LABORATÓRIO DE MICROBIOLOGIA

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NORMAS DE SEGURANÇA PARA AS AULAS PRÁTICAS DE MICROBIOLOGIA

É indispensável o uso de avental no laboratório. O avental deve ser comprido, de mangas

compridas e estar abotoado;

Não comer, beber e fumar no laboratório;

O Material pessoal (bolsas cadernos, mochilas, agasalhos, etc.) deve ser mantido longe das
bancadas de trabalho. Utilizar na bancada somente o material necessário ao trabalho prático,
como: roteiro de aula, papel e lápis ou caneta para anotações;

Em caso de qualquer acidente (derramamento de culturas, quebra de placas, ferimentos,

aspiração de culturas, etc) comunicar imediatamente o professor ou o técnico responsável pela
aula prática;

Descarte de material:
a) Materiais contaminados devem ser colocados nos recipientes próprios, existentes nos
laboratórios. NUNCA deixá-los nas bancadas ou pias;
b) Placas de petri deverão ser deixadas tampadas sobre a bancada;
c) Lâminas fornecidas para visualização deverão ser deixadas sobre as bancadas;
d) Tubos com culturas deverão ser deixados nas estantes.

Prestar atenção às atividades dos colegas ao lado para evitar acidentes

Terminados os trabalhos práticos:

a) Esterilizar alças e fios de platina;
b) Verificar se as torneiras de água e gás estão fechadas;
c) Desligar lâmpadas e microscópios;
d) Limpar microscópios e cobri-los com a capa;
e) Tirar o avental e guardar;
f) Lavar cuidadosamente as mãos com água e sabão ou anti-séptico.

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PRÁTICA 1- PREPARO DE MATERIAL PARA TRABALHO E ESTERILIZAÇÃO

INTRODUÇÃO

Para a realização de qualquer tipo de procedimento no laboratório de microbiologia, a

organização do trabalho é um ponto primordial. O aluno deverá saber exatamente o
procedimento que irá realizar e deverá dispor de todo o material no momento da execução do
trabalho.

Além disso, algumas etapas da organização como esterilização e preparo de meios de

cultura devem ser realizadas previamente. No momento do trabalho, o material deve estar
esterilizado, seco, bem acondicionado. Os meios de cultivo devem estar bem preparados,
esterilizados, solidificados (se for o caso), na temperatura adequada e na quantidade adequada
ao uso.

O aluno deve entender que qualquer falha na organização levará a falha total do
experimento.

PROCEDIMENTO

Preparar os seguintes materiais para esterilização:

 6 placas de petri
 10 tubos de ensaio com tampa ou rolha de algodão
 1 frasco pequeno de boca larga com rolha de algodão
 água destilada em um frasco
 Pipetas de 1 mL
 Pipetas de 100 µL
 Dois swabs
 Duas alças de drigalski

Colocar data e nome no material, levar à autoclave para correta esterilização.

- Verificar se a resistência do autoclave está coberta de água

-Acondicionar corretamente o material

-Ligar o aparelho, fechar a tampa deixando a válvula de escape aberta

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-Quando o vapor sair de forma contínua, fechar a válvula

-Quando o aparelho atingir 121º C, iniciar a contagem do tempo de esterilização

-Desligar o aparelho e esperar o ponteiro do manômetro chegar a zero para então abrir a válvula
de escape

Após o ciclo, levar ao forno de secagem e acondicionar o material em local adequado.

QUESTÕES PARA DISCUSSÃO

Por que motivo utilizou-se papel permeável? Por outro lado, porque este papel deve ser
resistente?

As roscas dos frascos devem ser apertadas ou frouxas?

Por que o material deve ser seco antes de ser utilizado?

Por que o material deve ser datado e identificado?

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PRÁTICA 2: PREPARO DE MEIO DE CULTURA E COLETA DE AMOSTRA

MICROBIANA

Quando desejamos estudar um microrganismo ou mantê-lo em laboratório eles

devem ser inoculados em um material nutriente denominado meio de cultura. Este meio
deve ter as características físicas e químicas adequadas para o crescimento do
microrganismo e deve ser adequado as finalidades de estudo. Algumas bactérias são
capazes de crescer em qualquer meio de cultura, outras necessitam de meios especiais e
existem aquelas que não são capazes de crescer em nenhum meio de cultura já
desenvolvido.

 Inicialmente devemos escolher a COMPOSIÇÃO DO MEIO:

Complexos
Quimicamente definidos
Seletivos
Diferenciais

 Este meio deve estar ESTERILIZADO.

 Os meios de cultura podem ser SÓLIDOS, SEMI-SÓLIDOS OU LÍQUIDOS.

O microrganismo deve ser retirado do meio inicial ou do local de coleta e

transferido para o meio de cultura em questão com o auxílio de uma alça de repique ou
outro material esterilizado

Quando coletamos microrganismos de um determinado local, muitas vezes é importante

quantificá-los. Ex: análise de contaminação de alimentos ou água, curvas de crescimento em
laboratório, execução de um experimento, etc.

A técnica de contagem em placa é a técnica mais utilizada para determinar o tamanho de uma
população microbiana. São aplicados três princípios:

 Considera-se que cada colônia formada a partir do inoculo foi originada de um único
microrganismo,
 Considera-se que o inoculo original é sempre homogêneo
 Considera-se que não existe agregação de células

Para que a contagem seja realizada corretamente, é necessário que apenas um número limitado
de colônias tenha crescido na placa. Normalmente são realizadas contagens em placas contendo
entre 25 e 250 colônias. Para que isso ocorra é necessário realizar diluições seriadas.

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Técnica da diluição seriada

Na diluição seriada, o inoculo é diluído em uma série de tubos de diluição. Cada tubo terá uma
fração do número de microrganismos presentes no tubo anterior. Posteriormente, uma alíquota
de cada um destes tubos será transferida para placas de Petri contendo meios de cultura, onde
ocorrerá o crescimento de colônias e será possível fazer a contagem. O número de colônias será
utilizado na determinação da quantidade de bactérias presentes na amostra original

PROCEDIMENTO

Após a demonstração da preparação de meio de cultura, os alunos receberão uma

quantidade adequada de meio preparado e autoclavado. Deverão então colocar o meio de forma
asséptica nas placas de petri e tubos de ensaio que foram autoclavados na última aula. O
material deve ser acondicionado corretamente de forma que o meio de cultivo solidifique. O
material deve ser identificado corretamente com o nome da dupla e o tipo de meio de cultura.

Após a solidificação do meio, os alunos coletarão1 mL de saliva em um frasco

esterilizado. Colocar 0,9 ml de água destilada esterilizada em quatro tubos de ensaio. Realizar
diluições seriadas e inocular 100 microlitros de cada tubo em uma placa de petri com meio de
cultura. Identificar corretamente o material e incubar em estufa a 37º C por 24 a 48 horas.

QUESTÕES PARA DISCUSSÃO

Porque você utilizou a diluição seriada e não a saliva pura para o inóculo de microrganismos em
placas para a contagem?

O que você espera encontrar a partir do inóculo de uma amostra de saliva?

Por que o meio deve ser colocado assepticamente nas placas e tubos?

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PRÁTICA 3: OBTENÇÃO DE CULTURA PURA E CONTAGEM DE

MICRORGANISMOS

CULTURAS PURAS: Quando coletamos uma amostra de um material infeccioso,

amostra de solo, água, ou alimentos e semeamos na superfície de um meio de cultura,
várias colônias irão se desenvolver. Teoricamente, cada uma dessas colônias foi
originada de um único microrganismo o esporo. Normalmente as colônias microbianas
apresentam características morfológicas que permitem distinguir os microrganismos.
Quando transferimos uma colônia isolada de um meio em que existiam várias colônias
para outro meio esterilizado, obtemos uma cultura pura.

Esgotamento por estrias

Utilizado quando se deseja obter colônias isoladas a partir de um material que contenha
uma mistura de microrganismos.

Uma alça esterilizada é mergulhada na cultura mista (contendo mais de um tipo de

microrganismo). Esse inóculo deve ser espalhado em estrias em pela placa sem
recarregá-la, até que o inóculo seja esgotado, restando poucos microrganismos de modo
a obter culturas isoladas.

Espalhamento com alça de Drigalsky

Utilizada quando desejamos quantificar o número de microrganismos em uma

determinada alíquota, ou qualquer outra situação em que seja necessário que todos os
microrganismos de uma alíquota sejam inoculados no meio de cultura.

Uma alíquota de uma suspensão microbiana (Ex: 0,1 ml) é depositada no meio de
cultura com uma pipeta e então espalhada com a alça uniformemente.

Cálculo:

Número de UFC da placa X Índice de diluição da amostra

= N de bactérias em 1ml da amostra original

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Exemplo:

Foram contadas 150 Unidades formadoras de colônia (UFC) na placa de Petri correspondente a
quinta diluição de uma amostra (1/10000; índice de diluição 10.000). Quantas UFC teremos em
1 ml da amostra original?

150 x 10.000 = 1,5 X 106 UFC/ mL

A diluição pode ser feita transferindo-se 0,1ml da amostra para 0,9ml do meio de cultura
esterilizado, ou qualquer outra diluição (1/2, ¼, 1/8...). Neste caso, aplica-se uma regra de três
simples para obter o número de UFC em 1ml da cultura original.

As amostras podem ser plaqueadas pela técnica do POUR PLATE ou do espalhamento

por ALÇA DE DRIGALSKI.

PROCEDIMENTO

Realizar a contagem do número de bactérias aeróbias presentes em 1 mL de saliva, conforme o

resultado obtido no experimento anterior

Escolher uma colônia de alguma das placas do experimento anterior. Coletar de forma asséptica
com a alça de repique e inocular em uma placa de petri esterilizada pela técnica do esgotamento
por estrias. Incubar em estufa a 37º C por 24 a 48 h.

QUESTÕES PARA DISCUSSÃO:

Quantas unidades formadoras de colônia havia na placa escolhida para a contagem? Porque
você a escolheu?

Se a colônia que você escolheu era visivelmente separada das demais, porque realizar uma
inoculação de esgotamento por estrias?

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PRÁTICA 4- REPIQUE SIMPLES E TÉCNICAS DE IDENTIFICAÇÃO BACTERIANA

À medida que o meio de cultura se esgota, é necessário fazer a transferência do

microrganismo para um meio de cultura fresco e livre de contaminação microbiana. A
preservação de microrganismos em cultura pura é um tópico importante em um laboratório de
microbiologia

PROCEDIMENTO

Utilizar a placa em que foi realizado o esgotamento por estrias na aula anterior.
Transferir uma colônia isolada para um tubo contendo meio de cultura sólido e incubar em
estufa a 37º C por 24 a 48 h.

QUESTÕES PARA DISCUSSÃO

Porque a coloração de gram é o primeiro passo para a identificação de uma bactéria?

Em que se baseiam os testes de identificação bacteriana?

Dê três exemplos de testes de identificação bacteriana

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PRÁTICA 5: COLORAÇÃO DIFERENCIAL DE GRAM

INTRODUÇÃO

Coloração diferencial

Corantes diferenciais reagem de modo distinto a diferentes tipos de bactérias, portanto

podem ser usados para diferenciá-las.

Coloração diferecial de gram

Método escrito em 1884 pelo médico dinamarquês Hans Christiam Gram

Sua finalidade é separar as bactérias em dois grupos de acordo com a cor revelada
durante o processo.

Com base nas diferenças existentes na estrutura de suas paredes, as bactérias são
classificadas como bactérias Gram positivas ou Gram negativas.

A parede de bactérias gram positivas constitui-se de uma camada grossa de

peptidoglicano e a parede de bactérias gram negativas constitui-se de uma ou algumas
camadas de peptidoglicano e uma membrana externa.

Corante primário: Violeta de genciana _ cora células gram positivas e gram negativas de
roxo

Iodo (mordente): Formação de grandes cristais que se combinam com o peptidoglicano.

Álcool (descorante) : dissolve os lipídeos na membrana externa da parede celular de

gram negativos permitindo a remoção dos cristais de corante de suas paredes celulares.
Na parede de bactérias gram positivas, os cristais permanecem.

Safranina (contracorante) Cora as bactérias Gram negativas que ficaram incolores de

rosa

OBJETIVO

Desenvolver o procedimento da coloração diferencial de Gram

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MATERIAL E MÉTODO

Material

- Esfregaço bacteriano
- Cristal violeta
-Safranina
- Iodo (Lugol)
-Álcool
-Microscópio óptico
-Óleo de imersão
-Pipeta de pasteur

Procedimento

Cobrir o esfregaço com cristal violeta e deixar agir por 1 minuto.

Descartar o corante e cobrir o esfregaço com lugol.
Deixar agir por 1 minuto e lavar delicadamente em água corrente.
Lavar o esfregaço com álcool por 30 segundos e lavar em água corrente.
Acrescentar safranina até cobrir o esfregaço e deixar agir por 30 segundos
Lavar em água corrente delicadamente e secar naturalmente
Observar ao microscópio com objetiva de imersão

QUESTÕES PARA DISCUSSÃO

1- O que foi possível observar? Desenhe e descreva

2- Quais as informações você pode concluir sobre o microrganismo observado a
partir da técnica de coloração de Gram?
3- Explique o fundamento teórico da coloração de Gram

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PRÁTICA 6: EFEITO DE DESINFETANTES SOBRE MICRORGANISMOS IN

VITRO
Desinfetantes são substâncias ou produtos capazes de destruir indiscriminadamente os
microrganismos de uma superfície, sem, no entanto, eliminar as formas esporuladas.

Material
- Dois tubos contendo 5 ml de solução salina esterilizada
- Três tubos contendo desinfetantes previamente diluídos (1 ml de desinfetante para 4
ml de água). Utilizar 3 tipos diferentes de desinfetantes: (álcool 70, hipoclorito,
clorexidina, glutaraldeído, triclosan, etc)
- Uma placa de petri contendo Agar nutriente - Alça de repique
- Pipeta de 1 ml

PROCEDIMENTO
Transferir uma alçada do microrganismo obtido nos experimentos anteriores para um
tubo contendo 5 mL de solução salina
Pipetar 0,5 ml do microrganismo a ser utilizado (cada grupo realizará o experimento
com um microrganismo) e transferir para o tubo contendo salina e para os três tubos
contendo desinfetantes.
Aguardar 15 minutos
Dividir a placa contendo Agar nutriente marcando o fundo com caneta, anotar o
desinfetante correspondente a cada setor e o microrganismo utilizado.
Semear com alça de repique no setor correspondente
Incubar a 37ºC por 48h e anotar os resultados. Contar o número de colônias, quando
possível.

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PRÁTICA 7- COLETA E OBSERVAÇÃO DE FUNGOS FILAMENTOSOS

Os fungos são seres vivos eucarióticos, com um só núcleo, como as leveduras, ou

multinucleados, como se observa entre os fungos filamentosos ou bolores. Os fungos
são ubíquos, encontrando-se no solo, na água, nos vegetais, em animais, no homem e
em detritos, em geral. O vento age como importante veiculo de dispersão de seus
propágulos e fragmentos de hifa.

Os fungos podem se desenvolver em meios de cultivo especiais formando colônias de

dois tipos: leveduriformes ou filamentosas.

As colônias leveduriformes são pastosas ou cremosas, formadas por microrganismos

unicelulares que cumprem as funções vegetativas e reprodutivas.

As colônias filamentosas podem ser algodonosas, aveludadas ou pulverulentas; são

constituídas fundamentalmente por elementos multicelulares em forma de tubo—as
hifas.

As hifas podem ser cenocíticas ou septadas. Possuem hifas septadas os fungos das
Divisões Ascomycota, Basidiomycota e Deuteromycota e hifas cenocíticas, os da
divisão Zygomycota.

Ao conjunto de hifas, dá-se o nome de micélio. O micélio que se desenvolve no interior

do substrato, funcionando também como elemento de sustentação e de absorção de
nutrientes, é chamado de micélio vegetativo.

O micélio que se projeta na superficie e cresce acima do meio de cultivo é o micélio

aéreo.
Quando o micélio aéreo se diferencia para sustentar os corpos de frutificação ou
propágulos, constitui o micélio reprodutivo.

Os propágulos ou órgãos de disseminação dos fungos são classificados, segundo sua

origem, em externos e intemos, sexuados e assexuados. Embora o micélio vegetativo
não tenha especificamente funções de reprodução, alguns fragmentos de hifa podem se

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desprender do micélio vegetativo e cumprir funções de propagação, uma vez que as
células fúngicas são autônomas.

Estes elementos são denominados de taloconídios e compreendem os:

- blastoconídios,

- artroconídios

- clamidoconídios.

Os blastoconídios, também denominados gêmulas, são comuns nas leveduras e se

derivam por brotamento da célula-mãe. As vezes, os blastoconídios permanecem
ligados à célula-mãe, formando cadeias, as pseudo-hifas, cujo conjunto é o
pseudomicélio.

Os artroconídios são formados por fragmentação das hifas em segmentos retangulares.

São encontratos nos fungos do gênero Geotrichum, em Coccidioides immitis e em
dermatófitos.

Os clamidoconídios têm função de resistência, semelhante a dos esporos bacterianos.

São células, geralmente arredondadas, de volume aumentado, com paredes duplas e
espessas, nas quis se concentra o citoplasma. Sua localização no micélio pode ser apical
ou intercalar. Formam-se em condições ambientais adversas, como escassez de
nutrientes, de água e temperaturas não favoráveis ao desenvolvimento fúngico.

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REPRODUÇÃO DOS FUNGOS

Os fungos se reproduzem em ciclos assexuais, sexuais e parassexuais.

Segundo Alexoupolos, a reprodução assexuada abrange quatro modalidades:

1) fragmentação de artroconídios;

2) fissão de células somáticas;

3) brotamento ou gemulação do blastoconídios-mãe;

4) produção de conídios.

Os conídios representam o modo mais comum de reprodução assexuada; são

produzidos pelas transformações do sistema vegetativo do próprio micélio. As células
que dão origem aos conídios são denominadas células conidiogênicas.

Os conídios podem ser hialinos ou pigmentados, esféricos, fusiformes,

cilíndricos, piriformes etc; ter parede lisa ou rugosa; serem formados de uma só célula
ou terem septos em um ou dois planos; apresentar-se isolados ou agrupados.

O conidióforo e a célula conidiogênica podem formar estruturas bem

diferenciadas, peculiares, o aparelho de frutificação, também denominado de conidiação
que permite a identificação de alguns fungos patogênicos.

No aparelho de conidiação tipo aspergilo, os conídios formam cadeias sobre

fiálides, estruturas em forma de garrafa, em torno de uma vesícula que é uma dilatação
na extremidade do conidióforo.

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Conídios de Aspergillus agrupados em forma de cabeça, ao redor de uma vesícula.

Nos penicílios falta a vesícula na extremidade dos conidióforos que se

ramificam dando a aparência de pincel.

Como no aspergilo, os conídios formam cadeias que se distribuem sobre as

fiálides.

Quando um fungo filamentoso forma coníios de tamanhos diferentes, o maior

será designado como macroconídio e o menor microconíidio

Fonte:
http://www.enq.ufsc.br/labs/probio/disc_eng_bioq/trabalhos_pos2003/const_microorg/f
ungos.

Roteiro
Material
- placa de petri contendo Agar Sabouraud
- Fita adesiva
-Azul de lactofenol
-Lâminas de vidro
- Microscópio óptico
-Luvas de procedimento

Procedimento.
Expor o meio de cultura em um local de escolha abrindo a placa de Petri por 5 minutos.
A placa deve então ser fechada e o meio incubado a temperatura de 28 graus Celcius por
uma semana.
Na semana seguinte, observar o crescimento das culturas fúngicas. Escolher uma
colônia que esteja bem definida e separada das outras, encostar a fita adesiva
delicadamente na superfície da colônia. Depositar uma gota de azul de lactofenol na
lâmina de vidro e colar a fita adesiva sobre esta gota. Observar ao microscópio em todas
as objetivas.

Desenhe as estruturas observadas, tanto macroscopicamente, quanto

microscopicamente. Tente identificar e descrever hifas, conídios e conidióforo, se
houver.

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