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Structure, function and evolution of stomata from a bryological perspective.

Abstract

Os estômatos são inovações fundamentais para a diversificação de plantas terrestres. Eles consistem em
duas células epidérmicas diferenciadas ou células de guarda e um poro entre isso leva a uma cavidade
interna. Musgos e Antóceros são os primeiros entre as plantas terrestres existentes a ter estômatos,
mas ao contrário de todas as outras plantas, os estômatos de briófitas estão localizados exclusivamente
no esporângio do esporófito. As hepáticas são o único grupo de plantas totalmente desprovidas de
estômatos. Estômatos em folhas e caules de traqueófitos estão envolvidos nas trocas gasosas e
transporte de água. A função dos estômatos nas briófitas é altamente debatida e difere da dos
traqueófitos pelo fato de terem sido implicados na secagem e deiscência do esporângio. Na última
década, os estudos anatômicos, fisiológicos, de desenvolvimento e moleculares forneceram novos
insights sobre a função dos estômatos nas briófitas. Nesta revisão, sintetizamos as contribuições desses
estudos e fornecemos novos dados sobre os estômatos das briófitas. Avaliamos o papel potencial dos
estômatos em histórias de vida de musgo e antóceros e identificamos áreas que fornecerão dados
valiosos para determinar a história evolutiva e a função dos estômatos em plantas terrestres.

Introduction

Embora a existência de estômatos nas primeiras plantas fósseis do Siluriano superior e a ocorrência
onipresente em traqueófitas identifique os estômatos como inovações importantes na evolução das
plantas, a escassez de estudos enfocando as briófitas limitou nossa compreensão da biologia estomática
e da evolução. Os estudos da última década começaram a abordar importantes questões de morfologia,
desenvolvimento e fisiologia, mas as questões centrais sobre a evolução e a função dos estômagos nas
primeiras plantas terrestres permanecem indefinidas. A ausência de estômatos em hepáticas e em
várias linhagens de musgos e antóceros confundiram as interpretações da mudança evolutiva em
estômatos em análises filogenéticas. Como inferido por Qiu et al. (2006) sugerem que as hepáticas são
irmãs das plantas terrestres remanescentes, estômatos originados após a divergência hepáticas com um
número de perdas subsequentes em musgos e antóceros. A evolução dos estômatos das briófitas é mais
complicada se os antóceros forem basais ou se as briófitas forem monofiléticas, como foi sugerido mais
recentemente por Wickett et al. (2014) e Cox et al. (2014). Claramente, a resolução da posição
filogenética dos musgos, antóceros e hepáticas, e se eles são monofiléticos ou parafiléticos, é
fundamental para estabelecer a origem e as modificações dos estômatos através da história evolutiva.

Este artigo explora as descobertas atuais relacionadas aos estomas únicos das briófitas e as
contribuições do estudo das briófitas para o conhecimento geral da estrutura, desenvolvimento e
função dos estômatos nas plantas. Identificamos os desafios específicos de estudar estômatos em
briófitas e apontamos para áreas de estudos futuras que são críticas na compreensão da evolução dos
estômatos com ou sem uma filogenia resolvida.

Stomata ocurrence in bryophytes

Os estômatos das briófitas estão localizados exclusivamente no esporófito. Tipicamente, nos musgos
eles são encontrados na base ou perto da base do esporângio (cápsula) e nos antóceros ao longo do
comprimento do esporófito, que é um esporângio em crescimento ancorado por um pé. Embora o
registro fóssil inicial demonstre a ocorrência de estômatos em esporângios em polysporangiates
(Edwards et al. 1998), as briófitas são as únicas embriófitas vivas com esta condição. As perdas de
estômatos são prontamente interpretadas a partir de hipóteses filogenéticas atuais tanto em antóceros
como em musgos (Renzaglia et. Al. 2017) A ocorrência de estômatos em Leiosporoceros, o táxon irmão
de outros antóceros, suporta plesiomorfia em antóceros, com duas perdas no altamente reduzido
gênero Notothylas e a linhagem mais derivada de Megaceros / Nothoceros / Dendroceros (Fig. 1)
(Renzaglia et al. 2008; 2017)

A imagem é menos clara em musgos onde os primeiros táxons divergentes como Takakia, Andreaea e
Andreaeobryum são totalmente desprovidos de estômatos, e a homologia de pseudostomata em
Sphagnopsida e estômatos e de musgos verdadeiros (Bryophytina) é controversa (Fig. 1) (Merced
2015b). Os estômatos são difundidos de Oedipodium em todos os musgos peristomados, mas estão
ausentes em táxons dispersos. Dentro dos musgos, os gêneros ou espécies sem estômatos são
intercalados entre os táxons com estômatos. Por exemplo, espécies de Dicranella, Dicranodontium,
Grimmia, Cryphaeae e Leucodon possuem estômatos, enquanto outros não possuem. Os estômatos
estão ausentes em Atrichum e Pogonatum enquanto outros gêneros das Polytrichaceae os possuem.
Parece não haver relação entre a ausência de estômatos e o tamanho da cápsula (Merced & Renzaglia
2013); condições de habitat podem influenciar o número, posição e distribuição dos estômatos nas
briófitas, mas não parecem ser responsáveis pela ausência de estômatos (Paton & Pearce 1957).

Na vista superficial, os estômatos das briófitas são semelhantes aos das traqueófitas e consistem em
células-guarda especializadas, com um poro entre elas que leva a uma cavidade subestomática. O
número de células-guarda normalmente é dois (Fig. 2ª, B, C), mas estômatos de 3-5 células são
frequentemente encontrados em musgos não relacionados ao desenvolvimento anormal (Paton &
Pearce 1957, Hedenas 2007, Field et al. 2015). As Funariaceae são caracterizadas por uma única célula
guarda binucleada (Fig. 2D, G), também documentada em espécies de Polytrichum, Polytrichastrum e
Buxbaumia (Paton & Pearce 1957). Este tipo de estoma resulta de uma citocinese incompleta, uma vez
que as paredes celulares não atingem as extremidades das células (Sack & Paolillo 1985). Os estômatos
podem estar no mesmo nível que as células epidérmicas (Fig. 2B, C, E), levemente aumentadas (Fig. 2ª)
significativamente aumentadas (Fig. 2H), levemente afundadas (Fig. 2k) ou afundadas (Fig. 2I, J) Os
poros em alguns musgos são redondos (Fig. 2D) ou alongados (Fig. 2G). Os distintivos pseudoestomas de
Sphagnum consistem em duas células que se separam parcialmente, mas não formam um poro ou
cavidade subestomática (Fig. 2K-M). Em células-guarda de antóceros são sempre dois, com um poro
alongado alinhado com o comprimento do esporófito e estômatos são levantados ligeiramente acima da
epiderme quando formado pela primeira vez (Fig. 2N) (Pressel et al. 2009). Estômatos assimétricos com
poros oblíquos ocorrem na proximidade da linha de sutura em antóceros e podem contribuir para a
deiscência do esporófito cilíndrico (Villarreal & Renzaglia 2015)

FIGURA 2. Diversidade de estômatos em briófitas (campo claro, fluorescência e microscopia confocal). A.


Pholia. B. Bartramia células-guarda com cloroplastos (laranja) em microscopia de fluorescência. C.
Pleurozium. D Imagem de fluorescência de Phycomitrella esporófito com estômatos. E. Hypnum. F.
Fissidens. G. Funaria. Estomatologia de H. Polytrichum em microscopia de fluorescência. H-I. Imagens de
fluorescência dos estômatos submersos de Orthotrichum no nível epidérmico (H) e no poro (I). K-L
Pseudoestômato de Sphagnum. M. Depth codificado 3D reconstrução da epiderme e córtex da cápsula
do Sphagnum, cor representa células no mesmo nível (o mesmo que L). N. Phaeoceros imagem confocal
de células-guarda com cloroplastos (roxo). Barras de escala = 20μm.

Stomata size, number and distribution

As células-guarda de muitas briófitas são do mesmo tamanho ou maiores que as células epidérmicas
(Fig. 2E, H, N), em contraste com as células-guarda menores, típicas das traqueófitas (Fig. 3). Na seção
transversal, os estômatos das briófitas variam em tamanho com células protetoras dos antóceros
consideravelmente maiores que as células epidérmicas (Fig. 3A) e aquelas de musgos menores que as
células circundantes (Fig. 3B). A variabilidade na seção transversal dos estômatos através das espécies
do modelo é evidente nos Anthoceros (Fig. 3ª), musgo Physcomitrella (Fig. 3B), Lycophyta Selaginella
(Fig. 3C) e Arabidopsis (Fig. 3D). Os estômatos da Arabidopsis são notavelmente pequenos em
comparação com as células vizinhas (Fig. 3D). O tamanho dos estômatos está positivamente
correlacionado com o tamanho do genoma nas angioespermas e negativamente correlacionado com a
densidade estomática, no entanto adaptações ao habitat podem afetar o tamanho das células-guarda
(Beaulieu et al. 2008, Jordan et al. 2015). A relação entre o tamanho da célula-guarda (incluindo o
tamanho dos poros) e a densidade dos estômatos nas traqueófitas é importante porque determina a
condutância difusiva do CO² e a eficiência da função das células-guarda (Frank & Beerling 2009). Não
existe correlação entre células de guarda e tamanho do genoma em Antóceros (Renzaglia et al. 2017),
mas essa relação ainda está para ser testada em musgos. A densidade, a abertura e o tamanho dos
estômatos de briófitas não respondem a diferenças na concentração de CO² ambiental (Baars &
Edwards 2008, Field et al. 2015) Medidas de densidade estomática são raramente usadas em briófitas,
porque as células-guarda não são uniformemente distribuídas e o tamanho da área onde os estômatos
estão localizados varia muito. Diferenças no número de estômatos dentro das espécies provavelmente
resultam de mudanças nas condições de crescimento (Paton & Pearce 1957, Erzberger 2003).

Através da filogenia das briófitas, o número de estômatos é mais provavelmente relacionado ao


tamanho, forma e elaboração do esporófito (Merced & Renzaglia 2013). Os experimentos de Baars &
Edwards (2008) e Field et al. (2015) sugerem que o número e o tamanho dos estômatos das briófitas
não são determinados por fatores ambientais e, portanto, não refletem a plasticidade evidente nos
traqueófitos para compensar as mudanças no CO² ambiental ao longo do tempo (Casson & Gray 2008,
Franks & Carsson 2014, Dow et al. 2014). No entanto, o espaçamento dos estômatos é regular em
musgos e antóceros (Fig. 2, 4ª), na medida em que normalmente segue a regra de “espaçamento de
uma célula” Na Funaria, menos de 4% dos estômatos se tocam (Merced & Renzaglia 2016). O
desenvolvimento de estômatos de briófitas é regulado por genes homólogos aos de angiospermas. Os
principais elementos reguladores SCREAM eSMF (SPEACHLESS, MUTE, FAMA), peptídeos de sinalização
e receptores de membrana (EPF, TMM, ERECTA) são conhecidos por estarem presentes e envolvidos no
desenvolvimento dos estômatos no musgo Physcomitrella (MacAlister & Bergmann 2011, Cain et al.
2016, Chater et al. 2016), Chater et al. 2017). Othologs destes genes foram recentemente identificados
no genoma de Anthoceros (Chater et al. 2017)

Observações microscópicas de outros musgos e antóceros também apontam para a separação regular
dos estômatos (Fig. 2)ig. 2H, 5I). A distribuição e padronização dos estômatos são geneticamente
controladas e necessárias para o funcionamento adequado e troca de gases ideais em traqueófitas (Dow
et al. 2014). Nossa hipótese é que o espaçamento dos estômatos nas briófitas não é tão crítico e
rigidamente regulado como nas angiospermas, como evidenciado por grupos e pares de estômatos em
muitas espécies. Em vez disso, separar os estômatos um do outro pode ser necessário para a formação
de poros e cavidades subestomatais em briófitas. (Merced & Renzaglia 2016). Nós postulamos que os
mecanismos de desenvolvimento para distribuir os estômatos em resposta ao ambiente foi um ajuste
fino nas traqueófitas com o advento das folhas.
FIGURA 4. Estômatos de antóceros. A, J, K. Antóceros adscendens. B, C, E, G, H, I, L. Phaeoceros
carolinianus. D, F, M. Leiosporoceros dussii. A seta em C indica o início da cavidade subestomática
abaixo das células de proteção antes da formação dos poros. J – K. Estômatos em colapso ou
colapsados. Barras de escala = 20 μm except A, K = 50 μm.

Sporophyte anatomy and stomatal development

Como nas traqueófitas, os estômatos nas briófitas se desenvolvem a partir de uma divisão simétrica de
uma célula-guarda mãe (GMC). As células-guarda mãe nos musgos se formam na fase de lança “spear
stage” antes da expansão da cápsula (Garner & Paolillo 1973 a,b Paton & Pearce 1957) and GMC’s são
organizadas em “files” arquivos (Merced & Renzaglia 2016). A divisão das GMC’s para formar células-
guarda e a separação das paredes ventrais para abrir o poro ocorre durante a expansão da cápsula
quando o esporângio começa a se diferenciar. Nos antóceros, as GMC’s são encontradas abaixo do
invólucro e se dividem para formar as duas células-guarda antes de emergir desse tecido protetor;
acima do invólucro as células-guardas separam a abertura do poro. (Pressel et al. 2014, Renzaglia et al.
2017). As células-guardas mãe podem ser distinguidas por serem maiores, arredondadas, levemente
elevadas sobre a epiderme e com mais cloroplastos ou cloroplastos maiores em antóceros em
comparação com as células epidérmicas circundantes.
Os estômatos desenvolvem-se completamente antes dos esporos em musgos e antóceros (Fig, 4, 5A)
(Merced & Renzaglia 2016, Renzaglia et al. 2017). As cavidades subestomatais estão sempre associadas
a estômatos em antóceros e musgos; o poro se abre para um rede de espaços no tecido fotossintético
subjacente (Fig. 3A-B, 4D, L, M, 5A, I, J) (Paton e Pearce 1957, Merced e Renzaglia 2013, 2016, Pressel et
al. 2014). Os espaços internos “schizogenous” esquizogênicos enchem-se de fluido quando o primeiro se
formam e secam as aberturas dos poros estomatais. O espaço pode aumentar pela quebra das células
dentro das câmaras cheias de ar (Merced & Renzaglia 2016, Renzaglia et al. 2017). O fluido pode
preencher as cavidades durante o desenvolvimento dos esporos (Fig. 3B). Cápsulas de briófitas sem
estômatos são desprovidas de tecido esponjoso e têm uma apófise reduzida à ausente em musgos
(Merced 2015a, Chater et al. 2016)

The peculiar stomata of hornworts

Dado que eles ocorrem em um esporângio alongado, não é de se surpreender que estômatos de
antóceros exibam um conjunto de características não relatadas anteriormente em outras plantas
existentes (Renzaglia et al. 2017). Os estômatos são grandes e irregularmente espalhados ao longo do
comprimento do esporófito (Fig. 4A, K). Os estômatos originam-se dentro dos limentes do invólucro
através de uma divisão simétrica em uma epiderme inicial (figo. 4B, C). As células-guarda jovens são
cercadas por paredes finais e são mais largas do que as células epidérmicas circundantes (Fig. 4A, C). A
formação da cavidade subestomatal começa na região mais interna, onda as células-guarda se
encontram e se expandem progressivamente de maneira esquizogênica (Fig. 4C, D). Tipicamente, os
estômatos são solitários e distribuídos uniformemente ao longo do esporófito, mas ocasionalmente
estômatos lado a lado são produzidos (Fig. 4E, F). Uma divisão diagonal produz células-guarda
assimétricas em estômatos perto da sutura esporofítica (Fig. 4G).

À medica que a cavidade subestomática se se expande, as células guarda desenvolvem um


espessamento diferencial das paredes formando uma proeminente borda externa que circunda o poro,
uma parede interna espessada e paredes ventrais, externa e dorsal finas. (Fig. 4D, F, I). As células
protetoras cobrem as cavidades internas que elvam a um sistema de espaços no tecido assimilativo que
é inicialmente preenchido com fluido e seca onde os poros estomáticos se abrem (Pressel et al. 2014,
Renzaglia et al. 2017). Este fluido não marca com epitopos de pectina e, portanto, não pode ser
identificado como mucilagem. A característica mais peculiar dos estômatos das trompas é que, depois
de desenvolverem espessamentos nas paredes, elas morrem e colapsam (Fig. 4H-M). Isso ocorre em
regiões do esporófito, onde os esporos se diferenciam, mas não amadurecem. Após o colapso das
células-guarda, o tecido esponjoso de assimilação facilita a aquisição de CO², como evidenciado pelos
cloroplastos proeminentes adjacentes aos espaços intercelulares. O tecido esporogênico é circundado
por mucilagem contendo pectina que persiste ao longo do comprimento do esporófito até a região de
deiscência. Os esporos circundantes da mucilagem secam progressivamente após o colapso dos
estômatos. Este processo precede a deiscência do esporófito e é necessário que os esporos se separem
e se dispersem. Os espaçamentos da parede da célula de proteção garantem que os estômatos
mantenham uma área de superfície externa aumentada, bem como permaneçam sobre o espaço
subestomático (Fig. 4L, M).

Sunken stomata of Orthotrichum

A posição, a forma e o número de estômatos têm sido usados como caracteres taxonômicos em musgos
(Erzberger 2003, Hedenas 1989). Em Orthotrichum, as espécies com estômatos imersos (sunken) e
estômatos superficiais eram tradicionalmente colocados em dois subgêneros diferentes. No entanto, a
classificação molecular mais recente sugere que os seis subgêneros com estômatos submersos
evoluíram de forma independente três vezes (Sawicki et al. 2012). A posição dos estômatos em espécies
Holartic de Orthotrichum correlaciona-se ao cariótipo em que espécies com o número cromossômico de
6 possuem estômatos superficiais e quase todas as espécies com 11 cromossomos possuem estomas
afundados (Vitt 1971). Fatores que influenciam a posição dos estômatos ainda precisam ser
investigados; È incerto se o nível dos estômatos na epiderme se correlaciona com as condições
ambientais durante o desenvolvimento ou se o número de cromossomos ou o tamanho do genoma são
fatores contribuintes.

Cápsulas verdes expandidas de Orthotrichum pusillum são cercadas por uma caliptra plicada, e os
estômatos se desenvolvem e amadurecem completamente antes da esporogênese, enquanto o
esporófito ainda é coberto pela caliptra (Fig. 5A). A anatomia esporofítica e a ultraestrutura das cápsulas
dos estômatos desenvolvidas de Orthotrichum são similares a outros musgos com poros abertos que
conectam o ambiente externo à rede interna de espaços aéreos adjacentes a células com cloroplastos
grande e abundante, sugerindo um papel na aquisição de CO² e transpiração de água (Merced &
Renzaglia, 2013) (Fig. 5A). Os estômatos submersos de Orthotrichum estão posicionados abaixo da
epiderme as cápsulas (Fig. 5A , B) , com células epidérmicas circundantes que se projetam sobre as
células protetoras (Fig. 2I, J, 5A-G). Essas “células subsidiáras” são de forma e tamanho diferentes de
outras células epidérmicas (Fig. 5B, C, G), e um material espesso-elétron-brilhante preenche a parede
celular onde se projetam acima das células protetoras (Fig. 5G). As paredes da células-guarda são mais
espessas, onde as paredes externa e interna se encontram com as paredes ventrais (Fig. 5E), e as
paredes externas são mais grossas em sua extremidade polar (Fig. 5D). Um grande vacúolo ocupa a
maior parte do citoplasma, descolando o cloroplasto para a borda da célula-guarda (Fig 5D, E, F).
Numerosas pequenas gotículas de óleo cobrem o interior das paredes (Fig. 5F, H) e são mais abundantes
na extremidade polar em comparação com a região dos poros (Fig. 5D, E). A associação de células-
guarda, células epidérmicas circundantes e córtex esponjoso neste minúsculo musgo são paralela ao
complexo estomático de traqueófitas.
FIGURE 5. Anatomy of moss capsules and stomata structure. A–H Orthotrichum pusillum. I. Polytrichum
ohioense. J. Hypnum curvifolium. K–M Stoma in brown open capsules of Funaria flavicans. A = 35 μm; B–
C, I–J = 20 μm; D–G = 2 μm; H, M, N = 500nm; K, L=2μm

Pore obstruction and fluid in spaces

Uma condição peculiar do envelhecimento dos estômatos de briófitas é que os poros são
frequentemente obstruídos com material semelhante a cera (Fig. 5K, L, M) (Paton & Pearce 1957,
Merced & Renzaglia 2013). Poros obstruídos podem ser encontrados perto de poros abertos em
antóceros (Fig. 4A) e em cápsulas maduras de musgos (Fig. 2C, F). O líquido frequentemente preenche
as cavidades e os espaços intercelulares quando os poros estão entupidos, como é visto na Figura 3B em
uma cápsula de Physcomitrella com esporos quase maduros. Poros obstruídos são comuns em coníferas
e às vezes são encontrados em angiospermas, embora os “plugs” de cera reduzam a condutância
máxima dos estômatos que eles funcionam na redução da transpiração e entrada de patógenos
(Brodribb & Hill 1997). O envolvimento dos estômatos nas trocas gasosas sob esta condição é altamente
suspeito porque a cápsula não possui espaços intercelulares cheios de ar após a diferenciação dos
esporos. É possível que líquidos em espaços intercelulares dentro de uma espécie como Phycomitrella
seja variável, ou mesmo induzida ambientalmente, como nem sempre é evidente em secções de
cápsulas. Alternativamente a falta de fluido pode ser um artefato de fixação. A ocorrência e o papel do
fluido em espaços relacionados à obstrução dos poros precisam ser investigados.

Function and physiology of bryophyte stomata

Muitos aspectos da anatomia e ultraestrutura dos estômatos de briófitas sustentam seu papel nas
trocas gasosas (aquisição de CO², liberação de O² e perda de água), mas poucos estudos analisaram a
abertura e o fechamento de estômatos em musgos e antóceros. Paton e Pearce (1957) realizaram
experimentos com vários musgos e antóceros em várias condições ambientais (escuridão / luz , CO² e
umidade) e concluíram que estômatos de briófitas não respondiam a estímulos externos, mas sim
fechavam quando o conteúdo de água da cápsula diminuía. Garner e Paolillo (1973a) mostraram que os
estômatos da Funaria hygrometrica se fecharam em resposta a escuridão e reabriram quando expostos
à luz branca e que os estômatos abertos tratados com ácido abscísico (ABA) se fecharam. Esta resposta
foi limitada a apenas alguns dias após a expansão da cápsula quando o esporófito é quase auto
suficiente em termos de fixação de carbono. (Paolillo & Bazzaz 1968, Proctor 1977). Mais recentemente,
Chater et al. (2011) relataram uma resposta de fechamento de estômatos de musgos ao ABA, elevada
concentração de CO² e escuridão em esporófitos expansivos de Physcomitrella e Funaria.

Portanto, poucas briófitas têm sido estudadas e é difícil extrapolar quaisquer estudos fisiológicos para
outros táxons com estômatos. Além disso, é difícil determinar se as respostas observadas se devem ao
movimento passivo de água ou ao controle hormonal ativo. Vários estudos apontam para o fechamento
passivo de estômatos em resposta ao baixo nível de água em licófitas e samambaias sem envolvimentos
de ABA (Brodribb & McAdam 2011 et al. 2016). Concentrações mais altas de ABA em hepáticas e
antóceros estão associadas a condições secas sugerindo que o fechamento estomático pode ser uma
resposta geral ao estresse (Hartung et al. 1987) Os elementos reguladores da resposta ABA em
estômatos de angiospermas são expressos e regulados na expansão de esporófitos verdes de
Physcomitrella (O’Donoghue et al. 2013). O ensaio da complementação cruzada de Phycosmitrella OPEN
STOMATA 1 (PpOST1) em mutantes Arabidopsis ost1 recuperou a resposta dos estômatos ao ABA
(Chater et al. 2011). O fechamento dos estômatos em resposta ao ABA envolve a ativação do canal
aniônico SLAC1 por OST1 e embora os genes que codificam esses elementos estejam presentas na alga
verde Klebsormidium, na hepática Marchantia e no musgo Physcomitrella, somente em Physcomitrella
ambos os elementos, PpOST1 e PpSLAC1, formam um complexo funcional que ativa o canal aniônico
similar às angiospermas (Lind et al. 2015). Esses componentes da resposta de estresse hídrico
dependente do ABA se originaram antes da diversificação das embriófitas, mas ainda é controverso
quando o uso dessa rede regulação gênica foi empregada para a função dos estômatos (Chater et al.
2013, Lind et al. 2015, McAdam et al. 2016).

A compreensão atual da fisiologia dos estômatos é baseada em traqueófitas, tornando problemático


extrapolar esses conceitos e processos para explicar a fisiologia das briófitas. Os efeitos do ambiente
(por exemplo, gravidade, tensão da superfície da água, correntes de ar) na fisiologia das briófitas e
traqueófitas podem ser fundamentalmente diferentes devido à escala e diferenças relacionadas
(Proctor 2009). Em particular, o fechamento ativo e a abertura dos estômatos podem ser difíceis de
entender já que os estômatos se desenvolvem e geralmente se abrem em musgos sob a cobertura de
uma caliptra que udke et al. 2013, Budke & Goffinet 2016). Nos antóceros, os estômatos se
desenvolvem dentro do invólucro, abrem-se acima dele e entra em colapso (Renzaglia et al. 2017). Esse
padrão de desenvolvimento deixa uma pequena janela para a possibilidade de movimento ativo de
células-guarda; se for esse o caso, acontecerá na região mais jovem, próxima à base do esporófito, que
não está exposta a uma secagem severa. A ausência de respostas a sugestões ambientais de ABA,
juntamente com a arquitetura única e o destino dos estômatos nas trompas é consistente com a
incapacidade desses estômatos para abrir e fechar. A falta de pectinas contendo arabinano nas paredes
das células protetoras dos antóceros sustenta esta conclusão, já que este tipo de pectina está presente
em células jovens de musgos que são relatadas como capazes de se moverem e é essencial para
movimentos ativos de estômatos de plantas com flores (Merced & Renzaglia 2014, Renzaglia et al.
2017).

Alternative functions os stomata in bryophytes

Características anatômicas semelhantes entre a maioria das briófitas e traqueófitas apoiam o papel das
trocas gasosas pelos estômatos em ambos os grupos. Estômatos de musgos e antóceros levam a
cavidades que se conectam ao tecido aerênquima com cloroplastos muito parecidos com o mesofilo
foliar (Merced & Renzaglia 2013, 2016, Renzaglia et al. 2017). O tecido condutor de água está presente
na cerda da maioria dos musgos (Hébant 1977), apoiando um possível papel na transpiração, na
hidratação da cápsula e até mesmo em restauração de fluido em espaços intercelulares (Haig 2013). No
entanto, não está clara qual a contribuição dos estômatos para a aquisição de CO² para a fotossíntese
do esporófito e tem sido argumentando que a troca gasosa não é o principal papel dos estômatos nas
briófitas (Pressel et al. 2014, Field et al. 2016). “Plugues” cuticulares que obstruem poros e estômatos
maduros podem ser um meio de fechar os poros em vez do movimento da célula-guarda (Fig. 5K, L). A
existência de líquido nos espaços intercelulares e nos poros ocluídos é contra intuitiva a um papel nas
trocas gasosas, mas pode indicar que os estômatos estão envolvidos no movimento de água,
transpiração e secagem do esporófito.

A hipóteses de que os estômatos evoluíram para facilitar a secagem do esporófito e o movimento ativo
por meio de gatilhos hormonais e osmóticos, desenvolvidos posteriormente com folhas, assume que os
estômatos das briófitas mantiveram a função ancestral (Ligrone et al 2012a, Haig 2013). A arquitetura
da parede da célula-guarda facilita a desidratação, alterações na forma e deiscência da cápsula,
suportando uma função comum dos estômatos de musgos e antóceros (Ligrone et al. 2012b, Merced &
Renzaglia 2013; Chater et al. 2016, Renzaglia et al. 2017). Chater et al. (2016) demonstraram que a
perda de estômatos em musgos pode ser realizada em uma etapa, eliminando qualquer um dos fatores
de transcrição que iniciam a diferenciação dos estômatos (SMF ou SRCM) e sem maiores consequências
ao desenvolvimento e anatomia dos esporófitos, exceto que a deiscência da cápsula é atrasada. Estes
resultados suportam um papel dos estômatos de musgo na secagem e deiscência da cápsula.

Pseudoestomata of Sphagnum

A ausência de estômatos verdadeiros em musgos divergentes complica a interpretação de uma única


origem de estômatos em plantas terrestres (Fig. 1). Pseudoestômatos em Sphagnopsida pode fornecer
algumas pistas raras para este problema evolutivo, mas não explica a ausência de estômatos em
Takakia, Andreaobryum e Andreaea. Era sabido desde o estudo de Schimper, em 1858, que o Sphagnum
tinha estruturas semelhantes a estômatos que não formam um poro aberto. O desenvolvimento e a
ultraestrutura do pseudoestoma foram descritos por Bouldier (1988), que os considerou como células
epidérmicas reduzidas, sem nenhuma das características estruturais das células-guarda. Duckett et al.
(2009) descreveram que durante a dessecação da cápsula, os Pseudoestômatos são as primeiras células
a secar até colapsar e se separarem parcialmente, mas nunca abrem internamente; Eles propuseram
que os Pseudoestômatos estão envolvidos na mudança da forma da cápsula e na descarga explosiva de
esporos. A ultraestrutura de Pseudoestômatos mostra semelhanças com jovem estômatos de outras
briófitas, incluindo separação de células pseudoestômatais por deposição de cutícula, camadas de
paredes após a iniciação “poros” e paredes ricas e pectinas (Merced 2015b). Merced (2015b) propôs
que Pseudoestômatos são estômatos modificados que suprimiam a formação de cavidades
subestomáticas, que por sua vez interrompiam o desenvolvimento dos poros. Cápsulas de Sphagnopsida
são operadas, mas faltam perístomas. A maioria tem pseudoestômatos espalhados pelo meio da
cápsula, mas Ambuchanania, o táxon irmão de Sphagnum, tem numerosos pseudoestômatos na metade
inferior da cápsula (Yamaguchi et al. 1990). Remanescentes de estômatos em musgos verdadeiros que
também são operculados, esta restrição à região da cápsula inferior poderia ser interpretada como
plesiomórfica em musgos. Uma pesquisa do genoma de Sphagnum não pôde identificar claramente os
genes relacionados com estômatos (Chater et al. 2017). A “clarificação” da homologia de
pseudoestômatos e estômatos de briófitas podem requerer estudos “transcriptomic” integrados com
dados fisiológicos e estruturais. Desenvolvimento semelhante de fatos sobre a morte prematura e
colapso em estômatos e pseudoestômatos de Sphagnopsida são intrigantes semelhanças que devem ser
consideraras quando se avalia a homologia das células-guarda em outras briófitas.

Evolution of stomata

Com uma nova hipotese filogenetica que coloca os antoceros como grupo irmao de outras plantas
terrestres (Wickett et al. 2014), uma reiterpreta;'ao da evolucao dos estomatos e justificada. A ausencia
de estomatos nas hepaticas e consistente com a completa maturacao dos esporofitos e esporos de
hepaticas dentro de estruturas protetoras (Crandall-Stortler et al. 2008). Se hepatica sao irmas de
musgos, ou na ausencia de estomatos em hepaticas e valvas em musgos e plesiomorfica e estomatos
apareceram pela primeira vez em musgos verdaddeiros, ou estomatos foram perdidos de forma
independente em linhagens primitivas. Perda de estomatos e comum em bripofitas e, portanto, a ultima
interpretacao e plausivel. A ausencia de estomatos nos musgos de valvas Takakia, Andreaea e
Andreaeobryum e curiosa e sugere que os estomatos evoluiram em musgos com capsulas operculadas.
Semelhante a Sphagnum , Andreaea nao tem uma seta e capsulas e desenvolvem antes de ser
levantado por um pseudopodium, no entanto, a relacao entre estas condicoes e estomatos nao e clara.

Para avaliar a evolu;'ao dos estomatos, devemos dar um passo atras no tempo e considerar a evolucao
da organografia da primeiraa planta terrestre. os primeiros fosseis com estomatos eram de rochas com
poucos mais de 400 milhoes de anos. esta plantas consistitam em eixos ramificados com esporangios
terminais. Folhas planares nao existiam e nao evoluiram ate que os niveis de CO2 caissem cerca de 30
milhoes de anos depois (Beerling et al. 2001). Em sua morfologia, essas primeiras plantas se
assemelham a esporofitos de briofitas que tambem nao possuem folhas e possuem esporangios
terminais. Notavelmente, os estomatos nestes fosseis tardios silurianos primitivos do Devoniano
possuem celulas guarda colapsadas e c[elulas epid[ermicas alongadas semelhantes as dos antoceros
(Renzaglia et al. 2017). Nossa hipotese e que estaomatos em machados sem folhas sao submetidos a
diferentes restricoes fisiologicas e de desenvolvimento em relacao as folhas planas.

Dois modelos concorrentes para a evolucao dos estomatos ainda estao em debate, 1) o modelo de
passo unico propoe que os estomatos nas primeiras plantas terrestres evoluiram com um reposta ABA e
movimento ativo, e 2) o modelo g radualista que propoe o movimento dos estomatos originou-se como
um simples mecanismos passivo em resposta ao conteudo de agua (Sussmilch et al. 2017). As briofitas,
como irmas do restante das plantas terrestres, sao essenciais para elucidar esse problema, mas sao
necessarios mais estudos por causa de evidencias conflitantes que apoiam amas as hipoteses. Parece
improvavel que estomatos em esporanagios, como os das briofitas, sejam responsivos a estimulos
ambientais, da mesma forma que e documentado em folhas vegetativas de angiospermas. Os
esporangios de briofitas nunca sao muito alongados nem persistem alem de uma estacao de
crescimento. Mecanismos passivos de fechamento provavelmente evoluiram primeiro, pois os
esporofitos aumentavam de estatura atraves da diferenciacao embrionaria e da evolucao dos
meristemas apicais (Ligrone et al. 2012a,b) Mecanismos fisiologicos complexos que regulam um
conjunto de respostas a estimulos ambientais sazonais e diunos nao seriam associados aos esporifitos
das briofitas, mas sao criticos para a evolucao do traqueofito.

Pode-se esperar que os genes envolvidos na aquisi;'ao da fisiologia estomatica passem por mudancas
progressivas com a co-opcao dos genes iniciais para papeis regulatorios mais complexos, a medida que
as folhas se diversificam. Os genes de espacamento estomatico e aqueles que regulam o ABA sao
encontrados entre as plantas e sao mais criticos no espacamento e na reguacao dos estomatos nas
angiospermas, onde a transpiracao deve ser coordenada com precisao com a aquisicao de carbono. A
tendencia de celulas guarda pequenas de angiospermas para responder rapidamente ao ambiente nao
pertence aos antoceros, foram tamanhos de genoma nao estao correlacionados com tamanhos das
celulas guarda, isso ainda tem que ser testado em musgos (Renzaglia et al. 2017). A diferenciacao de
celulas guarda em briofitas envolve a producao de paredes diferencialmente espessadas apos a abertura
dos poros. Mudancas na ontogenia da parede celular protetora foram necessarias para o movimento
estomatico, uma vez que modificacoes dos constituintes da parede pectinacea foram integradas para
flexibilidade e resiliencia da parede (Merced & Renzaglia 2014).

Devemos considerar que é possível que os estômatos em musgos, antóceros e traquófitas sejam
homoplasias. A evolução independente ou re-evolução de uma estrturua foi documentada em outroas
organismos (Colling & Miglietta 2008). Para estômatos, esse cenário parece improvável devido a
semelhanças no desenvolvimento, na arquitetura das células guarda, na anatomia do tecido circundante
e nos genes relacionados aos estômatos compartilhados (Chater et al. 2017). Se os estômatos são
homólogos, existe também a possibilidade de que aqueles nas briófitas sejam altamente derivados e
tenha perdido as funções fisiológicas atribuídas aos estômatos das traqueófitas. Alterações similares
foram demonstradas em estômatos de órgãos florais altamente modificados e que não respondem a
estímulos ambientais. Este cenário também parece insustentável quando a condição das primeiras
plantas fósseis é considerada, isto é, esporângios e a falta de folhas nestes fósseis são características
ancestrais que são partilhadas com as briófitas. Atualmente, vemos a preponderância de dados que
sustentam uma única origem dos estômatos nas primeiras plantas terrestres com bioquímica fisiológica
mais sofisticada, evoluindo à medica que as traqueófitas se diversificam.

Conclusions

A ocorrência generalizada de estômatos em todos os grupos de plantas, exceto as hepáticas e sua


ocorrência nas primeiras plantas fósseis, identificam os estômatos como uma inovação chave que
apoiou a diversificação precoce das plantas em terra. No entanto, nosso conhecimento do
desenvolvimento e fisiologia dos estômatos em plantas sem sementes permanece escasso. Mesmo com
o papel essencial que as briófitas assumem na evolução dos estômatos, a estrutura, o desenvolvimento
e a função dos estômatos nos musgos e nos antóceros só foram examinados nos anos mais recentes.
Estudos utilizando o musgo modelo Physcomitrella são desafiadores e podem não refletir a realidade da
grande maioira dos musgos devido à sua reduzida cápsula clestocárpica, com poucos estômatos,
pequenas aberturas e espaços intercelulares poco desenvolvidos. Estudos fisiológicos e genéticos
precisam ser replicados em musgos adicionais e antóceros que representam toda a gama de diversidade
na complexidade esporagial e estomática. Perguntas importantes continuam sem respostas, como:

1) Até que ponto os estômatos são essenciais para o desenvolvimento do esporófito (nas
escpécies que os possuem) e como os estômatos melhoram a aptidão dos esporófitos?
2) As pressões ambientais têm efeito na posição e densidade dos estômatos nas briófitas?
3) O que explica a ausência de estômatos em várias linhagens, ou seja, estão os mesmos genes
envolvidos com a perda de estômatos através dos táxons?
4) Existem características anatômicas nas briófitas com estômatos que estão ausentes em táxons
sem estômatos?
5) Existem características relacionadas ao desenvolvimento de esporófitos que são exclusivas dos
musgos com estômatos?
6) O tamanho das células guarda e o tamanho do genoma estão correlacionados em musgos?

Quanto à anatomia e morfologia, há pouca informação sobre a anatomia da cápsula, cerdas e


placenta em musgos, características que podem mostrar correlações com o número, posiçõa e
função dos estômatos. Da mesma forma, a complexidade da condução do tecido e a associação
desse tecido com tecido esponjoso e estômatos não estão bem caracterizadas. Não está claro se
existe uma relação entre o número de estômatos, a taxa de desenvolvimento da cápsula e a
longevidade dos esporos. Se os estomatos funcionarem na secagem da cápsula, conclui-se que as
cápsulas sem estômatos se abrirão mais lentamente e serão mais duradouras do que aquelas com
estômatos. Modelos excelentes para abordar características morfológicas em relação à localização,
estrutura e número dos estômatos são o Orthotrichum, com diversas posições e condições de
estômatos, e gêneros nos Polytrichales com e sem estômatos. Embora ainda haja muito a
investigar, estudos recentes sobre os estômatos das briófitas forneceram uma perspectiva mais
abrangente sobre os estômatos. Minimamente, esses estudos levantaram preocupações sobre a
generalização da função estomática através das plantas, e apontaram para a importância das
briófitas no entendimento da biologia estomática e da evolução. Com a disponibilidade iminente de
genomas e transcriptomas de musgos e antóceros, o controle genético do desenvolvimento e a
evolução dos genes estomatais podem ser examinados mais detalhadamente. Por enquanto,
estudos de estômatos de briófitas estão mudando nossa perspectiva sobre a evolução dessas
minúsculas entidades celulares que eram tão importantes para a diversificação e sobrevivência das
plantas terrestres.