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Alan H. B. Wu
Las enzimas desempeñan un papel vital en la catalización de las reacciones bioquímicas necesarias
para el crecimiento humano normal, la maduración y la reproducción. La enzimología diagnóstica
implica la medición de enzimas en fluidos corporales para el diagnóstico de la enfermedad. En la
mayoría de los casos, los niveles séricos o sanguíneos son los más útiles, aunque a veces son
importantes los niveles de orina, cerebroespinal y líquido extracelular.
Este capítulo se centra en los aspectos analíticos y la importancia clínica de las enzimas
importantes que se miden con fines de diagnóstico. El mayor énfasis se pone en el uso de estas
enzimas para el diagnóstico de cáncer y de enfermedades que afectan al hígado, el miocardio, el
músculo esquelético, el páncreas, la próstata y el hueso. En el caso del infarto de miocardio,
también se discuten los marcadores que no son enzimas, como la mioglobina y la troponina.
La mayoría de las enzimas que se utilizan con fines de diagnóstico no tienen un papel fisiológico
directo en la sangre. Su presencia en circunstancias normales es el resultado del envejecimiento
natural y la renovación de las células. Las enzimas liberadas en la sangre normalmente se eliminan
de la circulación mediante el metabolismo dentro del sistema reticuloendotelial, aunque algunas
son eliminadas por los riñones (por ejemplo, amilasa). El nivel normal de actividad de estas
enzimas en el suero es una función de la tasa de liberación y eliminación. Las vidas medias de estas
enzimas varían mucho, desde aproximadamente 2 horas para la isoenzima BB de la creatina
quinasa hasta 170 horas para la fosfatasa alcalina placentaria.
Los niveles altos de enzimas en la sangre pueden indicar un aumento en el recambio celular y la
necrosis tisular causada por la enfermedad. Esto fue demostrado por primera vez por LaDue et al.
en 1954, cuando observaron que la actividad aspartato aminotransferasa aumentó después de un
infarto agudo de miocardio (1). En estudios posteriores que utilizaron lesión hepática inducida por
tetracloruro de carbono en ratas, estos investigadores demostraron que los altos niveles de
enzimas en suero eran causados por fugas de los hepatocitos dañados. Una vez liberadas de las
células, las enzimas pueden pasar directamente a la sangre (si el tejido es altamente vascular y no
hay obstrucción al flujo) o llegar al torrente sanguíneo a través de un drenaje linfático más lento.
El origen subcelular juega un papel en la facilidad con que aparecerá una enzima en la sangre. Las
enzimas citoplásmicas solubles pasan a través de un conjunto de membranas, mientras que las
enzimas mitocondriales también deben pasar a través de un segundo conjunto de membranas.
Una causa igualmente importante y ampliamente ignorada de los altos niveles de enzimas en la
sangre es la síntesis de nuevas enzimas en los tejidos que se produce en respuesta a la
enfermedad, la inducción por diversos fármacos y la carcinogénesis (2). Por ejemplo, en la
enfermedad hepática obstructiva, el fosfato alcalino hepático se incrementa en gran medida
debido al aumento de la síntesis debido a la presión intracanalicular anormal. El fenobarbital y
varias otras drogas inducen la producción de enzimas microsómicas que conducen a una síntesis
aumentada de y-glutamiltransferasa. Además, las enzimas normalmente ausentes en el suero
pueden aparecer como resultado de un proceso neoplásico.
Las enzimas (E) son catalizadores biológicos que se combinan con sustratos (S) para formar
complejos intermedios (ES) que conducen a la formación del producto (P) y a la restauración de la
enzima original (3). Las reacciones que implican un sustrato exhiben la siguiente cinética:
S + E → [ES] → P + E
La amilasa y la lipasa son ejemplos de enzimas de este esquema. Pero la mayoría de las otras
enzimas catalizan reacciones más complejas en las que hay dos o más sustratos que forman
productos múltiples.
Se deben considerar muchos parámetros al desarrollar una formulación de reactivo para medir
enzimas. La mayoría de las enzimas funcionan de manera óptima dentro de un estrecho rango de
pH. Los valores superiores o inferiores a este rango pueden inactivar las enzimas alterando la
estructura terciaria del sitio activo o desnaturalizando la proteína. El pH también puede influir en
la dirección de la reacción, tal como para lactato deshidrogenasa, para la cual la conversión de
lactasa en piruvato se favorece a pH alcalino, mientras que la reacción inversa se favorece a pH
fisiológico. El amortiguador específico elegido para mantener el pH también puede ser importante,
ya que algunos tampones participan en la reacción y aumentan su velocidad. Por ejemplo, para
fosfatasa alcalina, el reactivo 2-amino-2-metil-1-propanol actúa como un amortiguador y como un
aceptor de grupo fosfato.
Cofactores y coenzimas no presentes en la muestra o suministrados por el amortiguador también
deben agregarse a la mezcla de reacción para asegurar una actividad óptima. El fosfato de
piridoxal es una coenzima necesaria tanto para el aspartato como para la alanina
aminotransferasa, mientras que el magnesio es un cofactor necesario para la fosfatasa alcalina.
Otras sustancias que se necesitan para mejorar la actividad se llaman activadores y también se
agregan a la mezcla de reacción. Por ejemplo, la N-acetil cisteína se usa para activar la creatina
quinasa.
La temperatura utilizada para la reacción debe controlarse estrictamente porque las velocidades
de reacción generalmente se duplican con cada 10°C que aumenta la temperatura. Las altas
temperaturas pueden desnaturalizar muchas proteínas y enzimas. Por convención, la mayoría de
las enzimas se analizan a 37°C. Aunque esta elección es algo arbitraria, tener una temperatura
estándar facilita la comparación de los resultados de la prueba de un laboratorio a otro.
INHIBIDORES
Los inhibidores son sustancias que pueden disminuir la tasa de reacción catalizada por enzimas.
Ellos interactúan con la enzima de varias maneras. Los inhibidores competitivos compiten con el
sustrato por la unión al sitio activo de la enzima. El efecto de un inhibidor competitivo es
aumentar Km sin afectar la velocidad máxima, Vmax. El aumento de la concentración de sustrato
contrarresta el efecto de un inhibidor competitivo. Los inhibidores no competitivos disminuyen la
velocidad de reacción al interactuar con la enzima sin afectar directamente la unión enzima-
sustrato. Vmax se reduce sin efecto en Km. En este caso, el efecto no puede contrarrestarse
aumentando la concentración de sustrato. Los inhibidores no competitivos interactúan con el
complejo enzima-sustrato, lo que impide la formación del producto. Tanto Vmax como Km están
alterados.
Los inhibidores juegan un papel importante en la enzimología diagnóstica. Los inhibidores se usan
para eliminar selectivamente la actividad de isoenzimas específicas, proporcionando un medio
para detectar otras isoenzimas. El tartrato, por ejemplo, se usa para inhibir algunas isoenzimas de
la fosfatasa ácida, mientras que la dibucaína se usa para detectar la presencia de variantes
genéricas de la colinesterasa sérica.
Las mediciones de enzimas han usado tradicionalmente ensayos cinéticos para determinar la
actividad. Sin embargo, se han desarrollado nuevos análisis que miden las concentraciones de
proteína (masa). Ambos tipos de análisis se discuten en esta sección.
La Figura 11.2 ilustra una reacción típica catalizada por enzimas para un análisis cinético de
reactivo único. La reacción se controla a una longitud de onda a la que el producto de reacción
absorbe la luz. La fase de retraso inicial es causada por el tiempo necesario para que la enzima se
active por completo mediante cofactores y coenzimas agregadas a un reactivo. Generalmente, es
necesario un retraso de 30 a 120 segundos antes de que las lecturas de absorbancia tengan
sentido. Después de la fase de latencia, la reacción comienza la fase lineal, caracterizada por una
velocidad constante de cambio en ausencia. La reacción se controla tomando lecturas a intervalos
regulares durante 2 a 5 minutos después de la fase de retraso.
La actividad de la enzima puede expresarse en unidades por litro o nanokatales por litro. Una
unidad internacional se define como la cantidad de enzima necesaria para catalizar la conversión
de un micromol de sustrato por minuto. La unidad SI correspondiente es la cantidad de enzima
que catalizará la conversión de un nanomol de sustrato por segundo (nanokatales). Debido a que
la ley de Beer establece que la concentración es proporcional a la absorbancia, la actividad de la
enzima puede determinarse a partir del cambio en la absorbancia por unidad de tiempo. La tasa
de cambio en la absorbancia se multiplica por factores para tener en cuenta la absortividad molar
del producto o sustrato que se está monitoreando, la longitud del camino celular y la dilución de la
muestra por los reactivos en la mezcla de reacción:
∆A/ min × TV
Actividad (U/litro) = ∈ ×b × SV
× 1000
Como ejemplo, si una enzima produce NADH (absorbancia milimolar = 6.3) con un ΔA / min de
0.046, y si los volúmenes total y de muestra son 300 y 5 μl, respectivamente, y se usa una longitud
de trayectoria de 1 cm, la actividad (en U / L) se calcula como:
0.046 × 300
Actividad = 6.3 × 1 × 5
× 1000 (U/litro)
MEDICIONES DE MASA
La insuficiencia hepática aguda se caracteriza por una necrosis hepatocelular extensa y una
mortalidad muy alta; tiene una serie de etiologías. Una es la progresión a la hepatitis fulminante,
que se ve con mayor frecuencia con la hepatitis B. La hepatitis tóxica también es una causa
importante. La Tabla 11.1 enumera varias sustancias que pueden producir insuficiencia hepática
aguda. Las manifestaciones clínicas incluyen disfunciones metabólicas como encefalopatía y
desequilibrio de agua y electrolitos, anomalías de la coagulación, hipoglucemia, insuficiencia
respiratoria e insuficiencia renal. Al igual que con la enfermedad hepatocelular, la insuficiencia
hepática aguda se caracteriza por grandes aumentos de AST y ALT en suero.
La colestasis es la supresión del flujo biliar y puede ser de origen extrahepático o intrahepático. La
delimitación entre estos tipos no es posible únicamente sobre la base de las pruebas de enzimas,
aunque ciertos patrones de actividades enzimáticas favorecen una forma sobre la otra.
Morfológicamente, la presencia de pigmentos biliares en los hepatocitos define esta condición.
Los niveles séricos de enzimas hepáticas y bilirrubina son anormales en la colestasis. Sin embargo,
debido a la capacidad de reserva del hígado para el metabolismo y la excreción, estas enzimas y
sales aumentan en el suero solo cuando se ha deteriorado más del 80% de la capacidad funcional
hepatocelular. El capítulo 8 describe el papel de la bilirrubina conjugada y no conjugada en la
enfermedad colestásica. Los marcadores enzimáticos de obstrucción incluyen fosfatasa alcalina, y-
glutamiltransferasa, 5'-nucleotidasa y leucina aminopeptidasa.
OBSTRUCCIÓN INTRAHEPATICA
La colestasis extrahepática suele ser el resultado de una obstrucción mecánica del conducto biliar
común o del conducto hepático. Las etiologías comunes de este trastorno incluyen colelitiasis y
carcinoma de la punta del páncreas, papila de Vater o conducto biliar común. Estos procesos
conducen a la dilatación del árbol ductal inmediatamente arriba de la obstrucción. Los procesos
inflamatorios es la colangitis esclerosante también puede producir colestasis extrahepática.
La hepatitis crónica es una enfermedad con etiologías diversas, que incluyen causas virales,
autoinmunes y lupoide. En causas virales, alrededor del 5 al 10% de los pacientes con hepatitis B y
hasta el 50% de los pacientes con hepatitis C desarrollan esta enfermedad recurrente. La forma
activa se caracteriza por la infiltración de monocitos y la necrosis hepática. La hepatitis activa
crónica comúnmente conduce a la alteración de la arquitectura lobular y la fibrosis y puede
progresar a cirrosis hepática. En contraste, la hepatitis persistente crónica es un trastorno más
leve que raramente progresa a cirrosis y fibrosis. En contraste, la hepatitis persistente crónica es
un trastorno más leve que raramente progresa a cirrosis y fibrosis. Los resultados de las enzimas
hepáticas tienden a ser más elevados en la forma activa; sin embargo, la diferenciación se logra
mejor al realizar una biopsia hepática.
CIRROSIS
CÁNCER DE HÍGADO
ALP
p-NPP + H2O → PO4-3 + p- nitrofenóxido
El rango de referencia para la fosfatasa alcalina depende de la edad y se relaciona con las
diferentes etapas del crecimiento óseo y la desmineralización durante la vida. La figura 11.5 ilustra
esta dependencia. Los niños tienen rangos de referencia más altos que los adultos,
particularmente durante la adolescencia. Las poblaciones más viejas tienen un rango de referencia
de fosfatasa alcalina creciente, lo que refleja un aumento en la incidencia de osteoporosis en esta
población.
Isoenzimas ALP
La fosfatasa alcalina está ampliamente distribuida por los tejidos del cuerpo. Entre los que tienen
la actividad relativa más alta están las glándulas suprarrenales, la placenta, el tracto
gastrointestinal, los huesos, los riñones y el hígado. En adultos normales no embarazados, sin
embargo, la mayor parte de la ALP sérica se origina en el hueso y el hígado. Para pacientes con
altos niveles de ALP, la medición de las isoenzimas de fosfatasa alcalina es útil para diferenciar
entre las fuentes de los huesos y el hígado. Sin embargo, debido a las dificultades técnicas con la
electroforesis zonal y el uso creciente de marcadores enzimáticos más específicos para la
obstrucción hepática, como la y-glutamiltransferasa, la necesidad clínica de isoenzimas ALP es
rara, y la mayoría de los laboratorios no ofrecen fraccionamiento rutinario.
Los métodos analíticos para las isoenzimas ALP incluyen la inhibición química selectiva, como con
la fenilalanina, la inactivación por calor, la electroforesis y el enfoque isoeléctrico. La incubación de
suero a 56 ° C durante 15 minutos puede proporcionar una estimación del contenido de isoenzima
ALP. La isoenzima placentaria y las formas placentarias como la isoenzima Regan son muy estables
y permanecerán activas después de la incubación a esta temperatura. La fracción hepática
retendrá del 25 al 50% de la actividad residual, mientras que la fracción ósea será en gran parte
inactiva después de esta incubación.
La electroforesis zonal ha sido ampliamente estudiada y producirá bandas para las fracciones (a)
placentaria, (b) intestinal y (c) ósea, hepática y renal. Hay diferentes grados de superposición entre
las isoenzimas ALP de los tejidos del último grupo, dependiendo del medio de soporte de
electroforesis. Las isoenzimas ALP del hueso, el hígado y el riñón se originan a partir de una sola
expresión génica que ha sido modificada post-sintéticamente. Es posible mejorar la resolución
entre las fracciones ósea y hepática tratando cualquiera de los soportes de electroforesis con
lectina de germen de trigo o tratando las muestras con neuraminidasa. Los estudios
electroforéticos también han demostrado una nueva fracción de isoenzima migrante anódica a la
fracción hepática. La isoenzima, denominada "¨a" o fracción hepática rápida, se observa en
trastornos hepatobiliares y puede ser un marcador útil para el cáncer de hígado.
Es posible realizar una evaluación más definitiva de las isoenzimas ALP con isoelectroenfoque
(IEP). La figura 11.6 ilustra un ensayo de isoenzima de fosfatasa alcalina disponible
comercialmente por IEF. Se pueden identificar al menos 12 bandas distintas de ALP con pl’s que
van desde 3.01 para la última fracción hepática hasta 4.86 para la ALP intestinal. Antes del
desarrollo de este ensayo, el uso rutinario del enfoque isoeléctrico se ha limitado en gran medida
a las aplicaciones de investigación debido a la complejidad del procedimiento analítico.
La mayoría de los métodos analíticos comerciales para GGT utilizan uno de los dos substratos
sintéticos: y-L-glutamil-3-carboxi-4-nitroanilida. El sustrato carboxi es actualmente preferido
debido a una mayor solubilidad y debido a que la hidrólisis del sustrato no ocurre
espontáneamente. Sin embargo, el sustrato no sustituido más antiguo se usa más ampliamente.
Las reacciones de ambos se muestran a continuación:
GGT
y-glutamil-p-nitroanilina + glicilglicina →
y-glutamilglicilglicina + p-nitroanilina
GGT
y-glutamil-3-carboxi-4-nitroanilida + glicilglicina→
p-nitroanilina + 5 amino-2-nitrobenzoato
Cualquiera de las reacciones puede controlarse siguiendo la absorbancia creciente del producto
respectivo a 405 nm. Tris y glicilglicina se usan como tampones para mantener un pH de 8.0. Los
iones de magnesio se agregan cuando se usa γ-nitroanilina para mejorar la solubilidad. Las
absorbancias milimolares son 9.9 litros / mmol * cm para p-nitroanilina a 405 nm y 7.9 litros /
mmol * cm para 5-amino-2-nitrobenzoato a 410 nm. Los rangos de referencia a 37 ° C son de 9 a
50 para los hombres y de 8 a 40 U / litro para las mujeres. Aunque la mayor parte de la enzima se
origina en el hígado, se libera una pequeña cantidad de GGT de la próstata, lo que puede explicar
por qué los hombres tienen valores ligeramente más altos que las mujeres.
5’NT
Adenosina-5'-monofosfato+ H2O →
Adenosina + fosfato
Mediciones analíticas
ALT
L-alanina + a-oxoglutarato →
piruvato + L-glutamato
LDH
piruvato + NADH → lactato + NAD +
LDH
L-aspartato + a-oxoglutarato →
oxaloacetato + L-glutamato
MDH
oxaloacetato + NADH → L-malato + NAD +
Las reacciones se controlan siguiendo la disminución de la absorbancia a 340 nm cuando se
consume NADH en la reacción. Se necesita piridoxal-5'.fosfato (P5'P) como coenzima para las
reacciones ALT y AST. Normalmente, el suero contiene cantidades adecuadas de P5'P y no es
necesaria una coenzima adicional. Sin embargo, los pacientes con deficiencia de vitamina B6 o
sometidos a diálisis renal tienen una concentración de P5'P disminuida, lo que producirá niveles de
aminotransferasa sérica falsamente bajos a menos que la concentración de P5'P, que producirá
niveles de aminotransferasa sérica falsamente bajos a menos que P5'P se agregue a la formulación
del reactivo.
Rangos de referencia
A diferencia de algunos trastornos como la pancreatitis aguda y el infarto de miocardio, para los
cuales existen marcadores enzimáticos que se usan principalmente para un trastorno y tienen una
alta eficiencia diagnóstica, no existen marcadores enzimáticos que sean específicos para una
enfermedad hepática individual. Al evaluar estos trastornos, por lo tanto, es apropiado considerar
un panel de marcadores, a veces llamado prueba de función hepática (LFT). A través del uso
común, este término se ha convertido en un grupo de pruebas que generalmente incluye
bilirrubina, AST, ALT. ALP, y algunas veces GGT y 5'NT. Sin embargo, el término es un nombre
inapropiado, porque si bien estas pruebas pueden reflejar diversos procesos de enfermedad en el
hígado, no reflejan la reserva hepática para la síntesis y las funciones metabólicas. La Tabla 11.2
enumera algunos marcadores tanto para la función hepática como para la enfermedad.
Lesión aguda
Los marcadores enzimáticos más útiles de la lesión hepatocelular aguda son ALT y AST. Otros
marcadores, como lactato, glutamato, isocitrato y malatodeshidrogenasas, presentan elevaciones
secundarias a la necrosis hepatocelular, pero no son tan sensibles ni tan específicos como la
combinación de AST y ALT y, por lo tanto, rara vez se utilizan con fines de diagnóstico.
Los niveles absolutos más altos de ALT y AST se observan después de la hepatitis aguda, ya sea
viral o tóxica. Los valores que exceden 1000 U/litro se ven comúnmente durante las primeras fases
de estas enfermedades. En la hepatitis tóxica, como con las sobredosis de paracetamol, los niveles
de ALT y AST aumentan unas pocas horas después de la exposición y permanecen altos durante
varios días o semanas. Desafortunadamente, la extensión de las elevaciones de ALT y AST no
refleja la gravedad de la enfermedad, ni puede correlacionarse con el pronóstico del paciente. En
la hepatitis A aguda, la ALT es uno de los primeros marcadores que se eleva, generalmente de 3 a
4 semanas después de la infección. Los niveles vuelven a la normalidad en 8 a 12 semanas. En la
hepatitis B aguda, la fase de incubación preclínica es más prolongada y la ALT y la AST pueden
permanecer normales durante 2 a 6 meses. En la hepatitis B aguda, ALT y AST vuelven a la
normalidad en 2 a 3 meses, y se observa un curso similar en la hepatitis C. En la hepatitis crónica
activa, los niveles de enzimas se elevan de 5 a 10 veces, dependiendo de la etapa de la
enfermedad. Elevaciones similares también se observan en la lesión hepatocelular aguda
secundaria a la mononucleosis. En la enfermedad hepática en etapa terminal, los niveles de
enzimas vuelven a niveles normales o subnormales a medida que los hepatocitos se agotan de
contenido de enzima.
Por el contrario, los niveles de ALP, GGT y 5'NT no son tan marcadamente elevados en estos
trastornos. Los niveles de estas enzimas generalmente no exceden de 2 a 3 veces el límite superior
de lo normal. Por lo tanto, un aumento desproporcionado de ALT y AST en relación con ALP y GGT
favorece el diagnóstico de necrosis hepatocelular en lugar de la obstrucción hepática. La relación
de estas enzimas en la enfermedad hepática hepatocelular se resume en la figura 11.7 (5).
Colestasis
Los mejores marcadores para la colestasis intrahepática y extrahepática son ALP, GGT y 5'NT. Las
elevaciones más grandes (de 4 a 10 veces) de ALP se observan típicamente en obstrucción debido
a cálculos biliares o malignidad, y en la cirrosis biliar. La fuente de ALP en tumores malignos puede
ser la obstrucción de la arquitectura hepática en cánceres hepáticos primarios o secundarios, pero
deben descartarse otras causas de elevaciones de ALP (ver Fosfatasa Alcalina Ósea, más adelante).
La enfermedad hepática obstructiva como causa de las elevaciones de ALP puede confirmarse
midiendo GGT o 5'NT. También se esperan aumentos en estas enzimas en colestasis, pero estos
ensayos son más específicos porque, si bien la enfermedad ósea puede producir elevaciones de
ALP en el mismo intervalo esperado para enfermedad hepática obstructiva, no se encuentran GGT
y 5'NT en el hueso. La medición de la bilirrubina total y directa también es importante para hacer
el diagnóstico de ictericia obstructiva.
Los trastornos hepáticos agudos, como la hepatitis viral aguda y la mononucleosis infecciosa,
generalmente tienen valores más altos de ALT en relación con AS, y la relación De-Ritis es inferior
a 1,0. En el síndrome de Reye, en el que hay un inicio agudo de encefalopatía, la relación de De-
Ritis también es menor que 1 en la mayoría de los casos. Se ha postulado que las elevaciones en
ALT se observan antes de elevaciones en AST en procesos hepáticos agudos porque AST incluye
isoenzimas mitocondriales, y se necesita más tiempo para que estas enzimas pasen a través de un
segundo conjunto de membranas para alcanzar la circulación. De hecho, los trastornos crónicos
como la hepatopatía alcohólica, la cirrosis posnecrótica y la hepatitis crónica activa tienen
proporciones de Ritis mayores que 1. Aunque esta es una forma conveniente de recordar esta
relación, la fracción mitocondrial de AST en realidad contribuye solo con un pequeño porcentaje
de la AST total y es insuficiente para disminuir significativamente la relación de De-Ritis (figura
11.8). Los pacientes con hepatitis crónica persistente tendrán un nivel de aminotransferasas
normal o ligeramente elevado, lo que refleja el curso clínico leve de esta enfermedad.