Cuarta Unidad

REUNION DE
LABORATORI
PRACTICA N° 16
O IV
CUANTIFICACION DE BILIRRUBINA SERICA
I. INTRODUCCION:
Los hematíes tienen una vida media de 120 días, al cabo de la cual son destruidos en el sistema retículo
endotelial. La hemoglobina es liberada y se separa la globina del hem, éste es convertido en biliverdina y
luego en bilirrubina. Este pigmento insoluble en agua es transportado unido a la albúmina. La bilirrubina
indirecta o no conjugada llega al hepatocito y se separa de la albúmina, después de un proceso de
captación y conjugación con dos moléculas de ácido glucurónico por la enzima bilirrubina glucuronil
transferasa, se convierte en una forma soluble, denominada bilirrubina directa o conjugada, que es
finalmente excretada con la bilis al intestino por un proceso de transporte activo; da color a las heces y
ultrafiltra el glomérulo.

Cada gramo de hemoglobina degradada origina 35 mg de bilirrubina. La concentración sanguínea de

bilirrubina total es de 1 mg / dl, siendo en su mayoría bilirrubina indirecta, que no se excreta por orina. La
hiperbilirrubinemia puede ser a predominio de la bilirrubina no conjugada como en las anemias
hemolíticas o en los defectos congénitos de conjugación, o de la bilirrubina conjugada en las
hepatopatías, donde el defecto limitante es la excreción, o en las enfermedades extrahepáticas
obstructivas.

La manifestación clínica más importante de las hiperbilirrubinemias es la ictericia, y el origen de esta

alteración obedece a causas de origen pre hepático, hepático y post hepático, que varían con la edad de
presentación y también en cuanto a su gravedad.

La fundamentación del método empleado se basa en que la bilirrubina reacciona específicamente con el
ácido sulfanílico diazotado produciendo un pigmento de color rojo-violáceo (azobilirrubina) que se mide a
530 nm. Si bien la bilirrubina conjugada (directa) reacciona directamente con el diazorreactivo, la
bilirrubina no conjugada (indirecta) requiere la presencia de un desarrollador acuoso (reactivo A) que
posibilite su reacción. De formal tal que, para que reaccione la bilirrubina total (conjugada y no
conjugada) presente en la muestra, debe agregarse benzoato de cafeína al medio de reacción.

La finalidad de la presente práctica es determinar la concentración total de las fracciones de bilirrubina

en el suero o plasma de personas normales, por el método de Malloy Evelyn, que utiliza el diazorreactivo
de Erlich.

II. MATERIALES Y REACTIVOS A UTILIZAR:

- Reactivo A: solución acuosa de benzoato de cafeína 0,13 mol/l, tamponada y estabilizada.
- Reactivo B: solución de ácido sulfanílico 29 mmol/l y ácido clorhídrico 0.17 mol/l.
- Reactivo C: solución de nitrito de sodio 0.07 mol/l.
- Bilirrubina Estándar.
- Diazorreactivo: de acuerdo al volumen de trabajo, mezclar 1 parte de Reactivo C con 21 partes de
Reactivo B. Rotular y fechar.
- Agua destilada
- Micropipetas.
- Tubos de ensayo.
- Gradillas.
- Baño maría.
- Espectrofotómetro.
- Suero.
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III. ACTIVIDADES INSTRUCCIONALES (Procedimiento)

Armar el siguiente sistema, con tres tubos marcados B (Blanco), D (Directa) y T (Total), colocar:

COMPONENTE BLANCO DIRECTA TOTAL

S
Muestra (suero) 100 ul 100 ul 100 ul
Agua Destilada 1.25 ml 1.25 ml -----
Reactivo A ----- ----- 1.25 ml
Reactivo B 100 ul ----- -----
Diazorreactivo ----- 100 ul 100 ul
Mezclar de inmediato cada tubo por inversión. Luego de 5 minutos, leer en
espectrofotómetro a 530 nm, llevando el aparato a cero con agua destilada. Las
lecturas pueden efectuarse entre 4 y 15 minutos, excepto para la bilirrubina
directa que debe leerse a los 5 minutos exactos. Si lee antes, habrá
subvaloración de los resultados por reacción incompleta. Si lee después, habrá
sobrevaloración porque comienza a reaccionar la bilirrubina libre.

Cálculos:
Bilirrubina Total (mg/l) = (T - B) x f
Bilirrubina Directa (mg/l) = (D - B) x f
Bilirrubina libre (indirecta) = B. Total – B. Directa.
El factor debe calcularse con Bilirrubina Estándar.

Valores Referenciales:
Adultos:
- Directa: hasta 2 mg/l.
- Total: hasta 10 mg/l.

IV. CUESTIONARIO:
1. Haga un esquema del metabolismo de la bilirrubina.

2. ¿Cuáles son las principales causas de hiperbilirrubinemia no conjugada?

3. ¿Cuáles son las principales causas de hiperbilirrubinemia conjugada?

4. ¿Por qué se denomina bilirrubina directa?

5. ¿Cuál es el riesgo de aumento de bilirrubina no conjugada en el recién nacido?