PRÁCTICA No.

5 Y 6: EXTRACCIÓN DE DNA
TOTAL DE PLANTAS Y ELECTROFORESIS
DE DNA.

Profesor: Ali Antonio García Barrera

Integrantes:
Alvarez Alaniz Oscar
Escalona Villa Martha
Espinoza Delgadillo Andrés
Maciel Montes Luz Mariana
Olivares Membrillo Alexa
Sánchez Islas Jesús Jonathan

Grupo: 4QBT1

Fecha de entrega: 11/JULIO/2018

Objetivos
  Extraer el ADN total del vegetal mediante el método de Fenol-cloroformo-alcohol
isoamilico mediante los tres pasos fundamentales.
 Aislar y Observar la estructura fibrilar del DNA de un tejido vegetal.
 Realizar correctamente una electroforesis de DNA vegetal
 Lograr una correcta visualización de DNA vegetal
INICIO
Centrifugar los tubos a 10,000
rpm por 5 min a 4 0C.
Recuperar el sobrenadante con
una micropipeta y colocarlo en
un tubo nuevo (medir el
volumen recuperado).
Agregar al sobrenadante el
mismo volumen de etanol (100
%) frío. 12) Invertir el tubo
suavemente para mezclar 5 o 6
veces y observar cómo se
precipitan los filamentos de
ADN.
FIN
Metodología
EXTRACCIÓN DNA
Triturar lo mejor posible el Colocar 500 µL del filtrado en
tejido previamente congelado un tubo Eppendorf y adicionar
y filtrar en un vaso de al tubo 100 µL de NaOH 0.2 N y
precipitado de 100 mL con tres 600 µL de Tris-EDTA 0.1 M pH
gasas estériles. 8.
Agregar 600 µL de Fenol-
Agregar 10 µL de Proteinasa K
cloroformo-alcohol isoamilico
(PK 10 mg/ml) y 200 µL de SDS
(25:24:1). Homogenizar
al 10 %. Y Incubar 20 min a 24
suavemente hasta formar una
0C con agitación suave.
sola fase
Si no se observan los Centrifugar a 12,000 rpm por
10 min a 4 0C Descartar el
filamentos incubar en el
sobrenadante y dejar secar la
congelador 10 min a -20 oC.
pastilla hasta quedar libre de
Volver a invertir el tubo
etanol a temperatura
suavemente para mezclar 2 o 3
ambiente.
veces y observar.
Dependiendo del color de la
pastilla y cantidad de la
Agregar 100 µL de agua
pastilla obtenida, lavar con 600
destilada o TAE 1X.Rotular el
µL de isopropanol al 70 %. Una
tubo con ADN colocando el
o más veces. Centrifugar a
número de equipo, grupo y la
10,000 rpm y eliminar el
especie de la cual se extrajo,
sobrenadante.
ELECTROFORESIS
para ser utilizado en la práctica
de electroforesis.Guardar el
tubo en el congelador a -20º C.

INICIO
Programar la fuente de poder a
75 Volts por 30 minutos
aproximadamente.
Terminada la electroforesis
apagar la fuente de poder y
desconectar los cables.
Colocar el gel dentro de la
cámara de electroforesis y
agregar buffer TAE 1X hasta
cubrir el gel y retirar el peine o
peines.
Colocar la tapa a la cámara y
conectar los cables de los
electrodos a la fuente de poder
(mismo color) y encender la
fuente de poder.
Retirar con cuidado el gel con
ayuda de una espátula ancha y
transferirlo al transiluminador
UV.
FIN
Materiales
Colocar el parafilm sobre la
mesa y con ayuda de la
micropipeta vaciar sobre este 8
alícuotas de 3 µL de buffer de
carga Azul de bromofenol 2x.
Con ayuda de la micropipeta
mezclar 3 µL de cada una de
las muestras y controles con las
gotitas de buffer azul de
bromofenol 2x y cargarlos a los
pozos en el siguiente orden:
1=control positivo, 2=control
negativo (agua), 3=ADN
previamente extraído de cada
equipo.
Encender el transiluminador,
observar los resultados y
tomar fotografías.
Retirar el gel de la cámara y
colocarlo en el contenedor de
residuos peligrosos.
  Mortero con pistilo
 Vaso de precipitado de 100 mL
 Agitador de vidrio
 Tubos eppendorf 2 o 3 mL
 Proteínasa K
 Buffer TAE 1X
 Etanol absoluto
 SDS 10%
 Tris-EDTA 0.1 M pH 8
 fenol-cloroformo-alcohol isoamilico (25:24:1)
 Micro pipetas de 0.5 a 10 µL y de 10 a 100 µL
 Rack con puntas estériles blancas y amarillas.
 Equipo de electroforesis horizontal

Resultados y Discusión

El DNA aparece degradado en una parte del gel de agarosa. Al extraer el ADN del
tejido vegetal, es preciso provocar una lisis celular, inactivar las nucleasas celulares
y separar los ácidos nucleicos de los restos de células. Suele consistir en un
equilibrio de técnicas y ha de ser suficientemente fuerte para romper el material
inicial complejo, pero suficientemente suave para preservar el ácido nucleico(Vidal &
Barrera, 2004)
Las células vegetales también pueden lisarse con el detergente iónico bromuro de
cetiltrimetil amonio (CTAB), que forma un complejo insoluble con los ácidos
nucleicos en medio hiposalino. De ese modo, los polisacáridos, los compuestos
fenólicos y los demás contaminantes permanecen en el sobrenadante y pueden
eliminarse por lavado. El complejo de ADN se solubiliza aumentando la
concentración salina y se precipita con etanol o isopropanol.
El protocolo del método del Fenol-cloroformo-alcohol (FAC) (Murray y Thompson,
2009) Es el método es adecuado para extraer y purificar ADN de vegetales y
alimentos derivados de vegetales y está especialmente ndicado para eliminar los
polisacáridos y los compuestos polifenólicos, que, de otro modo, alterarían la pureza
del ADN y,por tanto, su calidad (Wagner., 2007)
En el gel de electroforesis el ADN como un chorreado, ya que EcoRI* tiene cientos
de sitios de restricción en el ADN y por lo tanto da origen a cientos desfragmentes de
distintos pesos moleculares. Es por eso que se observan chorreados. La movilidad
de las moléculas de ADN durante la electroforesis también se puede ver influenciada
por la concentración del gel de agarosa, ya que menor concentración de agarosa la
electroforesis presenta una mayor migración de las moléculas. (Luque & Herráez,
2003)
Conclusión
La extracción del DNA no tuvo éxito, se observó más bien un esparcimiento de lo
que parece ser DNA y no una estructura fibrilar como se esperaba; probablemente
porque al rehidratar, se usó buuffer TAE 1X y no agua inyectable como lo indicaba el
manual. Además en una extracción de DNA vegetal se recomienda usar el equipo
correctamente y seguir las indicaciones del profesor a cargo. Poro tra parte, colectar
tejido vegetal joven pues contiene más células que un tejido viejo después de
triturarlo inmediatamente congelar en N2 líquido para evitar la formación de cristales
y ayudar a la síntesis de los metabolitos secundarios. posteriormente seguir las
indicaciones del manual.
Cuestionario

Bibliografia

-Murray A., O. Blanco, O. F. Cubero, M. C. Molina y P. Thompson. 2009. Técnicas y

métodos para la iniciación en el estudio de la evolución molecular con aplicaciones
especiales para el análisis de los hongos liquenizados. Botanica Complutensis 23:
13-51.
-Vidal J., J. Rodríguez, O. Fuentes, M. Castex y A. Barrera. 2004. Comparación entre
5 métodos para la extracción de ADN de triatomíneos: su utilización en la técnica de
ADN polimórfico amplificado al azar. Revista Cubana de Medicina Tropical 56: 208-
13.
-Sepúlveda-Jiménez G., Luque y M. Herréz. 2003. La participación de los
metabolitos secundarios en la defensa de las plantas. Revista Mexicana de
Fitopatología 21: 355-363