Sandy Zambrano Bravo Grupo: B-2

UNIVERSIDAD DE GUAYAQUIL
FACULTAD DE CIENCIAS QUÍMICAS
DEBER #1

DIFERENTES FORMAS DE REACCIONES BIOQUÍMICAS DE LOS

MICROORGANISMO
Las pruebas bioquímicas han sido ampliamente utilizadas para diferenciar bacterias. Estas
pruebas se fundamentan en demostrar si el microorganismo es capaz de fermentar
azúcares, la presencia de enzimas, la degradación de compuestos, la producción de
compuestos coloreados, etc.

Aun bacterias fuertemente relacionadas pueden separarse en dos especies diferentes con
base a pruebas bioquímicas.

Por ejemplo, las bacterias entéricas gram negativas, forman un grupo muy grande y
heterogéneo cuyo hábitat natural es el tracto gastrointestinal de humanos y otros animales.
Esta familia, Enterobacteriaceae, incluye a varios patógenos que causan síndromes
diarreicos.

Existen flujogramas, para la identificación bacteriana, mediante pruebas bioquímicas de

microorganismos.

Por ejemplo, la presencia de un coco bacilo gram negativo, facultativo, fermentador de

glucosa, oxidasa negativo, nos indica la presencia de una enterobacteria, para determinar
su género podemos seguir el siguiente esquema.

Pruebas bioquímicas:

• Citrato

• Ureasa

• Voges-Proskauer

• Rojo de metilo

• Sulfuro Indol Movilidad (SIM)

• Movilida, Indol, Ornitina (MIO)

• Triple azúcar Herro (TSI)

• Agar Lisina Hierro (LIA)

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Hidrólisis del almidón:

Se inocularon con la placa con Agar y almidón al microorganismo, estos fueron uno gram
positivo y negativo.
El gram negativo Escherichia Coli y positivo el Bacillus Cereus, a ambos se le agregó una
solución de lugor, estos después de haberla incubado a temperatura de 37 ºC, en ambos
lados hubo desarrollo de la placa.
La solución de Lugór se le agrega para observar la reacción de ambos microorganismos y
la capacidad que estos microorganismos tienen para producir una enzima que hidrolice al
almidón. La observación fue que el bacilo cereus fue resistente al colorante o sustancia y
pudo hidrolizar al almidón formándose un halo transparente alrededor del almidón.
Mientras que el Escherichia Coli no reaccionó con la sustancia agregada (lugor) y por ser
gram negativo, son susceptible a este tipo de solución, por lo tanto no hidrolizó.
Hidrólisis de la Gelatina:
En este experimento se inocularon dos tupos de microorganismos. Escherichia Coli (gram
-) y bacilo Cereus (gram +), después se colocaron a temperatura ambiente.
En los resultados a las 24 horas, el tubo que contenía la siembra de E. Coli no hidrolizó, el
gel se mantuvo gelificado.
El que contenía la siembra de Bacilo cereus, si hidrolizó, dio positivo, la licuefacción se dio
a perfección.

Hidrólisis de la Leche:
Después de inocular el microorganismo Bacilo Cereus y Escherichia Coli, lo incuban a 37
ºC, aquí se empleó una placa de agar con leche y se dividió en dos, uno con
microorganismo gram positivo(B. Cereus) y otro con gram negativo (E. Coli)
Después de pasadas las 24 horas, se observó una transparencia alrededor del
microorganismos (Bacilo Cereus) o de la colonia que hidrolizan la caseína.
Una vez hidrolizada, la caseína se convierte en sus aminoácidos componentes, los cuales
transmiten la luz en vez de reflejarla como la caseína coloidal, este último es caso del
microorganismo negativo E. Coli que no hubo reacción de desclarificación con la proteína.
El cambio que se observó en la caja de agar leche es la clarificación del agua alrededor de
las colonias que producen caseinosa.
La hidrólisis de la caseína no difiere de la de cualquier proteína típica, la molécula proteica
se desarrolla en etapas produciendo una sucesión de moléculas de tamaño decreciente
llamadas proteosas, peptonas, péptidos, hasta terminar en aminoácidos. libre, las cuales
por su tamaño son ya cristaloides.
Reacción de Nitratos:
En este tipo de análisis químicos, consta de 2 pruebas, donde la segunda dependía de la 1ª,
es decir, si la 1ª prueba daba negativa no se realizaba el 2º, por no presencia de nitrito.
En estos tres tubos con caldo nutritivo, inoculamos tres microorganismos con dos azadas
para cada uno, estos microorganismos fueron: Escherichia Coli, Bacilo Cereus y
Salmonella.
Se dejó incubado a 37 ºC por 24 horas y después por una semana a temperatura ambiente.
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Después procedimos a transferir un ml de los 3 tubos a 3 tubos estériles y le agregamos

sustancia, orientados por el profesor.
En la 1er experiencia nos dio positivo de color rojo, indicando que si hay nitrito en el
medio en condiciones anaerobias, donde la molécula de nitrato desempeña
la función del oxígeno como aceptar hidrógeno.
Este color se da solo en presencia de nitrito, ya que no reacciona con nitrato.
En la 2da experiencia se hizo igual que en la 1era experiencia, pero le agregamos amoniaco
y reactivo de reessler, esta prueba nos dio positiva con un color amarillo pardo, este
amoniaco es uno de los productos subsiguientes de la reducción del nitrito que alguno
organismos producen después de prolongar la incubación.
Los tres microorganismos tienen relación directa con las sustancias y reactivos agregados a
la mezcla o caldo nutritivo, reaccionan sin ningún problema a estas reacciones.

Demostración de la producción de Indol

Aquí se empleó dos tubos con triptona y se inoculó los microorganismos Salmonella y
Staphylococcus Aureus y se dejó incubado a 37 ºC por 24 horas y después a temperatura
ambiente por 7 días.
El tubo de S. Aureus dio positivo con color a rojo cereza, esto indica que este tipo de
microorganismo es capaz de degradar al aminoácido tritófano formando un producto de
hidrólisis de Indol.
Bioquímicamente la Salmonella se caracteriza por no fermentar la lactosa ni la salicina y
por no licuar la gelatina y por no producir Indol, aunque existen algunas excepciones.
No todos los microorganismos pueden realizar este rompimiento de triptona a indol, por
lo cual esta reacción es de valor taxonómico

MEDIDA DE CRECIMIENTO Y ENUMERACIÓN DE MICROORGANISMOS

El crecimiento de una población bacteriana puede ser entendido desde diferentes

perspectivas y de acuerdo a éstas se puede llegar a determinar la medida del crecimiento
mediante diversas metodologías.

Para algunos, el crecimiento es la capacidad para multiplicarse que tienen las células
individuales, esto es iniciar y completar una división celular. De esta forma, se considera a
los microorganismos como partículas discretas y el crecimiento es entendido como un
aumento en el número total de partículas bacterianas. Existen dos formas para determinar
el número total de microorganismos en una muestra:

 Recuento microscópico de partículas

 Recuento electrónico de partículas

Para otros, el crecimiento implica el aumento de los microorganismos capaces de formar

colonias debido a que sólo se tiene en cuenta el número de microorganismos viables, esto
es capaces de crecer indefinidamente. Las determinaciones que se utilizan son:
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 Recuento de colonias
 Método del número más probable

Para los fisiólogos bacterianos, bioquímicos y biólogos moleculares una medida del
crecimiento es el incremento de biomasa. Para ellos, la síntesis macromolecular y un
incremento en la capacidad para la síntesis de los componentes celulares es una medida
del crecimiento. Para este grupo la división celular es un proceso esencial pero menor que
rara vez limita el crecimiento, ya que lo que limita el crecimiento es la capacidad del
sistema enzimático para utilizar los recursos del medio y formar biomasa.

 Determinación de peso húmedo

 Determinación de peso seco
 Determinación de nitrógeno total
 Determinación química de un ácido nucleico

Un último grupo entiende al crecimiento sobre la base de la influencia que ejercen los
microorganismos en los cambios químicos de su entorno como consecuencia del
incremento de la biomasa.

RECUENTO DIRECTO

Recuento microscópico: Es una técnica común, rápida y barata que utiliza un

equipamiento fácilmente disponible en un laboratorio de microbiología. Para estos
recuentos se utilizan generalmente cámaras de recuentos, aunque también pueden
realizarse a partir de muestras filtradas en membranas y transparentadas o teñidas con
colorantes fluorescentes (Naranja de acridina).

La mayor dificultad del recuento en cámara es obtener reproducibilidad en el llenado de la

cámara con líquido. Otra dificultad es la adsorción de las células en las superficies del
vidrio, incluyendo pipetas. Esta adsorción es crítica en el proceso de dilución de la
muestra y se minimiza al realizar las diluciones en medios de alta fuerza iónica (solución
fisiológica o medios mínimos sin fuente de carbono).

Las cámaras más utilizadas son las de Hawksley y la de Petroff-Hausser. La primera tiene
la ventaja que puede ser utilizada con objetivos de inmersión, aunque la mayoría de los
recuentos se realizan con objetivos secos. Una de las mayores ventajas del recuento
microscópico es brindar información adicional sobre el tamaño y la morfología de los
objetos contados.
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Camara de recuento de Petroff-Hausser

Tipo de cuadro Area Volumen Factor

[cm2] [ml] [1/Volumen
]
Cuadrado total 1.00 x 10-2 2.00 x 10-5 5.00 x 104
Cuadrado grande 4.00 x 10-4 8.00 x 10-7 1.25 x 106
Cuadrado 2.50 x 10-5 5.00 x 10-8 2.00 x 107
pequeño

 1/Dilución: Inversa de la dilución utilizada para llenar la cámara de recuento.

 Número de cuadrados contados: Cantidad de cuadrados de la cámara que se
utilizaron para contar un el número de bacterias.
 Volumen del cuadrado: Volumen de cada cuadrado de la cámara. Depende del tipo
de cuadrado en donde se realizó el recuento. Por ejemplo, cada cuadrado pequeño
tiene un volumen de 5 x 10-8 ml (50 µm x 50 µm x 20 µm = 5 x 104 µm3 = 5 x 10-8
ml)

Recuento electronico: Los contadores electrónicos permiten realizar recuentos de bacterias,

levaduras no filamentosas y protozoarios, pero no de hongos y microorganismos
filamentosos o miceliares.

Estos instrumentos constan básicamente de dos compartimientos comunicados a través de

un pequeño conducto. En ambos compartimientos hay electrodos que miden la resistencia
eléctrica del sistema, y como el orificio del conducto es muy pequeño y su resistencia es
muy alta, la resistencia eléctrica de cada compartimiento es independiente. El principio de
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funcionamiento de estos instrumentos es el que se explica a continuación. Un volumen fijo

de una suspensión bacteriana es forzada a pasar desde un compartimiento al otro a través
del pequeño conducto, en un muy breve intervalo de tiempo. Cuando un microorganismo
pasa al nuevo compartimiento, la resistencia de éste se incrementa debido a que la
conductividad de la célula es menor que la del medio. Estos cambios en la resistencia son
convertidos en pulsos o voltaje y contados.

Este tipo de recuento presenta algunos inconvenientes. Ciertas bacterias muy pequeñas
producen cambios en la resistencia que son comparables al "ruido" generado por la
turbulencia que se desarrolla al pasar el fluido por el orificio. No pueden medirse células
que formen filamentos o agregados o soluciones muy concentradas de microorganismos,
debido a que el pasaje de más de una célula en un breve período de tiempo va a ser
tomado como una célula más grande. Es común la obstrucción del orificio por
microorganismos muy grandes.

MEDIDA DE LA MASA CELULAR

RECUENTO DE VIABLES

Se trata de conocer el número total de microorganismos presentes en el alimento. Este

número no guarda relación con el de microorganismos patógenos por lo que no puede
usarse como índice de su presencia y sólo debe considerarse un indicador de las
características higiénicas generales del alimento.

Dependiendo de las características del medio utilizado (medio rico, medio limitado en
nutrientes para medida de la flora no láctica de alimentos fermentados) y de las
condiciones de incubación (mesófilos, psicrófilos) los microorganismos analizados serán
miembros de poblaciones diferentes. En general se investiga la presencia de
microorganismos aerobios o aerotolerantes (anaerobios facultativos); aunque, en ciertas
situaciones (alimentos envasados al vacío), puede ser de interés hacer recuentos de
anaerobios totales.

Se han desarrollado técnicas que hacen posible la automatización del proceso.

Hay cuatro técnicas biológicas básicas técnicas de recuento de viables:.

1.- Contaje en Placa Standard (Standard Plate Count).

2.- Determinación del número más probable.

3.- Métodos basados en la reducción de colorantes por viables.

4.- Contaje microscópico directo.

1.- Contaje de Placa: Consiste en el plaqueo de una muestra de volumen conocido del
alimento que se analiza. El resultado es función de una serie de factores como son el
método de muestreo, el tipo de microorganismo, el tipo de alimento y las características
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del medio de cultivo. Los cultivos pueden hacerse tanto en masa como en superficie,
aunque hay que considerar que los cultivos en masa son letales para la flora psicotrofa.
Cada bacteria viable formará una colonia, el plaqueo puede hacerse en una placa normal o
por medio de un plaqueador en espiral que va depositando concentraciones
progresivamente más diluídas de la muestra.

2.- Filtros de membrana: utilizados cuando el número de bacterias es bajo. Son filtros con
un poro de 0,45 mm que retienen las bacterias. Se filtra un volumen dado y se coloca el
filtro sobre una placa del medio de cultivo apropiado. La muestra puede haber sido
procesada para epifluorescencia previamente, lo que facilita el recuento (la
epifluorescencia se puede provocar con naranja de acridina que tiñe específicamente los
ácidos nucleicos).

3.-Microcolonias en DEFT: DEFT son las iniciales en ingñlés

de Direct Epifluorescence Filter Technique (técnica deepifluorescencia directa en filtro). En
esta técnica las bacterias se filtran para retenerlas en una membrana apropiada que
posteriormente se trata con un agente fluorescente (como la naranja de acridina) para teñir
las células bacterianas (se somete el filtrado a un tratamiento previo con detergentes para
destruir las células somáticas). La detección de los microorganismos ha de hacerse
mediante microscopía de fluorescencia o por cualquier otro método de medida de la
epifluorescencia. En ciertos casos, las membranas se incuban para producir colonias que
son más fácilmente dtectables.

4. Contaje de microcolonias al microscopio: Se añade un pequeño volumen de agar-

cultivo a un porta y se incuba para seguir la formación de microcolonias al microscopio.

5.- Gotitas de agar: Se hacen diluciones de la muestra (solución madre) y se depositan

gotitas de 10 ml en una placa Petri (gotitas de cultivo + agar). Se examina el crecimiento de
las colonias en las gotitas tras la incubación.

6.- Films secos (Petrifilm): Son películas deshidratadas de medios de cultivos generales o
selectivos en las que se deposita 1 ml de la muestra que rehidrata el medio. Tras la
incubación se hace el recuento.

7.- Método del número más probable: Basado en series de diluciones y cálculo estadístico
del número de bacterias presentes en las diluciones más altas. Se puede hacer con 3 ó 5
tubos. El método es popular aunque poco exácto.

8.- Métodos basados en la reducción de colorantes : Usando azul de metileno o

resazurina. Colorantes reducidos por las bacterias; al reducirse cambian de color y esto es
medible. Usado en medios líquidos (lácteos).

9.- Tubos rodantes: son tubos herméticamente cerrados en los que haciéndolos girar se
forma una fina capa de agua. Utiles para recuento de anaerobios.

10.- Contaje microscópico directo: Usando cámaras de cuenta, se coloca un volumen

determinado y se recuentan las bacterias.
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