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ESCUELA POLITÉCNICA NACIONAL

FACULTAD DE INGENIERÍA CIVIL Y AMBIENTAL


CARRERA EN INGENIERÍA AMBIENTAL

LABORATORIO DE ECOTOXICOLOGÍA

PRACTICA Nº 1

“BIOENSAYO DE TOXICIDAD AGUDA CON SEMILLAS DE LECHUGA.”

​Realizado por:

Enríquez Jorge
Valenzuela Fabricio

Análisis de Resultados /2.0

Conclusiones /2.0

Recomendaciones /1.5

Consulta /2.0

Ejemplo de cálculo /1.0

Teoría y Procedimiento /0.5

Presentación /0.5

Bibliografía /0.5

Total /10

​Fecha de realización: ​23 de Octubre de 2017


Fecha de entrega: ​06 de Noviembre de 2017
1.Tema​​: Bioensayo de Toxicidad Aguda con semillas de lechuga

2.​ ​Objetivos​:
● Evaluar los efectos fitotóxicos de compuestos puros o de mezclas complejas
en el proceso de germinación de las semillas y en el desarrollo de las
plántulas durante los primeros días de crecimiento.

3. Teoría (Resumen)
Los ensayos de toxicidad son procedimientos en los cuales las respuestas de ciertos
organismos son utilizadas para detectar el efecto producido por la presencia de sustancias
nocivas o tóxicas. Se consideran una herramienta importante de control ambiental, puesto
que permiten evaluar de una manera rápida y confiable los impactos de contaminantes
tóxicos sobre los ecosistemas, así como evaluar riesgos potenciales de salud. (Murillo y
Díaz, s.f.).
Normalmente se utilizaban las pruebas de toxicidad agudas para determinar una
concentración letal que matará al 50 % de la población de la prueba durante un tiempo
dado. La dosis respuesta es la relación existente entre la dosis y proporción de la población
con evidencia de efectos definidos.9 La dosis letal media es la estimación estadística que
relaciona la dosis que ocasiona el 50 % de las muertes cuando se realiza una
administración única, la cual se encuentra expresada en peso de la sustancia por peso
corporal y se expresa miligramos por kilogramos. (Arencibia Arrebola, Rosario Fernández, &
López Feria, 2003)
El bioensayo de toxicidad con semillas de lechuga (Lactuca sativa) es una prueba estática
de toxicidad aguda (120 horas de exposición) en el que se pueden evaluar los efectos
fitotóxicos de compuestos puros o de mezclas complejas en el proceso de germinación de
las semillas y en el desarrollo de las plántulas durante los primeros días de crecimiento.
Como puntos finales para la evaluación de los efectos fitotóxicos, se determina la inhibición
en la germinación y la inhibición en la elongación de la radícula y del hipocotilo (figura 1).
Es importante destacar que durante el período de germinación y los primeros días de
desarrollo de la plántula ocurren numerosos procesos fisiológicos en los que la presencia de
una sustancia tóxica puede interferir alterando la supervivencia y el desarrollo normal de la
planta, siendo por lo tanto una etapa de gran sensibilidad frente a factores externos
adversos. La evaluación del desarrollo de la radícula y del hipocotilo constituyen indicadores
representativos para determinar la capacidad de establecimiento y desarrollo de la planta.
(Sobrero & Ronco, s.f.).

Figura 1:​ Morfología de la semilla y la plántula de lechuga Lactuca sativa L.


Debido al potencial impacto que representa para el ambiente, la emisión de cromatos y
dicromatos (cromo VI), vertidos producto de la actividad de diferentes sectores industriales,
en el presente ensayo se determina la toxicidad aguda del Dicromato de Potasio. (González
Pérez & Aportela Gilling, 2001)

4.​ ​Procedimiento
1. Preparar cinco diluciones de la muestra o compuesto a estudiar, de manera
que se obtengan valores de toxicidad entre 100 y 0%.
2. Colocar en cada cápsula de Petri un disco de papel de filtro.
3. Marcar correctamente cada caja con la dilución correspondiente, así como la
fecha y hora de inicio y término del bioensayo.
4. Saturar el papel de filtro con 4 o 5 mL de la dilución evitando que se formen
bolsas de aire.
5. Con la ayuda de una pinza, colocar cuidadosamente veinte semillas, dejando
espacio suficiente entre ellas para permitir la elongación de las raíces.
6. Tapar las cápsulas y colocarlas en bolsas plásticas para evitar la pérdida de
humedad. Cubrir de la luz.
7. Incubar durante 120 h (cinco días) a una temperatura de 22± 2 °C. Realizar
repeticiones para cada dilución ensayada.
8. Cuantificar el efecto en la germinación y en la elongación de la radícula y del
hipocotilo.
9. Registrar el número de semillas que germinaron normalmente, considerando
como criterio de germinación la aparición visible de la radícula.
10. ​Medir cuidadosamente la longitud de la radícula y del hipocotilo de cada una
de las plántulas correspondientes a cada concentración de tóxico o dilución
de muestra y a los controles.

5. Datos ​2 con analisis d cada tabla

Blanco
Tabla No 1. ​Longitudes de la radícula e hipocotilo de las semillas germinadas sometidas a
una concentración al 0% de Dicromato de potasio (K​2​Cr​2​O​7​).

Id_semilla radicula(mm) hipocotilo(mm) observaciones


1 5 17 Sin manchas
2 5 19 Sin manchas
3 5 22 Sin manchas
4 6 23 Sin manchas
5 4 21 Sin manchas
6 5 18 Sin manchas
7 6 24 Sin manchas
8 5 18 Sin manchas
9 4 17 Sin manchas
10 9 24 Sin manchas
11 7 20 Sin manchas
12 6 19 Sin manchas
13 20 17 Sin manchas
14 6 20 Sin manchas
15 4 17 Sin manchas
16 4 20 Sin manchas
17 3 16 Pequeña mancha
18 4 16 Sin manchas
19 5 16 Sin manchas
20 0 0 Sin manchas

Concentración 100%
Tabla No 2. ​Longitudes de la radícula e hipocotilo de las semillas germinadas sometidas a
una concentración 1 g/L de Dicromato de potasio (K​2​Cr​2​O​7​).

hipocotilo
Id_semilla radícula (mm) (mm) Observaciones
manchas negras
1 1 2 (necrosis)
manchas negras
2 NPI NPI (necrosis)
manchas negras
3 NPI NPI (necrosis)
manchas negras
4 NPI NPI (necrosis)
manchas negras
5 NPI NPI (necrosis)
manchas negras
6 NPI NPI (necrosis)
manchas negras
7 NPI NPI (necrosis)
8 0 0 No germinó
manchas negras
9 NPI NPI (necrosis)
manchas negras
10 NPI NPI (necrosis)
manchas negras
11 NPI NPI (necrosis)
manchas negras
12 NPI NPI (necrosis)
manchas negras
13 NPI NPI (necrosis)
manchas negras
14 NPI NPI (necrosis)
manchas negras
15 NPI NPI (necrosis)
manchas negras
16 NPI NPI (necrosis)
manchas negras
17 NPI NPI (necrosis)
manchas negras
18 NPI NPI (necrosis)
manchas negras
19 NPI NPI (necrosis)
manchas negras
20 NPI NPI (necrosis)

Concentración 10%
Tabla No 3. ​Longitudes de la radícula e hipocotilo de las semillas germinadas sometidas a
una concentración 0,1 g/L de Dicromato de potasio (K​2​Cr​2​O​7​).

N° Radícula Hipocotilo Observaciones


1 4 11 Necrosis
2 3 9 Necrosis
3 3 7 Necrosis
4 5 9 Necrosis
5 3 12 Necrosis
6 4 11 Necrosis
7 3 8 Necrosis
8 3 7 Necrosis
9 5 11 Necrosis
10 4 11 Necrosis
11 3 10 Necrosis
12 3 11 Necrosis
13 3 12 Necrosis
14 5 10 Necrosis
15 7 10 Necrosis
16 5 9 Necrosis
17 4 10 Necrosis
18 3 10 Necrosis
19 3 6 Necrosis
20 1 5 Necrosis

Concentración 1%
Tabla No 4. ​Longitudes de la radícula e hipocotilo de las semillas germinadas sometidas a
una concentración 0,01 g/L de Dicromato de potasio (K​2​Cr​2​O​7​).

hipocotilo(mm
Id_semilla radicula(mm) ) observaciones
1 4,1 18,9 Mancha en cotiledón
2 4,1 18 Mancha en cotiledón
3 4,6 14,8 Mancha en cotiledón
4 5,9 17 Sin manchas, hipocotilo muy debil
5 4 19 Sin manchas
6 5,1 15 Mancha en cotiledón
7 3,4 0 manchas y no presenta desarrollo de hipocotilo
8 4,2 18 Mancha en cotiledón
9 3 5,6 sin desarrollo de cotiledon
10 9,1 15,5 sin manchas
11 4,9 13,7 Fragilidad, manchas
12 5,3 16 manchas negras
13 0 0 No germinó
14 0 0 No germinó
manchas negras, sin desarrollo hipocotilo
15 3,3 0
16 2,3 9,9 manchas negras, sin desarrollo cotiledón
17 2,3 0 Sin desarrollo hipocotilo
18 3,5 7,8 manchas negras
19 2,9 5,3 manchas negras
20 3,9 7,1 manchas negras

Concentración 0,1%
Tabla No 5. ​Longitudes de la radícula e hipocotilo de las semillas germinadas sometidas a
una concentración 0,001 g/L de Dicromato de potasio (K​2​Cr​2​O​7​).

Número Radícula Hipocotilo


(mm) (mm) observaciones

1 5 24 sin manchas

2 4 21 sin manchas

3 4 20 sin manchas

4 4 22 sin manchas

5 4 19 sin manchas

6 5 23 sin manchas

7 5 21 sin manchas

8 5 23 sin manchas

9 4 16 sin manchas

10 4 19 sin manchas

11 5 16 sin manchas

12 5 21 sin manchas

13 4 20 sin manchas

14 4 21 sin manchas

15 4 19 sin manchas

16 4 20 sin manchas

17 5 22 Sin manchas

18 4 18 Sin manchas

19 2 10 Sin manchas

20 5 22 Sin manchas

Concentración 0,01%
Tabla No 6. ​Longitudes de la radícula e hipocotilo de las semillas germinadas sometidas a
una concentración 0,0001 g/L de Dicromato de potasio (K​2​Cr​2​O​7​).

Id_semilla radicula(mm) hipocotilo(mm) observaciones


1 3 17 sin manchas
2 7 19 sin manchas
3 4 21 sin manchas
4 8 15 radicula delgada y alargada
5 13 13 radicula delgada y alargada
6 7 19 sin manchas
7 5 20 sin manchas
8 4 21 sin manchas
9 4 20 sin manchas
10 3 14 sin manchas
11 3 20 sin manchas
12 3 16 sin manchas
13 7 14 sin manchas
14 4 18 sin manchas
15 5 22 sin manchas
16 3 14 sin manchas
17 3 16 sin manchas
18 4 18 sin manchas
19 4 12 hipocotilo delgado
20 4 19 sin manchas

6. Tratamiento de datos y análisis de Resultados


3
● Promedio y desviación estándar de la elongación de la radícula y del
hipocotilo de las plántulas de cada repetición.

Tabla N 7

Concentración 0%

Longitud radícula (mm) Longitud hipocotilo (mm)

PROMEDIO 5,9 19,2

DESV. 3,7 2,7


ESTAND.
Elongación 25,1

● Porcentaje de inhibición del crecimiento de la radícula y del hipocotilo, con el


promedio de elongación para cada dilución respecto del promedio de
elongación del control negativo.

Concentració Concentración Elongación % Inhibición de Log Concentración


Probit
n [g/L] [mg/L] Promedio [mm] la elongación [g/L]

Blanco Blanco 23.85 0 - -

1 1000 1.375 94.24 5.57 0

0.1 100 13.15 44.86 4.87 -1

0.01 10 13.875 41.82 4.80 -2

0.001 1 24.15 0 - -3

0.0001 0.1 22.3 6.5 3.49 -4

● Porcentaje de inhibición en la germinación.

N° de semillas que no N° de semillas que % Inhibición en la


Concentración [g/L]
germinaron germinaron germinación

Blanco 1 19 5

1 1 19 5

0.1 0 20 0

0.01 2 18 10

0.001 0 20 0

0.0001 0 20 0

● Elaborar la gráfica dosis-respuesta colocando en la ordenada el porcentaje


de inhibición y en la abscisa, la concentración.
● Calcular la concentración que produce el 50% de inhibición (CI​50​/CE​50​) para
cada punto final evaluado.

7. Conclusiones
● Las pruebas de toxicidad utilizando Cloruro de Cobalto permitieron establecer los
efectos fitotóxicos del contaminante a evaluar, demostrando que a mayor
concentración de la sustancia tóxica aumenta el porcentaje de inhibición en la
elongación de la radícula e hipocotilo, con lo que se puede concluir una relación
directamente proporcional entre la concentración del contaminante y el % de efecto
o respuesta de la población, mismos que representan un indicador de riesgo
ambiental y permiten establecer normas para el control de descargas de efluentes en
cuerpos de agua.
5 una extra
8. Recomendaciones
● Se debería realizar el ensayo con varias repeticiones para una misma concentración,
esto para contar con más datos e información y que las desviaciones sean menores,
además que permite establecer si es experimento se está desarrollando de buena
manera porque podemos comparar resultados para cada repetición, lo que reduce
errores sistemáticos y más confiabilidad al momento de procesar los datos.
● Para que los datos sean más exactos y evitar la especulación del observador, se
debería utilizar como instrumento principal un calibre pie de rey; con ello se lograría
uniformidad en las medidas.

9. Bibliografía

● Arencibia Arrebola, D. F., Rosario Fernández, L. A., & López Feria, Y. (2003).
RETEL. Recuperado el 4 de Noviembre de 2017, de
http://www.sertox.com.ar/img/item_full/22001.pdf
● González Pérez, Y., & Aportela Gilling, P. (2001). Centro de Toxicología y
Biomedicina. Recuperado el 4 de Noviembre de 2017, de
http://bvs.sld.cu/revistas/anu/vol1_1_01/anu1701.pdf
● Murillo , N., & Diaz, M. C. (s.f.). Universidad Nacional de Colombia. Recuperado el 4
de Noviembre de 2017, de
https://revistas.unal.edu.co/index.php/ingeinv/article/viewFile/20947/21848
● Shuttleworth, M. (2008). Explorable. Recuperado el 4 de Noviembre de 2017, de
https://explorable.com/es/grupo-de-control-cientifico
● Sobrero, M. C., & Ronco, A. (s.f.). INECC. Recuperado el 4 de Noviembre de 2017,
de http://www2.inecc.gob.mx/publicaciones2/libros/573/cap4.pdf
● Toscana, L., Moretto, N., & Villarreal, F. (s.f.). Universidad Nacional del Sur.
Recuperado el 4 de Noviembre de 2017, de
http://www.matematica.uns.edu.ar/XCongresoMonteiro/Comunicaciones/moretto.pdf

10. Anexos
10.1. Cuestionario/ consulta
7
● LD50
● CE50
● MÉTODO PROBIT

● Grupo de control científico positivo


Los grupos de control científicos positivos son aquellos en donde se espera que el
grupo de control brinde un resultado positivo y permiten al investigador demostrar
que el armado fue capaz de producir resultados.
En general, un investigador utilizará un procedimiento de control positivo, el cual es
similar al diseño real con un factor que se sabe que funciona.
Por ejemplo, un investigador que prueba el efecto de nuevos antibióticos sobre
placas de Petri con bacterias puede utilizar un antibiótico establecido que se sabe
que funciona. Si todas las muestras fallan excepto esa, es probable que los
antibióticos probados sean ineficaces.
Sin embargo, si el control también falla, hay algo mal en el diseño. Los grupos de
control científico positivos reducen las posibilidades de falsos negativos.

● Grupo de control científico negativo


El control científico negativo es el proceso que consiste en utilizar el grupo de
control para asegurarse de que ninguna variable de confusión haya afectado los
resultados o eliminar las posibles fuentes de sesgo. Se utiliza una muestra que no
se espera que funcione.
En el ejemplo de los antibióticos, el grupo de control negativo sería un plato de Petri
sin antibiótico, lo que permite al investigador demostrar que los resultados son
válidos y que no hay variables de confusión.
Si todos los medicamentos nuevos funcionaron, pero el grupo de control negativo
también mostró inhibición del crecimiento bacteriano, entonces alguna otra variable
podría haber tenido un efecto, invalidando los resultados.
Un control negativo también puede ser una forma de establecer un punto de
referencia. (Shuttleworth, 2008)

● Carta control
Las cartas de control se utilizan para chequear la estabilidad de un proceso. En este
contexto el proceso se dice que está bajo control estadístico si el o los parámetros de la
distribución de probabilidad de una característica de calidad bajo estudio, permanecen
invariables en el tiempo. Si un cambio se produce en alguno de ellos el proceso se dice que
está fuera de control.
Cuando se evalúa cuan efectiva es una carta de control para detectar cambios en los
parámetros de un proceso se pretende que los mismos sean detectados inmediatamente
después de que ocurra, que la tasa de falsa alarma sea baja y que la tasa de muestreo sea
razonable.
Una medida para la tasa promedio de muestreo se obtiene usando el número promedio de
observaciones hasta que se produce una señal. El número de observaciones requeridas
hasta una señal se denomina usualmente Longitud de Corrida de la carta de control. El
número promedio de observaciones que deben graficarse antes de que una de ellas indique
una condición fuera de control es la Longitud de Corrida Promedio (LCP).Cuando el proceso
está bajo control o cuando se produce un cambio, la LCP puede evaluarse mediante
cálculos probabilísticas. (Toscana, Moretto, & Villarreal, s.f.)

10.2. Ejemplos de cálculo (si son cálculos distintos colocar un ejemplo de cada
uno)

​cada uno pone su ejemplo d calculo dependiendo d lo q le toco

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