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EPIDEMIOLOGÍA MOLECULAR DE SALMONELLA

EPIDEMIOLOGÍA MOLECULAR DE SALMONELLA Dany Mesa* a , Breno C.B. Beirão b y Luiz F. Caron

Dany Mesa* a , Breno C.B. Beirão b y Luiz F. Caron c

a Departamento de Bioquímica y Biología Molecular, Universidad Federal de Paraná, Brasil

b Imunova Análises Biológicas LTDA, Curitiba, Brasil

c Departamento de Patología, Universidad Federal de Paraná, Brasil *Autor para la correspondencia dmesaf@unal.edu.co

La infección por Salmonella es una de las enfermedades trans- mitidas por alimentos más prevalente en el mundo (Petrovska et al., 2016). Se estima que anualmente alrededor de 93,757,000 casos de gastroenteritis en humanos son debido a salmonelas paratíficas (Majowicz et al., 2010), la mayoría de las veces aso- ciadas con el consumo de algunos alimentos de origen animal contaminados, como por ejemplo: carne de pollo, cerdo y hue- vos (Norton et al., 2012; Kottwitz et al., 2013).

Por centenas de años, las investigaciones epidemiológicas de Salmonella que infectan a humanos y animales han dependido de la clasificación del aislado bacteriano por serotipo o serovar, esta serotipificación depende de reacciones de aglutinación es- pecíficas con antisueros que son específicos para epítopos o “antígenos”. Los antígenos bacterianos más utilizados para reali- zar la serotipificación o clasificación antigénica son los lipopolisa- cáridos (antígeno O) y flagelos (antígeno H) (Echeita et al., 2002).

De esta manera, a partir de la acumulación de varios estudios sobre interacciones entre anticuerpos y antígenos de super-

ficie de Salmonella, entre cuyos promotores se encuentran Kauffman y White hace un siglo, ha sido posible la conso- lidación de un sistema de clasificación antigénica de varios serovares de Salmonella, utilizado hoy en día. Por lo anterior, todas las fórmulas antigénicas de Salmonella identificadas se enumeran en un documento llamado el Esquema Kau- ffmann-White. Por otro lado, la organización mundial de la salud (OMS), colabora como un centro de referencia e inves- tigación sobre Salmonella en el Instituto Pasteur (París-Fran- cia) y es el responsable de actualizar el esquema. Así, los serovares recientemente reconocidos son reportados en la revista “Research in Microbiology”. En el último informe publi- cado en 2014, hubo un total de 2,659 serovares en el género Salmonella (Issenhuth-Jeanjean et al., 2014), Tabla 1.

Adicionalmente, cabe resaltar que estos antígenos son proteí- nas producidas por la bacteria y que la receta para su síntesis está depositada en el genoma bacteriano en forma de genes, esto es, que un gen tiene la información para la síntesis de cada proteína. Además, diferentes especies de Salmonella sintetizan

varios y diferentes lipopolisacáridos, flagelos y otras proteínas de superficie, lo que da como resultado 1.586 serotipos dentro de la especie Salmonella enterica subespecie enterica. Tabla 1.

Tabla 1. Número de serovares en el género Salmonella. Tomado

y adaptado de (Issenhuth-Jeanjean et al., 2014).

Serovares de cada especie y subespecies del género Salmonella

S. enterica

Número

subsp. enterica

1586

subsp. salamae

522

subsp. arizonae

102

subsp. diarizonae

338

subsp. houtenae

76

subsp. indica

13

S. bongori

22

Total

2659

Aunque existen diferentes técnicas de biología molecular para revelar la composición genómica y definir el serotipo bacteriano, entre las más populares y ampliamente utilizadas se encuentran

la electroforesis en gel de campo pulsado (en inglés, pulsed field

gel electrophoresis, PFGE); tipificación multilocus de secuencias (en inglés multilocus sequence typing, MLST) y secuenciación del genoma entero (en inglés whole genome sequencing, WGS) (Pérez-Losada et al., 2013). Para una revisión más profunda re- comendamos el capítulo 24 del libro “Salmonella in Domestic Animals” (Barrow and Methner, 2013). En este artículo nos enfo- caremos en estas tres primeras técnicas, principalmente en se- cuenciación del genoma entero debido a la rapidez, sensibilidad

y volumen de información que la técnica ofrece.

Electroforesis en gel de campo pulsado (PFGE) Esta técnica es una variación de la tradicional electroforesis en gel de agarosa, que es el método más difundido en biología molecular para la separación de moléculas de ADN con relación a su tama- ño. Con la tradicional electroforesis, es posible separar moléculas de hasta 50,000 bases o nucleótidos, siendo esa su principal li- mitante para el uso en la tipificación de bacterias (Herschleb et al., 2007). Por tal motivo, Schwartz et al. (1983), desarrollaron la electroforesis en gel de campo pulsado, de esta forma, fue posi- ble separar fragmentos de ADN de hasta 100,000 bases, lo cual era ideal para poder separar los diferentes plásmidos bacterianos, mejorando así considerablemente la resolución de los resultados.

Por medio de esta técnica varios trabajos de epidemiología molecular para Salmonella fueron realizados por todo el mundo (Fernandez et al., 2003; Pang et al., 2005). Adicionalmente, algu- nos países se unieron para crear bases de datos de perfiles de PFGE de Salmonella, así como para estandarizar los protocolos.

Fue el caso de 9 países de Europa que en el 2001 crearon el proyecto internacional “Salm-gene” (Peters et al., 2003). De esta forma nacía un consorcio que tenía como objetivo la epidemio- logía molecular para el estudio de brotes y de casos de intoxica- ción alimentaria por Salmonella en humanos y en animales. Esta base de datos llego a tener más de 11,700 detalles de aislados de Salmonella y más de 65 diferentes perfiles de PFGE solamen-

te para S. Enteritidis (Peters et al., 2007).

A pesar del auge de la técnica, aún presentaba algunos inconve-

nientes como la necesidad de equipos y software caros para ob- tener resultados comparativos. Sumado a su baja capacidad para mostrar la variación entre genomas de Salmonella, es una metodo- logía compleja y que demanda bastante tiempo, siendo necesario un alto grado de entrenamiento (Champion et al., 2002), por tal razón fue limitado a los laboratorios de referencia o investigación.

Tipificación multilocus de secuencias (MLST) Se trata de una técnica de biología molecular ampliamente usa- da para la clasificación taxonómica de bacterias. El procedimien- to tipifica las bacterias mediante secuenciación de fragmentos de ADN de genes constitutivos, en inglés conocidos como “Housekeeping genes”. Se trata de genes que frecuentemente se expresan en las bacterias y que son esenciales para la sobre- vivencia bacteriana (Kotetishvili et al., 2002).

El resultado de la secuenciación de los diferentes genes resulta

en una única secuencia concatenada, la cual se compara con- tra una base de datos. De esta manera, es posible identificar

el serotipo de Salmonella o comparar varias secuencias con el

objetivo de establecer una filogenia de varias Salmonellas, por ejemplo, en el caso de un brote o cuando un sistema de vigilan- cia epidemiológica molecular es desarrollado.

Sin embargo, esta técnica también presenta algunas desventa- jas. Generalmente, son seleccionados entre seis y siete genes constitutivos, los cuales formarían la representación del genoma de Salmonella (Didelot and Maiden, 2010) que tiene alrededor de 4500 genes. Así, los genes seleccionados representarán de ma- nera muy vaga la acumulación de mutaciones en el genoma, lo cual es un problema significativo cuando se quiere investigar un brote por causa de un clon de una Salmonella (Hall and Barlow,

2006). En nuestra experiencia, al estudiar las relaciones filogené- ticas de Salmonella Heidelberg en la región sur de Brasil median-

te esta técnica, el árbol filogenético mostró todos los aislados de

manera condensada en vista de que al usar un número pequeño de genes fue difícil observar mutaciones.

Adicionalmente, nuestra experiencia muestra que la mayoría de las diferencias en el genoma de Salmonellas de la misma es- pecie se encuentran en genes que son conocidos como ele- mentos móviles, por ejemplo, plásmidos, fagos y transposo- nes. Así, es evidente que la técnica MLST carece de resolución para hacer estudios de epidemiología de la misma especie.

En ese caso, para superar estos inconvenientes, la técnica ideal es la secuenciación del genoma entero.

Secuenciación del genoma entero (WGS) La secuenciación es una técnica de biología molecular que per- mite la correcta identificación del orden de nucleótidos de un segmento de ADN o ARN, con el objetivo de conocer la informa- ción genética contenida en estas moléculas. Desde el desarrollo de las primeras metodologías de secuenciación en 1977, una por Alan Maxam y Walter Gilbert y la otra por Frederick Sanger (Sanger et al., 1977) hasta las tecnologías actuales, denomina- das “Secuenciación de Nueva Generación” o NGS del inglés “Next-Generation Sequencing” (Heather and Chain, 2016), se hizo posible secuenciar moléculas de ADN cada vez mayores, con una facilidad no imaginada unas décadas atrás. Hoy en día, las dos técnicas, tanto la secuenciación por el método de Sanger y el NGS están disponibles y permiten aplicaciones diferentes.

Por otra parte, durante los últimos años, el costo de la secuen- ciación del genoma completo disminuyó drásticamente y la tecnología se tornó más accesible para el uso de rutina en la- boratorios de todo el mundo (Wilson, 2012). Además, hoy en día la velocidad de secuenciación de un genoma entero de una Salmonella puede llegar a ser una cuestión de pocas horas (Kö- ser et al., 2012). La combinación del bajo costo y alta velocidad del WGS, abre una oportunidad para que el WGS se vuelva muy útil y práctico en varios estudios bacterianos, incluyendo el uso rutinario en diagnóstico y epidemiología molecular (Leekitcha- roenphon et al., 2014), como es el caso del programa americano “GenomeTrakr Network”.

La red GenomeTrakr es la primera red distribuida de laboratorios que utiliza la secuenciación completa del genoma para la iden- tificación de patógenos como Listeria y Salmonella, entre otros. La red consiste en laboratorios de salud pública y universidades que recopilan y comparten datos genómicos y geográficos de patógenos transmitidos por los alimentos. Los investigadores y funcionarios de salud pública pueden acceder a los datos que se encuentran en bases de datos públicas para el análisis y la com- paración en tiempo real. Así, es posible acelerar las investigacio- nes sobre brotes de enfermedades transmitidas por alimentos. De manera interesante, además de los laboratorios americanos, algunos laboratorios de otros países también hacen parte de la red. Otro proyecto exitoso de epidemiología molecular para Sal- monella es el caso del “Center for Genomic Epidemiology” en Dinamarca, de la misma forma que la red americana, este centro utiliza el WGS para la epidemiología molecular de patógenos de importancia en salud pública.

Adicionalmente, debido a la gran cantidad de información que genera el WGS, es posible hacer diversos estudios, por ejemplo, detectar perfiles de resistencia a antibióticos basados en la pre- sencia de genes de resistencia y comparar estas características genómicas con las características fenotípicas de los aislados (Zankari et al., 2013). También es posible hacer una tipificación

rápida de los aislados de Salmonella utilizando una plataforma online recientemente creada por un grupo de investigadores, la plataforma “SeqSero”. Se trata de un sencillo programa online en el cual el usuario carga el archivo de la secuenciación de la Salmonella, el programa extrae los tipos de antígenos O y H, a partir de los cuales predice rápidamente el serotipo con gran precisión y envía un email de respuesta al usuario con el nombre del serotipo en pocos minutos (Zhang et al., 2015).

Por otro lado, en lo que se refiere a la experiencia brasilera con el WGS, en este momento no tenemos un centro nacional de epi- demiología molecular para Salmonella. Pero, a partir de la inicia- tiva privada hemos comenzado a utilizar esta herramienta para

el estudio epidemiológico de Salmonella Heidelberg y S. Gallina-

rum en la industria avícola del sur de Brasil. En el caso de S. Ga- llinarum utilizamos el WGS para estudiar aislados de diferentes

regiones de Brasil, queríamos saber si se trataba del mismo clon

y si tal vez podría ser por causa de una reversión de la cepa de
y
si tal vez podría ser por causa de una reversión de la cepa de
la
vacuna 9R. Así, fueron secuenciadas las Salmonellas, hicimos
varias comparaciones genómicas para determinar la presencia
de genes de virulencia y construimos un árbol filogenético para
ver la distancia evolutiva entre ellas, Figura 1.
SG3
100
75
SG4
SG1
SG2
9R

02

Figura 1: Árbol filogenético de diferentes aislados de S. Gallinarum. El árbol muestra la distancia evolutiva entre los diferentes aislados. Es posible observar la grande distancia entre los aislados y la cepa de la vacuna 9R. El árbol fue construido por el método de Neighbor joining, los valores de los nudos representan los valores de bootstrap.

De esa forma, en este estudio genómico de S. Gallinarum con- cluimos que los aislados SG3 y SG4 fueron más próximos que los aislados SG2 y SG1, está información fue corroborada por los datos geográficos de los aislados. No obstante, fue posible constatar que todos los cuatro aislados derivan de un ancestral común, reforzando así la idea que se trata de un clon. Adicional- mente, fue posible identificar que los aislados fueron considera- blemente distantes de la cepa de la vacuna 9R, descartando así la hipótesis de una posible reversión de la cepa 9R.

Conclusiones Existen diferentes herramientas para estudios de epidemiolo- gía, donde la epidemiología molecular para Salmonella basada en la secuenciación del genoma completo hoy en día es una realidad y está disponible. En el caso de Brasil, ya tenemos las

plataformas para secuenciar, laboratorios de bioinformática para analizar este volumen gigantesco de información y un flujo de trabajo para poder llevarla a cabo. Sin embargo, aún tenemos algunos desafíos por enfrentar, el más importante es la creación de un centro de investigación epidemiológico de Salmonella a partir de la unión de diferentes empresas de producción animal. Dicho centro sería financiado por las empresas y llevaría como consecuencia principal a una disminución en el costo de la se- cuenciación, debido al volumen de muestras y a las plataformas de gran porte que podrían ser adquiridas. Por otro lado, con la consolidación de este centro, existe la posibilidad de que en un futuro cercano, se desarrolle un mapa del país con los diferentes serotipos aislados, así como otras informaciones de grandísima importancia que funcionarían como una retroalimentación para el sector, promoviendo su tecnificación y la salud pública.

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