TEMA: Métodos y técnicas de diagnóstico de hongos de la piel en Ranas.

OBJETIVO GENERAL:
 Conocer las diferentes técnicas de diagnóstico las cuales nos ayudaran
para saber los diferentes tipos de hongos en la piel de las ranas.
OBJETIVOS ESPECÍFICOS
 Conocer los diferentes tipos de nombres y tipos de hongos que se
producen en la piel de las ranas.
 Conocer los cuidados que deben tener la rana.
 Distinguir los diferentes tipos de hongos

INTRODUCCIÓN
Hace ya casi dos décadas que la extinción repentina y catastrófica de los anfibios
en varias regiones del mundo pasaron a la palestra pública, sin que hubiera una
reacción inmediata frente a la crisis. El escepticismo inicial, paradójicamente
generado por la idiosincrasia científica, al pasar de los años pasaría una factura
actualmente impagable: cientos de especies de ranas, sapos y salamandras
cuyas poblaciones aún mantenían unos pocos individuos remanentes se
extinguieron. Durante las últimas décadas, el aumento en la prevalencia de las
infecciones fúngicas ha sido constante, relacionado fundamentalmente con el
incremento de pacientes inmunocomprometidos y con el uso generalizado de
antimicrobianos, la utilización de inmunosupresores, maniobras diagnósticas
invasoras y la implantación de alimentación parenteral. Junto a estas micosis
invasoras, que podríamos llamar oportunistas, coexisten otras micosis, que
podríamos considerar primarias, causadas por hongos muy adaptados para la
supervivencia en los tejidos infectados. Algunas de ellas se comportan como
micosis profundas, y se caracterizan porque se distribuyen en determinadas
zonas geográficas, donde resultan endémicas. Otras, ubicuas, se caracterizan
por afectar a piel y mucosas: se trata de las dermatomicosis y candidosis de las
mucosas. Con menos frecuencia, se encuentran las micosis subcutáneas,
caracterizadas por la agresividad local y poca tendencia a la diseminación a
distancia, y que suelen contar con antecedentes traumáticos que justifican la
inoculación del hongo
Las pruebas de sensibilidad a los antifúngicos están basadas en las técnicas de
microdilución en caldo, que se desarrollaron para conocer la actividad in vitro de
los antibacterianos. Estas técnicas determinan la CMI (concentración mínima
inhibitoria), que se obtiene calculando porcentajes de inhibición respecto a un
control de crecimiento. Los estándares incluyen recomendaciones para la
conservación, la preparación y la interpretación de las pruebas, así como un
sistema para controlar la calidad de los resultados. La introducción de estas

técnicas produjo un cambio cualitativo en los estudios de sensibilidad a los

antifúngicos. Por primera vez se disponía de métodos reproducibles para
detectar la resistencia in vitro a estos antimicrobianos, por lo que se podía
evaluar su utilidad clínica. La aplicabilidad práctica de una técnica de
determinación de sensibilidad reside en la fiabilidad de sus resultados; si estos
no son reproducibles no pueden establecerse puntos de corte que guíen las
recomendaciones terapéuticas. Además, la aparición de estos estándares ha
permitido diseñar y validar varios métodos de difusión en agar y técnicas
comerciales para realizar pruebas de sensibilidad a los antifúngicos, que pueden
utilizarse para detectar la resistencia a los azoles, particularmente la resistencia
a fluconazol en levaduras, que es el reto asistencial más destacable en este
campo.
DESARROLLO
El patógeno causante de la quitridiomicosis es Batrachochytrium dendrobatidis,
(Bd) (Longcore et al., 1999), un hongo que pertenece al Phylum Chytridiomycota,
Clase Chytridiomycetes y Orden Chytridiales .Este hongo es único ya que es uno
de los dos Chytridiomycota que parasitan vertebrados y el único que parasita
anfibios. Este hongo degrada la queratina, 6 invadiendo el stratum corneum y
granulosum de la epidermis en anfibios postmetamorfos y los dentículos en
renacuajos y es el único que tiene una zoospora flagelada móvil. El pH óptimo
para el crecimiento de Bd es de 6.0 a 7.5, pero también puede crecer en un pH
entre 5–8. El hongo se desarrolla entre los 4° y 25° C y se reproduce con mayor
rapidez a 17–25° C. Temperaturas mayores a 30° C matan al hongo demostraron
que a pesar de que el crecimiento es más lento bajo 17° C, el número de
zoosporas producidas por talo aumenta, y por lo tanto el crecimiento de la
población en el huésped puede mantenerse entre 10 y 25° C. También
encontraron que cuando la temperatura disminuye bruscamente se estimula la
liberación de zoosporas. Berger (2001) y Johnson et al., (2003) sostienen que
dado que las zoosporas no tienen pared pueden sucumbir por desecación. Por
esta razón Bd requiere agua para su reproducción y para estar activo. El ciclo de
vida es una progresión desde la zoospora hasta el talo que produce un único
zoosporangio. El ciclo tiene dos estadios: la zoospora móvil, acuática de corta
vida, para la dispersión, y el talo estacionario, el cual se desarrolla en
zoosporangio para la reproducción asexual. Después del periodo de motilidad
(24h) las zoosporas se enquistan, reabsorben el flagelo, forman un germling
(esporangio joven), y aparecen rizoides de una o más áreas. El talo se hace más
largo y se convierte en esporangio maduro a los 4 o 5 días. Dentro del talo ahora
ya llamado zoosporangio se forman zoosporas mientras se forma el tubo de
descarga, después las zoosporas son liberadas. La duración del ciclo de vida in
vitro es de 4 a 5 días a 22° C y se asume que es el mismo en la piel de los
anfibios (Berger et al., 2005). Batrachochytrium dendrobatidis podría
reproducirse también por fertilización cruzada o por recombinación sexual. La
reproducción sexual inicia la producción de esporangios resistentes que le
permitirían 7 dispersión a larga distancia y mantenerse un mayor tiempo fuera
del huésped.
EFECTOS DE Bd EN LOS ANFIBIOS
El hongo no se distribuye en toda la superficie del cuerpo de los anfibios
infectados. Se lo encuentra en el stratum corneum de los dedos, en la parte
ventral (los muslos y la región inguinal) y con menor frecuencia en la región
dorsal. Los síntomas clínicos de la quitridiomicosis se manifiestan de tres
maneras en adultos: cambios comportamentales, señales neurológicas (letargia,
falta de apetito, postura anormal) y lesiones en la piel. Produce hiperplasia de la
epidermis, desorden en la posición de las células, y desprendimiento de piel,
pero rara vez se observan lesiones visibles a simple vista. Las infecciones más
severas se han encontrado generalmente en el parche pélvico y en las
membranas entre los dedos. La quitridiomicosis generalmente no mata a los
renacuajos; los síntomas solo se visualizan en la parte queratinizada localizada
en la región oral, encontraron anomalías incluyendo despigmentación y pérdida
de los discos orales, despigmentación de la mandíbula superior e inferior y una
hinchazón de las papilas labiales. Para explicar como un hongo que está
restringido a la superficie de la epidermis tiene la capacidad de matar a los sapos
Voyles et al., (2009) afirma que Bd impide la función osmorreguladora
provocando un desbalance de electrolitos causando finalmente un paro cardíaco.
MECANISMO DE INFECCIÓN
La infección por Bd puede transmitirse entre animales por contacto entre ellos o
con zoosporas móviles vehiculadas con el agua. Se considera que la transmisión
a largas distancias tiene lugar por medios distintos del agua, como el traslado de
animales durante el comercio internacional y posiblemente por el movimiento de
agua contaminada o suelo húmedo.
Los brotes de quitridiomicosis se asocian principalmente a estaciones (meses
más fríos), altitudes (la mayoría de casos graves en general se restringen a
poblaciones de grandes altitudes), y a hábitats de reproducción. Respecto a los
últimos, los declives de poblaciones son pronunciados en especies que viven en
arroyos. La gravedad del impacto de la enfermedad en la población también está
correlacionada con pequeñas distribuciones de poblaciones que son menos
fecundas, existen interacciones más complejas y diferencias de susceptibilidad
aparentemente inherentes que actúan junto con estos “factores” identificados.
CONTROL Y PREVENCIÓN
Bd es susceptible a gran variedad de agentes antifúngicos y a niveles bajos de
calor (>30°C) cuando se analiza in vitro, pero existen pocos métodos que hayan
demostrado eliminar Bd de los anfibios. Se ha comprobado que el calentamiento
(a 32°C durante 5 días y a 37ºC durante dos periodos de 8 horas, con un intervalo
de 24 horas entre ellos) es igual de eficaz contra la quitridiomicosis en dos
especies de anfibios. Debe comprobarse el efecto del calor y optimizarse en
varias especies, y se observará que muchos anfibios de climas templados no
toleran los 37ºC. Aunque tanto los baños de itraconazol y (al 0,01% durante 5
minutos al día y un total de 11 días) como los de formalina/verde de malaquita
parecen ser tratamientos eficaces para las ranas postmetamórficas, estas
pruebas no fueron rigurosas y se observó el problema de la toxicidad, en
concreto en el caso de la formalina/verde de malaquita. No obstante, los baños
de itraconazol se han utilizado mucho en programas de rescate y conservación
de anfibios, y observaciones puntuales sugieren que es eficaz para adultos y
subadultos. Se ha observado un tratamiento eficaz de renacuajos infectados de
una especie en una prueba controlada en la que se ha utilizado itraconazol a
dosis bajas (1,5 mg litro–1), pero podría ir asociado a despigmentación. Nota: la
formulación hidrosoluble de itraconazol no es fácil de conseguir. Se ha
documentado un tratamiento seguro y eficaz contra infecciones por Bd (en
adultos y renacuajos) con voriconazol. Este tratamiento consiste en aplicar spray
una vez al día durante 7 días a razón de 1,25 mg litro–1 (Martel et al., 2010).
ELECCIÓN DE EJEMPLARES
Bd se replica en las partes queratinizadas de los aparatos bucales de los
renacuajos y en casi todas las superficies ventrales, así como en los dedos de
los pies de los anfibios adultos. Los órganos infectados son los dedos de los pies
(que deberían cortarse, pero no se recomienda por motivos éticos), la piel (deben
tomarse hisopos) y los aparatos bucales (renacuajos), y también debe realizarse
baños de animales enteros (adultos y renacuajos).
Los hisopos y los discos orales extirpados pueden guardarse secos a
temperatura ambiente (de hasta 23ºC). Nota: la exposición a temperaturas altas
durante largos periodos de tiempo (por ejemplo, en un coche) puede reducir la
obtención de ácido nucleico. En caso de realizar el examen mediante
microscopía óptica o electrónica, se fijan los tejidos en formalina tamponada
neutra al 10% y glutaraldehído tamponado al 2,5%. Las muestras deben
procesarse como se describe para la Necrosis hematopoyética epizoótica o la
Infección por ranavirus.
MÉTODOS DE DIAGNÓSTICO
En la mayoría de los animales infectados no se observan signos clínicos. El
periodo de manifestación de signos clínicos suele ser corto y se limita a los
anfibios que después morirán. Predominan los signos del sistema nervioso
central. Las alteraciones del comportamiento consisten en un movimiento lento
y descoordinado, posturas de sedestación anómalas, espasmos tetánicos,
pérdida del reflejo de erguido y parálisis.
MÉTODOS CLÍNICOS
ANATOMOPATOLOGÌA MACROSCÓPICA
Pueden observarse alteraciones macroscópicas de la piel en las infecciones
graves, que consisten en una muda anómala de la piel (más frecuente de lo
normal y en trozos más pequeños) y eritema. Estos signos clínicos no son
específicos de la quitridiomicosis.

BIOQUÍMICA CLÍNICA
En la rana arborícola verde de Australia enferma (Litoria caerulea) se observan
reducciones en las concentraciones plasmáticas de sodio y de potasio de un
20% y un 50%, respectivamente.
ANATOMOPATOLOGÍA MICROSCÓPICA
La microscopía consiste en el examen de preparaciones húmedas de piel
(raspados, frotis o piel entera), cortes histológicos de piel teñido con hematoxilina
y eosina, e inmunohistoquímica de cortes de piel. Estas pruebas sistemáticas
tienen un alto valor predictivo positivo. A continuación, se explican detalles de
estas técnicas y sobre cómo interpretar los resultados.
PREPARACIONES HÚMEDAS
Pueden examinarse muestras de piel entera, de las membranas interdigitales o
de cualquier otro lugar; esta técnica mantiene la anatomía de la piel y permite
examinar una gran superficie. La ventaja es que la muestra se puede orientar y
que la localización del agente sospechoso puede ayudar a identificarlo. Así, por
ejemplo, puede determinarse si en las células superficiales hay perfiles fúngicos
sospechosos, lo cual sería indicativo de Bd, o bien si se encuentran en capas
más profundas, lo cual es normal en la morfología normal del anfibio. Esta
técnica es rápida, barata y, cuando es utilizada por observadores con
experiencia, ofrece una sensibilidad equivalente a la de la tinción con
hematoxilina y eosina (Longcore et al., 2007). Es útil para estudiar ranas sanas
de las que no puedan obtenerse hojas de piel mudada. Los renacuajos
infectados a menudo pueden identificarse en el campo por la falta de color en las
capas dérmicas de las mandíbulas, lo cual puede observarse mediante lupas
(x10). Los aparatos bucales del renacuajo también se pueden examinar cortando
trozos de las filas de dientes o de las capas dérmicas y aplastándolos bajo un
cubreobjetos, donde se podrán observar agrupaciones de esporangios. En las
preparaciones húmedas y los frotis (véase abajo), normalmente se observan
esporangios intracelulares de forma entre redonda y ovalada formando
agrupaciones. En piel mudada el estadio más frecuente es el de esporangios
vacíos viejos, aunque también es frecuente hallar esporangios que contengan
zoosporas. Los tubos de descarga (asociados a los zoosporangios), de los
cuales salen zoosporas, suelen apuntar perpendicularmente a la superficie de la
piel y, por tanto, son pequeños círculos, tal vez difíciles de diferenciar. La
observación de septos internos dentro de los esporangios aumenta la confianza
en el diagnóstico. Los núcleos de las células de la epidermis son de tamaño
similar al de los esporangios, pero pueden diferenciarse por sus membranas
irregulares y poco definidas, y por su aspecto plano, granular y gris.
CONCLUSIÓN
 Con la investigación de este trabajo nos podemos dar cuenta que el hongo
que predomina en casi todas las especies es el Batrachochytrium
dendrobatidis (Bd)
  La patogenia de esta enfermedad cutánea ha sido difícil de determinar,
puesto que no se ha detectado ninguna alteración anatomopatológica
constante en ningún órgano interno.
 Bd es susceptible a una gran variedad de tratamientos químicos y físico
RECOMENDACIONES
 Se debe seguir las reglas tal y cual lo indica cada método por ejemplos
Se extrae ADN de dedos cortados, hisopos, filtros o discos orales de
renacuajos mediante PrepMan Ultra.
 Se recomienda que en cada placa también debe incluirse un control de
extracción sin ADN.
 Se recomienda la creación de una vacuna para este hongo.
BIBLIOGRAFÍA
http://www.ins.gob.pe/insvirtual/images/otrpubs/pdf/Manual%20Hongos.pdf
http://www.oie.int/esp/normes/fmanual/2.01.01_INF_BATRACHOCHYRIUM_7.
3.11.pdf