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ANALISIS INSTRUMENTAL DE ALIMENTOS AUXILIADO POR ORDENADOR'

Conference Paper · March 1994

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Jesús Simal-Lozano
University of Santiago de Compostela
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Effect of pesticides on the proteomic profile of yeast View project

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 ANALISIS INSTRUMENTAL DE ALIMENTOS AUXILIADO
POR ORDENADOR'

Jesús Simal Lozano', Manuel Simal Gándara' y Jesús Sima! Gándara'

I Catedrático de Nuaición y Bromatologla. Facultad de Fannacia. Universidad de Santiago

de Compostela. Campus de Santiago. E-15706, Santiago de Compostela (La COruila).
, Alumno de 5° curso. Facultad de Flsica. Universidad de Santiago de Compostela. Campus
de Santiago. E-15706, Santiago de Compostela (La Coruna).
, Profesor Titular de Nuaición y BromalOlogla. Facultad de Ciencia y Tecnología de los
Alimemos. Universidad de Vigo. Campus de Orense. E-32004, Orense (Orense).

RESUMEN. Aunque son numerosos los métodos -físicos y/o

físico-químicos utilizados en los laboratorios agro alimentarios (densimetrfa,
destilación, conductimetría, refraclometría, microscopía, polarimetría,
calorimetría... ), en esta ponencia haremos referencia a los métodos con-
siderados "instrumentales".

Se comenzará con técnicas de separación (extracción en contraco-

rriente de Craig. así como cromatografía con sus distintas modalidades y
sistemas de detección) y de medida'(potenciometría yespectrofolOmetría:
UV-visible, infrarroja, de fluorescencia, de masas, etc.).

INTRODUCCIÓN

En el caso de la extracción se utilizarán varios programas de ordenador en

turbobasic con el fin de evaluar su rendimiento de fornla simple o múltiple, la
distribución del analito en las fases orgánica y acuosa, así como la separación de
diversos componentes con pequeñas diferencias en su coeticiente de reparto.
En cromatografía se revisarán fundamentalmente los parámetros que evalúan las
condiciones de separación: factor de resolución, de capacidad y de asimetría, además
del número de platos teóricos. El análisis cualitativo se efectuará en base al tiempo de
retención relativo corregido o en base a detectores espectrométricos (de masas, de
fotodiodos. etc.). Se hará también hincapié en los diferentes métodos decuantiticación:
porcentaje de área, normalización y estándar externo e interno.

- 11 -
 Con relación a la potenciometría se utilizará un programa que permita la localiza-
ción rigurosa del punto estequiométrico atendiendo a las funciones de derivada de
pomer y segundo orden.
En las técnicas espectrofotométricas se profundizará en programas de identifica-
ción basados en bibliotecas de espectros (por ejemplo. en espectro fotometría infrarroj a)
y en representaciones tridimensionales de espectros sincron en el caso de la de
fluorescencia. Los ordenadores facilitan por medio de "macros" sus aplicaciones
cuantitativas.

PARTE PRÁCTICA

Gracias a la apadción del entorno WINDOWS versión 3.1., se dispone de un

entorno que permite ejecutar tareas múltiples de aplicaciones DOS. Por otro lado, la
necesidad de exponer a los alumnos de nuestros centros los avances en los métodos
instrumentales de forma que puedan posteriormente en pequeños grupos ejecutar
prácticas en cada una de estas técnicas de separación y medida nos ha llevado a conjuntar
ambas circunstancias. Con ocasión de este VI Simposium Andaluz del Alimento, lo
hacemos público.

1.- Extracción en contracorriente

La extracción es una técnica ampliamente utilizada y conocida. No así seguramen-
te la extracción en contracorriente por lo que traemos aquí una de nuestras aplicaciones
en turbobasic ya publicada [1]. en la que se incluye abundante bibliografía en este
campo. Vease FIGURA 1.

2.- Cromatografía
Con relación a lacromatografía. en algunos de nuestros trabajos hemos divulgado
la importancia del tratamiento de datos [2 y 3] Y evaluación de la eficacia [4].
Actualmente se dispone de un software que realiza de forma simpleel test de validación
de las técnicas cromatográficas. según las normas recogidas en la Farmacopea Estado-
unidense [5] y en la Europea [6] ("System Suitability Test"; SSn. La TABLA I recoge
un ejemplo. donde puede observarse que para ambos organismos coinciden los valores
de los factores de asimetría y de capacidad (ANEXO 1). mientras que para el factor de
resolución y el número de platos teóricos no es así y creemos necesario aclarar los
siguientes extremos:
a.- Factor de resolución:
2 (tr2·trl)
USP. R~ ......-------
Wbz~WbI

2 (t'z - tfJ)
EP R= --.--....--....... ---.-.-----
1.699 (W50%2 + W50%1)

-12 -
 0 .36
(a)
0 .3

0~ 5

0 .2

0 .l6 •
+
0. 1

• 6 7 8

O.l2r----- - - - - -- - -- - - -- ---,
(b )
0.1

0.08 ~
0.06

0.0'"'

0.0 2
I
- K · 0.2 -+-- K • 1.2

...g.... K • .,JI - - K· 10.2

FIGURA 1: (a) Representación de la distribución en 8 tubos y 2 fases de la

vitamina B 12 Y(b) representación de la separación en contracorriente de 5 soM os con
diferentes coeficientes de reparto.

- l3 -
 TABLA 1: Resultados del SST para la Farmacopea Europea (a) y para la
Farmacopea Estadounidense (b).

(a)
SYSTEM SUITABllJTY TEST

FILENAME: DRUGSI.RA W METHOD: DRUGS.FIL EP

INJECTED AT: 06:14:03 I I

PEAK RET. RESOLU110N TAlLlNG 11-1. PLATE CAPACITY

TIME FACTOR FACTOR NUMBER FACTOR

BARBITAL 2.22 1.13 12360 1.52

AMOBARBITA 4.85 27.46 1.09 29916 4.51
PENTOBARBI 5.30 3.93 1.05 32686 5.02
SECOBARB1T 7.54 18.23 \.09 54529 7.57
PHENOBARBI 7.85 2.41 1.13 59105 7.92
PROCAlNE 10.91 23.76 0.94 114165 11.40

(b)
SYSTEM SUITABILJTY TEST

FILENAME: DRUGSI.RA WMETHOD: DRUGS.FIL USP

INJECTED AT: 06:14:03 I I

PEAK RET. RESOLUTION TAILlNG TH.PLATE CAPACITY

TIME FACTOR FACTOR NUMBER FACTOR

BARBITAL 2.22 1.13 11727 1.52

AMOBARBITA 4.85 26.84 1.09 28960 4.51
PENTOBARBI 5.30 3.85 \.05 31211 5.02
SECOBARBIT 7.54 17.99 1.09 54662 7.57
PHENOBARBI 7.85 2.38 1.13 57454 7.92
PROCAlNE 10.91 23.81 0.94 119958 11.40

- 14-
 ANEXO 1: Otros parámetros recogidos en el texto según se definen en la
Farmacopea Estadounidense.

Tiempo de retención relativo corregido:

Los subíndices x, Oy st representan a un componente seleccionado, no retenido y

el estándar.

Factor de asimetría:

FA= (W5%)l2f

donde W5% es el ancho del pico al5 % desu altura sobre la línea base y fes la distancia
a esta misma altura desde el frente del pico hasta la vertical.

Factor de capacidad:

Fe= (tr/1,,) - 1

- 15 -
 Donde tr representa los tiempos de retención de los 2 componentes implicados en
el factor; Wb, su ancho en la base defiinido por el corte de las tangentes de los picos en
su punto de inflexión con la línea base (FIGURAS 2 Y 3); y W50% corresponde a su
ancho a media altura.
La constante 1.699 se estima, considerando los picos cromatográficos como
gaussianos, por la relación (Wb)l(W50%)= 40/2.3540= 1.699 [4].
b.- Número de platos teóricos:

b_- Numero de platos teóricos:

USP , NPT~ 16 (trlWb)2
EP: NPT~ 5.54 (trIW50%)2

Los aspectos cuali y cuantitativos se pueden simplificar también con la ayuda del
ordenador. Véase TABLA 2 con un ejemplo de un "report" cromatográfico antes y
después de su procesado con un método personalizado.

3.- Potenciometría
Los usuarios de esta técnica siempre han sentido la necesidad de conocer con rigor
el punto estequiométrico de una valoración potenciométrica. lo que se resuelve con las
funciones de derivadas de primer y segundo orden de las curvas de valoración. Hace
tiempo desarrollamos una aplicacióninforrnática ejecutable en una estación de datos no
compatible [7].
El programa comercial VESUV facilita esta operación dado que permite recibir
datos de un potenciómetro para que estos puedan ser procesados en un ordenador
compatible (FIGURAS 4-6 Y TABLA 3).

4.- Espectrofotometría
Aunque es difícil resumir las numerosas aportaciones de la informática en este
campo, trataremos de destacar algunas que habitualmente utilizamos:

a.- Archivos de datos o espectros de sustancias de referencia (espectrotecas)

Una de estas aplicaciones puede ser la informatización del método de Clarke para
la identificación de sustancias basado enel número de onda de las 3 bandas más intensas
de un espectro de infrarrojos en la región de 2000 a 600 cm-] [8J.
En la actualidad numerosos programas comerciales facilitan esta labor (por
ejemplo, el de Sigma-Nicolet para espectros de infrarrojos y el de Finigan para espectros
de masas).

b.- Representaciones tridimensionales para la resolución de muestras complejas

Traemos como demostraciones los "plots" isométricos empleados en cromatografía
de gases con detección de masas o en la de líquidos usando detectores de fotodiodos.

- 16 -
 FILENAHE : DRUGS1 . RAU NETHQD : DRUCS . FIL
Inj @cted at : 06 : 14 : 63 n_te Ot Jn j~~i on : / /

j peak :
r
I
I BRRBJTRL
I
4
I
i ~ Uid"th a"t 51i!~ :
r,
,r ~ 8 . 847 "i n .
I
,
I
\ i
1
IIJidth .;;¡t 5~ :

-
I
I

r,
i ¡
j i
,
8.181 Min .

~ Ba5e Uidth :
J
~

i
~
!

,r
¿ 4 j
i
0 . 0S2 Min .

2. . 15 2. 2 0 2 . 25 2 .30

FI GURA 2: Características del perfil cromalOgráfico del barbital tal como aparece
en la aplicación del comando visualización del SST.

FILEHAHE : DRUGS 1 . RAU HETHOD : DRUGS. FIL

lnject.d at : 06 : 14 : 8 3 Date of In ~;ectíon : / /

, I •
~
"
lPe-" ,
,I
, j RHOBRRBITR
,I
,r L

I
I
r lHdth at S0:O '
~ 8 . 866 "in .
, e
I
I

~
1
I LJidth at 5::t :
f 1 8 . 139 "in .
,
L
I
I i
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I
j Base II i dth '
e 8 . 114,.'¡n .
I

~
¿ l ::"

t I
4 . 75
¿ I

4 . 88
I
4 . 8S
~

I
4 . 85 S . tiMlin .

FIGURA 3: Características del perfil cromatográlico del amobarbital tal como

aparece en la aplicación del comando visuali zación del SST.

- 17 -
 TABLA 2: Repon cromatográfico usando el método de tiempos de retención
absolutos y de porcentaje de área (a) y usando el método de tiempos de retención
relativos corregidos (ANEXO 1) Y de estándar interno (b).

(a)
DISK FILE: DRUGSI.RAW FROM /6 .AJ INJECTED AT: 06: 14:03
eH= PS= I
FILE I METIlOD O RUN 2 INDEX 2

PEAK# AREA% RT AREABC

1 0.337 0.88 82401

2 9.919 2.22 24264 01
3 0.653 3.25 159801
4 0.472 3.66 115501
5 0.269 4.24 65602
6 3.083 4.4 754303
7 11.836 4.85 2895301
8 29.732 5.3 7273001
9 2.715 5.84 664101
10 1.79 6.19 4377 01
1I 5.095 7.54 12463 01
12 5.568 ;7.85 1362201
13 0.194 8.3 47301
14 5.774 8.96 1412401
15 6.532 9.55 15979 01
16 4.836 9.93 1183001
17 1. 10.91 244602
18 2.082 11.06 509403
19 8.113 11.49 1984501

TOTAL 100. 244617

- 18-
(b)
DISK FILE: DRUGSI.RAW FROM / 6.AJ INJECTED AT: 06: 14:03

DRUGS OF ABUSE CH= PS= 1

FILE 1 METHOD 5 RUN 2 INDEX 1

ANAL YST: BILL WHlTE

NAME UGIML RT AREABC RF RRT

BARBITAL 100. 2.22 24264 01 242.64 0. 303

2 O. 3.25 159801 0.536
3 O. 3.66 1155 01 0.629
4 O. 4.24 65602 0.76
5 O. 4.4 754303 0.796
6 O. 4.85 2895301 0.898
AMOBARBITA 100. 5.3 7273001 727.3 1.
PENTOBARBI 100. 5.84 664101 66.41 1.1 22
9 O. 6.19 4377 01 1.201
10 O. 7.54 1246301 1.507
11 O. 7.85 1362201 1.577
SECOBARBIT 100. 8.3 473 01 4.73 1.679
PHENOBARBT 100. 8.96 1412401 141.24 1.828
14 O. 9.55 1597901 1.962
15 O. 9.93 11 8300 1 2.048
16 O. 10.91 244602 2.269
17 O. 11.06 509403 2.303
PROCAINE 100. 11.49 1984501 198.45 2.4

TOTAL 600. 243793

NEW FILE:
NAME RF RT
BARBITAL 242.64 2.22
AMOBARBITA 727.3 5.07
PENTOBARBI 66.41 5.57
SECOBARBIT 4.73 7.92
PHENOBARBI 141.24 8.4
PROCAINE 198.45 11 .49

- 19 -
,pIJ)

9 . S0r
l --------------------------------------------~

I, I
II Grupo
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Prof Slt"Ial
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9 , 00 08/ 12/1991

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6 . 50 ,
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S 00 ¡I "'"''''' , ...~,.

5,50LI----~--~--~----+_--~----~--~--__----+_'_·,__4
0 . 0000 . 500 1 . 000 1 . 500 2 . 000 2 . 500 3. 000 3500 -4 . 000 4 .500 5 . 000 U/nI

FIGURA 4: Ejempl o de curva pOlenciométrica de orden cero.

-20 -
 [DHl

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7.60 t
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1
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I
/
,.
I
'i

2 . 300 2 . 400 2 . 500 2,600 2 . 700

FIGURA 5: Aspecto ampliado de la curva anterior,junto con su primera y segunda

derivada, en la que se observa el error cometido en la determinación automática del
punto estequiométrico,

- 21 -
 IpH1

9.50r¡----------------------------------------------'1
:
1

9 .00 ;----~-__
II P,"of S JM3 1
Grupo 1 d@ práct
08/ 12/I99t
, -~
-'-"- "o
,
l'

B . 50 ~
,
\

,
7 . 00 +

6 . 50 ~
,
i
¡
6 . 00 ~

5 . 50~------------~--------~--~--~----~------~
0 .000 0 . 500 1 .000 1 . 500 2 . 000 2 .500 3 000 3 . 5004.000 4 500 5.000 U/ t11

FIGURA 6: Nuevo aspecto de la gráfica inidal. a la que se ha incorporado las

curvas de primera y segunda derivada, así como el pumo estequiométrico antes y
después de la correción.

- 22 -
 ~BLA 3: Report de valoración potenciométrica: (a) antes y (b) después de la
correccIón del punto estequiométrico COn la función de segunda derivada
(b)
<a) METROHM 682 TIl'RA1DR
METROHM 6821TTRA1DR
date 01 -04-01 time 22: 17
date 01-04-01 time 22: 17
GET pH •••••• ** # 7 GET pH *****"** # 7
COO 1
COO 1
duinmy sample size!
dummy sample size!
pH(init) 9.05
pH(inil) 9.05 V/m! pH
V/mI pH
EPI 2.460 7.55
EPI 2.460 7.55
RS1 .2460
RSI .2460
stop V reached
stop V reached ""=;;;;;=
====
GET pH ******"'* # 7
GET pH ******** # 7
V/mI pH
V/mI pH
.000 9.07
.000 9.07
.142 9.05
.142 9.05
.284 9.04
.284 9.04
.427 9.02
.427 9.02
.569 9.01
.569 9.01
.711 8.99
.711 8.99
.853 8.97
.853 8.97
.995 8.94
.995 8.94
1.137 8.90
1.137 8.90
1.280 8.86
1.280 8.86
1.422 8.81
1.422 8.8 1
1.564 8.76
1.564 8.76
1.706 8.69
1.706 8.69
1.848 8.61
1.848 8.61
1.991 851
1.99 1 8.51
2.133 8.39
2.133 8.39
2.275 8.23
2.275 8.23
2.417 7.89
2.4 17 7.89
2559 6.95
2.559 6.95
2.702 6.73
2.702 6.73
2.844 6.59
2.844 6.59
2.986 6.48
2.986 6.48
3.128 6.39
3.1 28 6.39
3.270 6.3 1
3.270 6.31
3.412 6.24
3.412 6.24
3.555 6.17
3.555 6.17
3.697 6.10
3.697 6.10
3.839 6.04
3.839 6.04
3.981 5.98
3.981 5.98 5.92
4.123
4 .123 5.92 4.266 5.86
4.266 5.86 4.408 5.81
4.408 5.8 1 4 .550 5.74
4.550 5.74 4.692 5.68
4.692 5.68 4.834 5.62
4.834 5.62
- - - =====
--- USER-EP FOR REPORT #12.477 ml:7.50 pH

- 23 -
 , . ~l I~, ~-;' ;:""'> 16 ·1 1 I.';¡-¡
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FIGURA 7: Repr~sclltacióll tridimensionat (a) y hidim~nsiollal (h) de hexano, en el que se ohservan aquellas zonas
transparentes utilizahles para la identificación y cuantifkacilÍn de analilos extraíh lcs con este medio (tomada del proyecto de tesis
de M. I.(¡pez de Alda),
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FIGURA 8: Representación tridime nsional (a) y bidimensional (b) de otra calidad de hexano, poniendo de manifiesto la
adecuación o no del solve nte (tomada del proyecto de tesis (le M , 1.6pcz de Alda).
 En este campo quisieramos mostrar como se simplifica la interpretación de 50
espectros de fluorescencia sincron mediante la combinación de tres tipos de programas:
el de la casa comercial que permite adquirir los espectros y exportarlos en formato
ASCII (American Standard Code for lnformation Interchange). el escrito en turbobasic
por nosotros para la obtención de un fichero adaptado a las condiciones de lectura que
impone el tercero de los programas -el programa SURFER- (FIGURAS 7 Y 8).

CONCLUSIONES

Con estos ejemplos y otros que puedan surgir en el coloquio que sigue a esta mesa
redonda. cn:emos haber puesto de manifiesto las grandes posibilidades del ordenador
en el campo del análisis instrumental.

REFERENCIAS

[!] Simal Gándara. M.; Sima! Lozano . J. y Simal Gándara. 1. "Simulación de la

distribución a contracorriente por ordenador" . Técnicas de Laboratorio. XIV ( 170).
Abril-!992,194-201.
[2] Sima! Gándara, J.; de la Montaña Miguélez, J.; Paseiro Losada. P. y Simal Lozano.
J. "La adquisición de datos en cromatografía y su procesado mediante ordenador
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[3] Simal Gándara, J.; de la Montaña Miguélez. J.; Paseiro Losada. P. y Simal Lozano.
J. "Dos programas que facilitan el tratamiento de datos en cromatograiIa". Técnicas
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[4] Simal Gándara. J.; de la Montaña Miguélez, J.; Paseiro Losada. P. y Simal Lozano.
1. "Determinación de la eficacia en sistemas cromatográficos: aplicación a los
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[5] Farmacopea Estadounidense (USP): XX Edición I Formulario Nacional (NF): XV
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[6] Farmacopea Europea (EP). Consejo General de Colegios Oficiales de Farmacéuti-
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[7] Sima! Gándara, J.; Simal Lozano. 1. y Paseiro Losada. P. "Aplicación de las
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[8] Paseiro Losada, P. ; Sima! Gándara. J. y Simal Lozano. J. "Informati zación del
método de Clarke para la identi ficación de fármacos utilizando datos deinfrarrojos'·.
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