final de 72° C durante 15 min.
amplificaron en condiciones idénticas de Fragmento de ADN amplificados fue
termociclado, que fueron ajustados para un visualizado en gel de agarosa al 1% antes de
volumen total de 11 μL que contenía 3,7 μL la determinación del genotipo.
H 2 O, 1,0 μL de 10X tampón de PCR con Los productos de PCR se diluyeron en la
(NH 4 ) 2SO 4 ( Fermentas), 1,5 μL MgCl 2 proporción 1:
( 25 mM), 1,0 μL Del primer inverso (2 μM), 100, y el marcador de tamaño ROX pUC-19,
0,5 μL primer directo (2 μM), 0,5 μL 6-FAM modificado a partir de dewoody el tal (2004),
etiquetado M13 primer etiqueta (2 μM), 1,5 para determinar los tamaños de los alelos
μL de mezcla de dNTP (0,2 mM cada uno), observados.
El genotipo se realizó en el ABI 3730xl DNA número real de contribuir a los padres a la
Analyzer, y los análisis de alelos observados descendencia, ya que este método no
para cada locus se hicieron usando el distingue múltiples pares con alelos comunes.
programa GeneMapper v.4.0 (Aplicado Por lo tanto, para estimar el número más
Biosystems). probable de contribuir machos, se utilizó el
programa informático Kinalyser (Berger-
Se calcularon las heterocigosidades por locus Wolf et al. 2007), que realiza un análisis
observadas y esperadas para cada locus con multiloci con el propósito de la estimación de
Arlequin 3.1 (Excoffier et al.2005). A fin de la relación entre hermanos medio lleno y en
determinar la probabilidad por Weir (1996) se el mismo nido, atribuyendo la paternidad e
utilizó. La probabilidad de exclusión de inferir sistemas de apareamiento (poligámica
paternidad (Q) es el parámetro basado en la / monogámicos). La inferencia de las familias
exclusión de varios machos complicados en de hermanos completos es posible incluso sin
cada nidada, que estadísticamente puede ser conocer el genotipo de los padres, ya que este
distinguido programa utiliza la información de la
A través de este parámetro, el progenitor distribución de alelos en loci múltiples, entre
masculino más probable no ser descubierto, los individuos de cada nidos.
aunque es posible excluir los progenitores
masculinos probables en la población Resultados
estudiada.
El número de alelos por locus varió de 1 - 8,
Los valores de exclusión de paternidad más con un promedio de 7,5 ± 2,8 alelos por
cercanos a 1 proporcionan una mayor locus. Heterocigosidad observada varió de
confianza para excluir correctamente a un 0.2297 (Puni_1D9) a 0,9500 (Puni_2A9)
individuo de la paternidad. La probabilidad (Tabla 2). La probabilidad de que dos
de que dos individuos no relacionados individuos no relacionados que presenta el
presenten el mismo el genotipo se calculó mismo genotipo (IC) fue 1,29 x 10- 6, y la
mediante el método de identidad genética (I) probabilidad conjunta de exclusión a través
descrito por Paetkau et al. (1995). de todos los loci ( QC) fue 99,27% (Tabla 2).
Considerando todos los loci analizados Tomados en conjunto, IC y QC proporcionar
juntos, la probabilidad de exclusión de evidencia para alta potencia para detectar la
paternidad (QC) (Weir 1996) y la paternidad múltiple utilizando estos loci para
probabilidad conjunta de identidad genética P. sextuberculata.
(IC) también se analizaron.
El análisis de paternidad se realizó de El número de alelos por locus dentro de cada
acuerdo con el Método Mínimo de recuento nido varió de uno (nidos 3, 6, y 7) a ocho
de alelos (Myers y Zamudio 2004), que (Nido 10) (Tabla 1).
presupone una distribución mendeliana de los
alelos en la progenie. Cuando los dos alelos Basado en el método mínimo de recuentos de
maternos son locus muestreado entre las crías alelos, paternidad múltiple se encontró en 7
de cada nido se considera indicativo de la de los 12 nidos analizados (Nidos 1, 2, 5, 7,
paternidad múltiple. 8, 9, y 10) (Tabla 1). Al contar fue utilizado
Dado que uno o más descendencia con la deducción del alelo materno, todos los
homocigoto se observa en un solo nido, es nidos, excepto Nido 12, mostraron al menos
posible estimar el alelo materno y los dos machos que contribuyen a la
restantes se cuentan como la contribución descendencia. Un mínimo de dos
paterna. En tales casos, la presencia de tres progenitores masculinos contribuyó a nidos
alelos diferentes en un locus dado indica de 1, 3, 4, 5, 6, 7, y 9; al menos tres machos
múltiple paternidad. contribuyeron a los nidos 2 (Puni_2E7) y 8
Desafortunadamente, el método de mínimo (Puni_B1 y Puni_2E7); y al menos cuatro
de conteos de alelos no proporciona el machos contribuyeron a la descendencia en el
Nido 10 (Puni_2E7); los uso del programa
KINALYSER (Berger-Wolf et al. 2007)
refuerza la contribución fuera de la pareja por
medio de la inferencia de más de una familia
de medios hermanos de cada nido analizados
(Tabla 1).

Tabla 2. Número de alelos, heterocigosidad observada ( Ho), heterocigosidad esperada ( Él), la probabilidad de
exclusión de paternidad ( Q) y la probabilidad de identidad ( YO) de los loci de microsatélites 6 utilizado en el P.
sextuberculata Prueba de paternidad.

Lugar Número de
alelos Referencia

Discusión

Paternidad múltiple es un sistema de Sin embargo, hay pocos estudios sobre los
apareamiento común en las poblaciones sistemas de apareamiento de las especies de
naturales de reptiles como las tortugas. agua dulce.
Muchos estudios de tortugas marinas (Harry La existencia de paternidad múltiple ya ha
y Briscoe 1988, Parker et al. 1996, sido reportado en el río del Amazonas la
FitzSimmons 1998, Bollmer et al. 1999, tortuga Podocnemis (P.expansa: Valenzuela
Kichler et al. 1999, Crim et al. 2002, Hoekert 2000;P. unifilis:Fantin et al. 2008; P.
et al. 2002, Moore y la bola de 2002, Irlanda erythrocephala: Fantin et al. 2010).
et al. 2003, Lee y Hays de 2004, Jensen et al. Valenzuela (2000) de 100% múltiple
2006, Zbinden et al. 2007) han demostrado la paternidad en 2 nidos de una P. expansa la
clara presencia de paternidad múltiple. población de Colombia usando ocho loci
microsatélites. Pearse et al. (2006) estudiaron
la misma especie que Venezuela utilizando
siete loci microsatélites y sólo se encuentra
10,3% paternidad múltiple en 32 nidos. La
gran diferencia en la tasa de paternidad
múltiple entre estas poblaciones sugiere que y Zamudio 2004) y KINALYSER (Berger-
puede haber variación en los patrones de Wolf et al. 2007). El objetivo fue analizar un
paternidad entre el tamaño de muestra muy número estándar de crías por nido (que varía
pequeño en el estudio anterior. de 8 a 12 individuos), con el fin de minimizar
o neutralizar el efecto potencial de tamaño de
La variación en la frecuencia de paternidad la muestra sobre la tasa de paternidad
múltiple también se ha demostrado en múltiple encontrado. Para resolver
estudios del sistema de apareamiento de las incertidumbres tales como la presencia de
poblaciones de tortuga marina incluyendo múltiples pares con alelos comunes, se utilizó
Chelonia mydas ( 92%: Alfaro-Núñez et al. loci de microsatélites altamente polimórficos.
2015; 61%: 75%: Pearse et al. 2001; Lee y
Hays 2004; 9%: FitzSimmons 1998) y Cuando se compara con los estudios
Caretta caretta ( 31%: Moore y la bola 2002; anteriores sobre el género Podocnemis,
33%: Harry y Briscoe 1988), así como estudiamos un mayor número de loci de
Tortuga de agua dulce, Chrysemys picta ( microsatélites (9 loci través de los dos sitios
0%: McTaggart 2000; 13%: Pearse et al. de estudio), que se considera adecuado, y
2001; 33%: Pearse et al. 2002). determinar la frecuencia de paternidad
múltiple en P. sextuberculata, de acuerdo con
Algunos autores sugieren que la tasa de los cálculos de probabilidad tanto para IC y
paternidad múltiple se encontró en las QC.
poblaciones diferentes factores, una escasez Concluimos, pues, que la paternidad múltiple
tal de recursos, que es probable que reduzca está presente en P. sextuberculata en la
la densidad de población y por lo tanto el mayoría de los nidos de las dos poblaciones
número de cópulas (ENGQVIST 2011). A estudiadas. Se observó el mismo patrón de
mayor densidad, hay más posibilidades de comportamiento de apareamiento en las dos
encuentros que resultan en el apareamiento poblaciones estudiadas, sin embargo, los
(Taylor et al. 2014). La proporción de sexos datos ambientales que permitiría la
también será un factor importante; comparación entre no se recogieron
poblaciones con proporciones de sexos localidades tales como temperatura de la
hombres sesgada son más propensos a arena y la frecuencia de precipitaciones.
presentar múltiples paternidad (Crim et al.
2002). Este estudio sugiere que las estrategias de
manejo y conservación de P. sextuberculata
Teniendo en cuenta la situación vulnerable de poblaciones deben tener en cuenta el sexo
PAG. sextuberculata poblaciones, los operativa paternidad múltiple. Nuevos
estudios genéticos que se centran en el estudios centrados en otras especies del
comportamiento reproductivo de esta especie género y en diferentes poblaciones de esta
contribuyen en gran medida a la creación de especie va a ser muy útil para dilucidar las
programas de conservación de esta especie y estrategias para el mantenimiento del
su gestión adecuada. Este último debe tratar rendimiento reproductivo saludable en
de aumentar el número de hombres que tortugas de río.
potencialmente fertilizar los huevos (Alfaro-
Núñez et al. 2015), para proporcionar Expresiones de gratitud
mayores tasas de paternidad múltiple y en
consecuencia para mantener o aumentar Agradecemos a proyecto de tortugas “Pe-de-
intrapoblacional variabilidad genética (Sugg Pincha” para ayudar con la recolección de
y Chesser 1994, Chesser y Baker 1996). muestras. Esta investigación fue apoyada por
subvenciones # 557090 / 2005-9 (I. Farías
En nuestro estudio, se analizaron los datos de PPG7 /
microsatélites de seis loci utilizando el
Método mínimo de conteos de alelos (Myers
V. Paladino. 2002. The leatherback turtle,
CNPq; T. Hrbek - fondos de puesta en Dermochelys coriacea, exhibits both
marcha de la Universidad de Puerto Rico-Río polyandry and polygyny. Molecular Ecology
Piedras). Este estudio forma parte de un 11: 2097– 2106.
Ph.D. tesis presentada por Cleiton Fantin en
el Programa de Biotecnología de la Curtis, C. 1998. Genotyping with
Universidad Federal del Amazonas; C. Fantin Polymorphic Markers Reveals Multiple
fue apoyado por una Ph.D. beca de la Paternity in Leatherback Turtle Clutches.
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