Práctica N° 6

Preparación de medios de cultivos

La supervivencia y crecimiento de microorganismos dependen de los nutrientes

disponibles y de un ambiente de crecimiento favorable. En el laboratorio, las
preparaciones nutrientes que se usa para el cultivo de los microorganismos son
denominados medios (singular, medio). Los medios de cultivo, se emplean en tres
distintas formas físicas:

a. Medios líquidos, o caldo.

b. Medios semisólidos.
c. Medios sólidos.

La diferencia mayor entre estos medios es que los medios sólidos y semisólidos
contienen un agente solidificante (normalmente agar), mientas que un medio
líquido no. Los medios líquidos (caldo nutritivo, caldo soja tripticasa, caldo infusión
cerebro-corazón), pueden ser usados para propagar grandes números de
microorganismos para estudios de fermentación y demás pruebas bioquímicas. Los
medios semisólidos también pueden usarse en estudios de fermentación, en la
determinación de la motilidad bacteriana, y la promoción del crecimiento anaerobio.
Los medios sólidos (agar nutritivo o agar sangre) se emplean para observar la
apariencia de la colonia de los microorganismos en crecimiento sobre la superficie,
para aislar cultivos puros, para almacenar cultivos, y para observar reacciones
bioquímicas específicas.

Mientras se encuentran en estado licuado, los medios sólidos pueden ser vertidos
tanto en tubos de ensayo o en placas de Petri. Si el medio contenido en el tubo se
deja solidificar en posición sesgada, el tubo se designa agar inclinado; en cambio si
se deja solidificar posición derecha, el tubo se designa agar profundo; y si el agar se
vierte en un plato del Petri, se designa agar en placa.
 Medios de cultivos

Leche, sangre, suero, ascítico,

Naturales
bilis.
Líquidos (caldo) De procedencia animal
Caldo nutritivo, agua
Artificiales
peptonada.

Comunes Vegetales Papa, zanahoria.

Solidificados Agar o gelosa nutritiva

Sólidos
Constituidos por albuminas Suero coagulado, huevo coagulado, medio
coaguladas por calor de Lowenstein- Jensen

Caldo glucosado, caldo glicerinado, caldo

Líquidos (caldo) sangre, caldo extracto globular, caldo suero,
caldo liquido ascítico
Enriquecidos
Agar glicerinado, agar sangre-extracto
Sólidos
globular. Agar suero, agar liquido ascítico

Electivos Líquidos (caldo) Caldo Todd Hewitt

Agar SS, medio de Wilson-Blair, Medio Mac Conkey, medio de Thayer
Selectivos Martín, medio de Bilis-Agar-Feo, medio de Chapman-Stone, Agar sal-
manitol.

Especiales Agua peptonada-carbohidratos-indicador,

Líquidos (caldo)
medio uter-indol.
Diferenciadores
Sólidos Medio manitol-movilidad, medio Kliger,
gelatina, agar blanco.

Medio de Pike, caldo tetrationato, agua peptonada alcalina, Medio Muller

De enriquecimiento
Kauffman.

Químicos o Sintéticos Medio de Sauton, medio de Koser

De conservación y
Suero fisiológico glicerinado tamponado, medio de Stuart.
transporte

Preparación de los medios de cultivo

La preparación de medios de crecimiento comerciales deshidratado es simple y

directa. Cada empaque de medio de crecimiento deshidratado tiene las
instrucciones para su preparación en la etiqueta. Por ejemplo, para preparar un litro
de caldo de soja tripticasa, se suspenden 30 g del medio deshidratado en 1,000 ml
de agua destilada, se mezcla bien, se distribuye y se esteriliza durante 15 a 20
minutos a 121°C . Las instrucciones caloríficas se dan específicamente para cada
tipo de medio.

Rehidratación. El procedimiento empleado para disolver los medio de cultivo

deshidratados, determina frecuentemente la nitidez y redimiendo del producto final.
Es esencial Obtener la homogeneidad y cuidar que la exposición al calor sea
mínima. A continuación se indica una serie de sugerencias con la finalidad de
obtener resultados más efectivos.

1. La cantidad necesaria del material en polvo se agrega la mitad del

volumen total de agua, después de mezclar totalmente, se agrega el
resto de agua, teniendo cuidado de que lave las paredes del recipiente y
entonces se agita el contenido.
2. Los medio de cultivos que contienen agar, se dejan en reposo, a
temperatura ambiente, de 10 a 15 minutos para que pueda absorberse
bien el agar.
3. Cuando sea necesario aplicar calor, el método preferible es por
calentamiento directo. Se aplica el calor suavemente y se agita la
preparación, con mayor o menor frecuencia, para evitar que se queme.
Mantenga la boca del reciente tapado con papel aluminio para evitar la
evaporación.
4. Para obtener la solución, hierva lo más brevemente que sea posible en
general, 1-2 min es suficiente.
5. Deje enfriar a 60 o 70º C antes de su distribución en los envases
finales. El manejo del agar hirviendo es muy peligroso, éste puede
romper fácilmente el vidrio al llegar a una condensación excesiva,
mézclelo bien antes de distribuirlo.
6. En los envases con tapón de rosca, dejar la tapa sin ajustar, por lo
menos media vuelta, para permitir un adecuado ajuste de las presiones
 durante el tratamiento por calor, y cerrarlas herméticamente después de
terminada su esterilización.
7. Los envases deben estar libres de materiales alcalinos, a fin de impedir
posibles variaciones de pH del contenido. El medio de esterilización no
debe ser sacado mientras está caliente, ya que un cambio en la presión
de vapor en el interior de los envases puede dar lugar a ebulliciones
explosivas. Enfrie a 70–80º C antes de abrir el autoclave (15 min).
8. Cuando las instrucciones indiquen la adición de un reactivo estéril al
medio después del autoclavado, esta maniobra deben ser llevada a
cabo con esmerada asepsia teniendo gran cuidado de observar las
condiciones reseñadas para la temperatura.

Objetivo de la práctica:

 Familiarizar al estudiante con la preparación de los medios de cultivo y

azúcares empleados para el crecimiento de los microorganismos.
 Preparar los medios de cultivo que serán usados en las prácticas
posteriores.

Materiales

 Caja de Petri
 Tubos de ensayo
 Agua destilada
 Pipetas
 Medios de cultivos y azúcares.
 Gradilla
 Espátula
 Cilindro graduado
 Mecheros
 Algodón
 Papel de aluminio
Metodología:
1. Preparación de azucares. Se preparan a razón de 1% teniendo como
medio de enriquecimiento el caldo nutritivo, para esta preparación se
toma en cuenta la cantidad de ml a preparar ya que el caldo nutritivo
se utiliza a razón de 8 gr./ 1000 ml y de c/ azúcar 10 gr. / 1000 ml,
después se procede a colocar tanto el azúcar como el caldo nutritivo
en un Erlen-Meyer y se le agrega la cantidad de agua correspondiente
a la cantidad pesada de azúcar y de caldo. Después de haber realizado
lo antes expuesto se le añade gotas a gota el indicador de pH
(Bromocresol púrpura) hasta obtener un morado tenue. Por ejemplo se
desea preparar 100 ml de azúcar glucosa se procederá de la
siguiente manera: Calculando con una regla de tres se obtendrá los
gr. de caldo y azúcar a pesar

Caldo Nutritivo 8 gr. ----------------- 1000 ml

X ----------------- 1000 ml

X = 0,8 gr. De Caldo Nutritivo

Azúcar Glucosa 10 gr. ----------------- 1000 ml

X ----------------- 1000 ml

X = 1 gr. De Glucosa
Una vez preparado el azúcar se pasa a tubos de ensayo a razón de 9
ml por cada tubo, esto se tapan con algodón y se cubre con papel
aluminio y se esterilizan en autoclave durante 15 min a 121 ºC y 1
atmósfera de presión.

2. Medios sólidos y semi-sólidos. Estos medios se preparan de acuerdo a

las instrucciones indicadas en el envase de c/producto. Tomando en
 cuenta la cantidad a preparar. Por ejemplo: EMB Su preparación es
de 36 g/litro, se desea preparar 5 placas a razón de 20 ml c/u,
serian 100 ml del medio en total.

Se calcula:
36 gr. ------------------- 1000 ml
X ------------------- 100 ml
X = 3,6 gr. de EMB por c/100ml

Nota. EL MR-VP Indol nitrato y la leche tornasolada (Medios líquidos) se preparan

de la misma manera que los medios sólidos y semi-sólidos.

3. Medios sólidos y semi- sólidos en tubos. Se agrega a razón de 5 ml

por tubos: Kliger, Citrato, SIM y gelatina.

4. Medios en placa. VJ, EMB. A.A. (Agar Almidón) a razón de 20 ml

aproximadamente por placa.

Notas. Todos los medios se esterilizan en autoclave durante 15 min a 121ºC y 1

atmósfera de presión.
 Práctica N° 6.1
Diferenciación con medios específicos
(Pruebas Bioquímicas)

El estudio de los microorganismos en base a la descripción de la morfología

colonial y microscópica no es suficiente para hacer una identificación satisfactoria,
es por ello que se tiene que recurrir al estudio de su comportamiento fisiológico, es
decir, como utilizan los nutrientes y permiten llegar a la caracterización de un
microorganismo dado. El metabolismo es la suma de todos los procesos químicos
que ocurren dentro de un microorganismos y se dividen en anabolismo y
catabolismo, el primero se refiere a las reacciones bioquímica que suceden en la
célula para formar macromoléculas y el segundo representa las reacciones que
están involucradas en el rompimiento de los sustratos con el propósito de suplir la
energía utilizada en el catabolismo.
La fermentación es una reacción del catabolismo en la cual, por efecto de las
enzimas se degradan principalmente azucares para la obtención de energía
subproductos más sencillos necesarios para la célula. Por su parte una enzima, es
una proteína especializada, que actúa como catalizador (acelerador) en el
metabolismo de los seres vivos, regulando la velocidad de muchas reacciones
químicas. El nombre de enzima, que fue propuesto en 1867 por el fisiólogo alemán
Wilhelm Kühne (1837-1900), deriva de la frase griega en zymē, que significa 'en
fermento'. En la fermentación láctica, la lactasa, enzima producida por una
bacteria que se encuentra generalmente en la leche, hace que ésta se agrie,
transformando la lactosa (azúcar de la leche) en ácido láctico. En el caso de la
fermentación alcohólica, la cimasa segregada por la levadura convierte los
azúcares simples, como la glucosa y la fructosa, en alcohol etílico y dióxido de
carbono. En otros muchos tipos de fermentación ocurridas de forma natural, como
la formación de ácido butanoico a partir de ácidos grasos de diferentes longitudes,
la mantequilla se vuelve rancia, y el vino se convierte en vinagre por la formación
de ácido etanoico (acético) a partir del alcohol etílico.
Objetivo de la práctica:

 Realizar tanto la preparación del montaje húmedo como gota pendiente

 Observar
 montajes.

Materiales

1. Caja de Petri con almidón

2. Tubos de ensayo con:
 Caldo glucosa
 Caldo lactosa
 Caldo sacarosa
 Caldo manitol
 Medio de Kliger
 Medio de RM-VP
 Citrato de Simons
 Gelatina
 Leche tornasolada
 Indol- Nitrato

Metodología:
1. Digestión de polisacáridos. En una placa con almidón, siembre por estría
abierta cada uno de los M.O. proporcionados. Incube a 37º C durante 24
h. Añadir tres gotas de solución de lugol alrededor del crecimiento y en la
zona donde no haya inoculado el microorganismo. El almidón intacto
toma una coloración azul violáceo con el lugol. Digestión de almidón
positiva: aparición de un halo claro alrededor de la estría. Digestión
de almidón negativo: no se observa halo alrededor de estría.
2. Fermentación de azucares en medios Kliger. Inocular por picadura y en la
superficie de los tubos que contienen medio de Kliger, cada uno de los
 M.O. proporcionados. Incube a 37º C durante 24 h. Observe y registre el
resultado. Fermentación de glucosa: viraje del indicador de rojo a
amarillo en el fondo del tubo. Fermentación de lactosa: viraje del
indicador de rojo a amarrillo en la superficie del tubo. Producción de
gas: formación de burbujas. Producción de H2S: Presencia de un
precipitado.
2. Fermentación de azúcares prueba rojo de metileno. Inocule cada uno
de los M.O. microorganismos proporcionados en los tubos con caldo
rojo de metileno (M R). Incube a 37º C durante 24 h. Añada a cada
tubo 5 gotas de la solución de rojo de metileno (indicador de pH).
Observe y registre el resultado. Prueba de rojo de metileno
positivo: presencia de color rojo en todo el cultivo o cuando el reactivo
permanece de ese color en la superficie del medio.
3. Fermentación de azúcares prueba de Voges-Proskauer. Inocule cada
uno de los M.O. en los tubos que contienen caldo V.P. Incube a 37º C
durante 24 h. Agregar los siguientes reactivos en el orden que se
indica: 6 gotas de solución alfa-naftol, 2 gotas de soluciona KDH
creatina. Agite cada tubo suavemente y déjelo en reposo a 37º C
durante 20-30 min. Observe y registre los resultados. Prueba V.P.
positiva: presencia de color rojo en la superficie del medio de cultivo.
(producción de acetil-metileno).
4. Fermentación de ácidos orgánicos citrato. Siembre un tubo con medio
de citrato de Simons, con cada M.O. proporcionado. Incube a 37º C
durante 24 h. Observe y registre sus resultados. Prueba positiva:
viraje del bromotimol de azul a amarillo
5. Digestión de proteínas en tubo. Inocule un tubo con gelatina los M.O.
proporcionados, utilizando un aguja realice una punción hasta el fondo
del tubo. Incube a 37º C durante 24 h. Observe y registre sus
resultados. Digestión positiva de la gelatina: licuefacción de la
 gelatina. Digestión negativa de la gelatina: El medio permanece
sólido
6. Digestión de proteína y fermentación de la lactosa. Leche tornasolada.
En la leche tornasolada siembre los M.O. proporcionados. Guarde un
tubo sin inocular como testigo. Incube a 37º C durante 24 h. Observe y
registre sus resultados. Fermentación positiva de la lactosa: Color
rosa. Fermentación negativa de la lactosa: Color púrpura.
Reacción alcalina: Color azul (los M.O. atacan las sustancia
nitrogenadas liberando aminoácidos). Coagulación de las
proteínas de la leche: Formación de un coagulo o cuajo. Digestión
de proteína: Aclaración del medio (peptonización). Producción de
gas: Burbujas en el medio (CO2 y H2).
7. Producción de indol- nitrato. Siembre los tubos con medio de
Indol-nitrato Con los M.O. proporcionada. Incube a 37º C durante 24
horas. Añada tres gotas de reactivos de Kovacs o Enrlich en cada
tubo. Observe y registre sus resultados: Producción positiva de
nitratos: Aparición de un color rojo ladrillo al agregarle tres gotas de
alfanaftilarnina y 3 gotas de ácido sulfanílico. Producción
negativa de nitritos: Ausencia de color.
8. Fermentación de azucares en tubo. Siembre los tubos con los medios
conteniendo los diferentes azucares, con los M.O. proporcionada.
Incube a 37º C durante 24 horas. Observe y registre sus resultados:
Fermentación positiva: Viraje del color de morado a amarillo,
(producción de acido) y producción de gas por la presencia de burbujas
en el interior del tubo

Preguntas a investigar:

1. Indique los resultados obtenidos en cada prueba bioquímica realizada.

2. Diga cuales son los valores de pH a los que viran los siguientes
indicadores: Rojo de Fenol- Rojo de Metilo- Azul de bromocresol.
3. Mencione los diferentes tipos de fermentación que pueden realizar las
bacteria y diga cuales son los productos que se acumulan como resultado
de ellas.
4. Defina metabolismo, catabolismo y anabolismo.
5. ¿Qué importancia presentan las pruebas bioquímicas?
6. ¿Qué significa RM-VP?
7. ¿Qué color y apariencia poseen cada uno de los medios de cultivo utilizado?
8. Realice un cuadro con sus respuestas.
Bibliografía consultada
PRESCOTT, L.; HARLEY, J.; KLEIN, D. Agud Aparicio, José Luis (Traductor);
Gamazo de la Rasilla, Carlos (Revisor) Microbiología, Mc Graw-Hill, Madrid,
España.

COLLINS, C. Métodos microbiológicos, Editorial ACRIBIA, S.A. Zaragoza, España, 5ta

edición.

HARLEY, J.; PRESCOTT, L. 2002. Laboratory Exercises in Microbiology, 5ta edición.

The McGraw−Hill Companies.

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