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Histologische Technik

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27.11.2012

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 1 1. Fixierung
 2 2. Zuschnitt
 3 3. Einbettung
 4 4. Herstellung von Paraffin-Schnittpräparaten
 5 5. Herstellung von Schnellschnitten / Gefrierschnitten
 6 6. Färbung
o 6.1 6.1 Physikalische Färbungen
o 6.2 6.2 Physikochemische Vorgänge bei Färbungen
o 6.3 6.3 Chemische Färbungen
o 6.4 6.4 Beispiele für Färbungen (siehe auch: Färbemethoden)
 7 7. Einschluß
o 7.1 Teilen mit:

1. Fixierung

Unmittelbar nach der Entnahme setzt in Gewebsproben die Autolyse bzw. Heterolyse ein. Das Gewebe muß
daher sofort frisch bearbeitet oder aber fixiert werden. Durch die Fixation wird die Zersetzung aufgehalten.

Das am weitesten verbreitete Fixierungsmittel ist das Formalin. Dabei handelt es sich um eine verdünnte und
gepufferte Formaldehyd-Lösung. Formalin vernetzt Proteine und verleiht dem Gewebe eine gummiartige
Konsistenz.

Die Formalinfixierung hat jedoch auch Nachteile. Die meisten Proteine verlieren durch die Fixierung ihre
Funktion und einen großen Teil ihrer antigenen Eigenschaften. Viele enzymhistochemische und
immunhistologische Untersuchungen können daher nicht an Formalin-fixiertem Material durchgeführt werden.
Da es sich bei Formalin um eine wässrige Lösung handelt, werden Glykogen und viele andere Polysaccharide
sowie bestimmte Kristalle wie etwa Urate herausgelöst. Für spezielle Fragestellungen verwendet man daher
andere Fixantien, z.B. Alkohol. Für elektronenmikroskopische Untersuchungen wird oft Glutaraldhyd verwendet.
Im Zweifelsfall sollte man sich bei besonderen Fragestellungen vor der Probengewinnung bei dem Pathologen,
den man mit dem Material zu überraschen gedenkt, erkundigen!

Für alle Fixierungsmittel gilt, daß die Dauer der Fixierung von der Größe der Gewebsprobe abhängt und daß
das Fixans in mindestens 20-fachem Volumenüberschuß vorliegen soll. Das Gewebe muß im Fixierungsmittel
schwimmen! Ist die Größe des Untersuchungsmaterials nicht durch die Entnahme bereits festgelegt (z.B.
Punktionszylinder), so muß das Präparat zur besseren Fixierung angeschnitten werden, ohne dabei die
Zusammenhänge zu zerstören. So sollen z.B. Hohlorgane aufgeschnitten werden (außerhalb z.B. des Ulkus,
des Tumors oder einer anderen zu untersuchenden Läsion!), damit die leicht verderbliche Schleimhaut vom
Fixierungsmittel erreicht wird. Parenchymatöse Organe sollen angeschnitten (Leber, Milz) oder durchspült
werden (Lunge). Messer und Scheren müssen scharf sein, um Quetschartefakte zu vermeiden.

Der beste Weg ist jedoch, wenn immer möglich, das Untersuchungsgut der Pathologie frisch und unfixiert (am
besten eisgekühlt in physiologischer Kochsalzlösung) zur Bearbeitung zu übergeben. Damit ist gewährleistet,
daß auch alle erforderlichen Untersuchungsmethoden angewendet werden können und ggf. frisches Gewebe
asserviert werden kann. So können intraoperative Schnellschnitte nur von Frischgewebe angefertigt werden.
Von frischem Material lassen sich z.B. auch Tupfpräparate für die zytologische Dagnostik gewinnen. Viele
enzymhistochemische Tests sind nur am frischen Gewebe durchführbar. In der Immunhistologie steht für
Kryostatschnitte eine viel breitere Palette von Antikörpern als für fixiertes Gewebe zur Verfügung. Ferner kann
man vom frischen Gewebe hochmolekulare Nukleinsäuren (DNA, RNA) für die molekular-pathologische
Diagnostik gewinnen. Bei Bedarf kann Gewebe für eine mikrobiologische Diagnostik weitergeleitet werden.
Außerdem können z.B. Organpräparate fachgerecht aufgeschnitten und auf Korkplatten aufgesteckt fixiert
werden.

2. Zuschnitt

Gewebsproben, die größer als die Einbettkassetten sind, müssen fachgerecht zugeschnitten werden. Dieses gilt
insbesondere für Operationspräparate mit Tumoren, bei denen verschiedene Anteile des Tumors zur
Ausbreitungsdiagnostik, die Abtragungsebenen (tumorfrei?) und regionäre Lymphknoten (Metastasen?)
histologisch untersucht werden müssen. Mit dem Zuschnitt ist die makroskopische Beschreibung einschließlich
einer orientierenden Dagnostik nach den Grundzügen der pathologischen Anatomie verbunden. Das
zugeschnittene Gewebe wird in siebartige Plastikkassetten, die mit der Fallnummer bedruckt werden, gelegt und
gelangt dann zur weiteren Fixierung oder ggf. auch zur Entkalkung (Knochengewebe usw.). Danach wird das
Fixierungsmittel ausgewaschen, da es die weiteren Schritte stören kann.

3. Einbettung

Um dünne und gleichmäßige Schnitte herstellen zu können, muß das Material Stabilität und eine gleichmäßige
Konsistenz aufweisen. Dafür tränkt man das Gewebe in heißem Paraffinwachs, das bei Abkühlung erstarrt. Da
Paraffin nicht wasserlöslich ist, muß das Gewebe in einer aufsteigenden Alkoholreihe entwässert werden.
Anschließend wird der Alkohol durch ein Intermedium (z.B. Xylol) entfernt und dann das Xylol durch heißes
Paraffinwachs ersetzt. Die von Paraffin durchtränkten Gewebestücke werden dann in ein Gießschälchen gelegt,
mit heißem Paraffin überschichtet und zu einem Paraffinblock verabeitet, wobei die Einbettkassette (mit der
Fallnummer) den Blockträger bildet.

Das Gewebe wird derart angeordnet, daß die zu schneidende Fläche auf dem Boden liegt. Nach Erkalten des
Paraffins wird der Block aus der Gießform geschlagen.

Für unentkalkte Hartgewebe (Zähne, Knochen) verwendet man anstelle des Paraffins Acryl-Kunstharze, die
auch ohne Entkalkung die Herstellung von Schnitt- oder Feinschliff-Präparaten erlauben.

4. Herstellung von Paraffin-Schnittpräparaten

Gewebsschnitte von einigen Mikrometern Dicke lassen sich nur mit Spezialapparaten herstellen. Zum Anfertigen
von Paraffinschnitten werden Rotations- oder ein Schlittenmikrotome verwendet. Diese bestehen aus einer
Haltevorrichtung, in die das Blöckchen eingespannt wird, einem Messer und einer Mechanik zur Steuerung der
Schnittdicke. Der Block wird bis unmittelbar unter die Schnittebene des ebenfalls fest eingeschraubten Messers
gebracht. Danach beginnt man die gewünschten Schnitte von 4 bis 7 Mikrometer Dicke zu schneiden. Der
Schnitt schiebt sich dabei auf das Messer. Von dort wird er mit einem angefeuchteten Pinsel abgehoben und in
ein Warmwasserbad übertragen. Hierdurch wird der Schnitt gestreckt und von Falten befreit. Dann werden die
Schnitte auf saubere und fettfreie Objektträger aufgezogen. Dazu werden diese so tief und schräg in das
Wasserbad gehalten, daß der Schnitt an der gewünschten Stelle aufgezogen werden kann. Die Objektträger
werden je nach Färbungen in Küvetten sortiert und bis zum Färben in einem 37 Grad C warmen Brutschrank
zum Trocknen und zur besseren Haftung aufbewahrt.

5. Herstellung von Schnellschnitten / Gefrierschnitten

Unfixiertes Gewebe kann durch Einfrieren gehärtet und damit schneidbar gemacht werden. Diese Methode wird
angewandt, wenn Wert auf eine schnelle (z.B. intraoperative) Diagnose gelegt wird. Allerdings führt das
Einfrieren und die vermehrte mechanische Beanspruchung des unfixierten Gewebes häufiger zu Artefakten.
Zudem besteht eine erhöhte Infektionsgefahr bei der Bearbeitung von unfixierten Gewebsproben. Besonders
geeignet ist die Gefriermethode zur Herstellung von Schnitten, in denen Fett dargestellt werden soll, da hier die
Anwendung fettlösender Mittel wegfällt, und zur Herstellung von enzymhistochemischen und
immunhistologischen Färbungen.

6. Färbung

Nach dem Schneiden und Trockenen im Brutschrank werden die Schnitte in Xylol entparaffiniert, durch die
absteigende Alkoholreihe wieder in ein wässriges Milieu überführt und schließlich in den jeweiligen
Färbelösungen gefärbt. Je nach Färbung läßt man die Schnitte sofort trocknen oder bringt sie durch die
aufsteigende Alkoholreihe bis ins Xylol und deckt sie dann ein.

6.1 Physikalische Färbungen

Farbstoffaufnahme durch Löslichkeit in Strukturbestandteilen: Bei der Fettfärbung z.B. lösen sich die
angebotenen Farbstoffe leichter in den Gewebslipiden als in der angebotenen alkoholischen Lösung. Sie
diffundieren aus der Farblösung in den von ihnen bevorzugten Anteil des Präparates. Durchtränkungsverfahren:
Hierbei wird die dichteste Struktur am stärksten gefärbt, weil die Zahl der Strukturlücken, die den Farbstoff
aufnehmen können, größer ist als in lockeren Strukturen. Grob disperse Stoffe benötigen lang, um in enge
Maschen zu gelangen.

6.2 Physikochemische Vorgänge bei Färbungen

Elektroadsorption: Grundlage ist der amphotere Charakter des Eiweißes. Ist der pH höher als der isoelektrische
Punkt, hat die Struktur saure Gruppen und neigt zur Salzbildung mit basischen Farbstoffen – und umgekehrt.
Den unterschiedlichen isoelektrischen Punkt (I.P.) von Zellkern und Plasma nutzt man für eine Endpunktfärbung
(= unabhängig von der Färbedauer) aus: liegt ein basischer Farbstoff in saurer Lösung bei einem pH vor, der
zwischen dem I.P. der Kerne (etwa 3,8) und dem des Plasmas (etwa 6,5) bei 4,5 eingestellt ist, so werden
elektiv nur die Zellkerne gefärbt, denn nur sie haben dann noch negative Ladung.

6.3 Chemische Färbungen

Die Reaktion zwischen Farbstoff und Substrat verläuft nach den Gesetzmäßigkeiten chemischer Bindungen. Sie
gewähren also einen Stoffnachweis im chemischen Sinne. Ist der fragliche Stoff nicht vorhanden, fällt die
Reaktion negativ aus (z.B. Eisennachweis).

6.4 Beispiele für Färbungen (siehe auch: Färbemethoden)

 HE (Hämatoxilin-Eosin): ist die gebräuchlichste Färbung. Sie gibt eine gute Übersicht. Sie beruht auf
dem Prinzip der Elektroadsorption. Kerne: blau, Cytoplasma: rot.
 van Gieson: Färbung der Kerne mit Weigerts Eisenhämatoxylin – Cytoplasma wird mit van Gieson-
Gemisch gefärbt (Pikrinsäurelösung und Säurefuchsin). Sie ist ein Beispiel für das Durchtränkungsverfahren.
Ergebnis: Kerne schwarz, Bindegewebe rot, Muskulatur und Cytoplasma gelb, Neuroglia gelblich, bemarkte
Nervenfasern grau, Schleim gelb bis rot.
 PAS (= Perjodsäure-Schiff Reaktion): Beruht auf der Darstellung von zwei dichtgelagerten
Aldehydgruppen mit Hilfe der fuchsinschwefeligen Säure. Perjodsäure hydrolysiert zuvor Kohlehydrate zu
Aldehydgruppen. Ergebnis: Kohlehydrate purpur, Kerne blau, auch Cerebroside, Ganglioside, Mukoproteide
und Glykoproteide geben eine positive Reaktion.
 Versilberung: Silbersalze werden durch starke Laugen in Silberoxyd umgewandelt, das dann als
schwarzer Niederschlag ausfällt. Durch Zugabe von Ammoniak entsteht Diaminsilberoxyd, das sich durch
Formalin reduzieren läßt. Dabei entsteht metallisches Silber als Niederschlag, Ammoniak und Ameisensäure.
Versilberungen bringen verschiedene Feinstrukturen zur Darstellung, z.B. retikuläre Bindegewebsfasern,
Zellgrenzen von Deckepithelien, Mikroorganismen, neurale Strukturen.

7. Einschluß

Zur mikroskopischen Untersuchung und zur Konservierung des Schnitts werden die gefärbten Präparate mit
einem Tropfen eines Einschlußmediums gebracht und mit einem Deckglas versehen. Dieses soll die Präparate
durchsichtig erhalten und gleichzeitig ihre Strukturen und Färbungen nicht schädigen. Es werden je nach Art der
Färbung wässrige, wasserfreie und fluoreszenzfreie Einschlußmedien verwendet. Beim Einschließen wird ein
geeignet großer Tropfen des Mediums mit einem Glasstab entweder direkt auf den Schnitt oder auf das
Deckglas gebracht. Dann wird das Deckglas aufgelegt. Anschließend werden Luftbläschen und überquellendes
Medium entfernt. Dieser Vorgang kann auch mit Hilfe von Eindeckmaschinen automatisert durchgeführt werden.