TRATAMIENTO BIOLÓGICO PARA LA DECOLORACIÓN DE EFLUENTE CELULÓSICO

UTILIZANDO TRAMETES VERSICOLOR

José Ramos C. & Carolyn Palma T.

Universidad Técnica Federico Santa María
Abstracto: La presencia de lignina en los efluentes de la industria de la celulosa, es un problema ambiental que
ha sido parte de múltiples investigaciones. Los tratamientos biológicos son una alternativa económica para la
remoción de color. Por ende, en el presente trabajo se evaluó el efecto de Trametes versicolor, hongo
ligninolítico, cuya secreción de enzima Laccasa es capaz de degradar el polímero. Se experimentó con dos
concentraciones de RIL en dos medios de cultivos, uno natural (MT) y otro químico (MS). Los resultados
arrojaron un mayor porcentaje de decoloración en MS con 25% v/v de RIL, alcanzando un 79% de decoloración.
Sin embargo, en MT se obtuvieron mejores eficiencias entre el consumo de glucosa y actividad enzimática.
Keywords: Efluente celulósico, lignina, decoloración, Laccasa, Trametes versicolor.

1. INTRODUCCIÓN dispuestos en las zonas marítimas o ríos, son

El proceso manufacturero de la industria del papel
y celulosa, envuelve tres etapas generales: El área
de pulpado; blanqueo de la pulpa; y el “paper
making”, proceso donde se convierte la celulosa en
los distintos tipos de papeles y productos finales
[1]. El interés de este Paper, recae en la primera
etapa donde se generan altos volúmenes de efluente
cuya composición dependerá del tipo de proceso
que se lleve a cabo. El más utilizado, debido a su
bajo costo y alta eficiencia en conjunto a la calidad
final del producto [2] es el pulpado Kraft, donde se
cuecen las astillas de madera en una solución
alcalina (licor blanco, LB) de hidróxido de sodio
(NaOH) y sulfato de sodio (NaS2) a alta
temperatura y presión hasta convertir los chips en
una masa fibrosa, llamada celulosa cruda.
Como consecuencia de la cocción de las astillas, se
generan elevados volúmenes de efluente, que más
bien, es una solución de distintos componentes
residuales de la degradación de la madera como, la
hemicelulosa, compuestos fenólicos, ácidos grasos
y taninos, llamado licor negro (LN) [3]. Más aún,
existe otro elemento que compone cerca del 50%
de este residuo industrial líquido (RIL),
otorgándole una fuerte coloración café oscuro,
llamado lignina. Este polímero aromático, es una
mezcla de compuestos polifenólicos generando una
compleja estructura química, formando parte del
10-15% del total del efluente final, pero
contribuyendo al 90-95% de la carga contaminante
del RIL celulósico y al 85% de la coloración final
de éste [2].
Por ende, dentro de los principales problemas que
conlleva el alto contenido de lignina en los RILes
aquellos relacionados con la pérdida de
transparencia de las aguas y así obstruyendo el paso
de luz a través de las primeras capas hacia la zona
fótica, pudiendo generar graves problemas en la
fauna marina, afectando de forma sustantiva la
reproducción y metabolismo de microorganismos y
otras formas de vida, como los fitoplancton, que
requieren de su proceso fotosintético para
desarrollarse [4]. [5] Demostraron estos hechos,
respecto a la reducción de transparencia de agua
debido a la presencia de RILes celulósicos,
resultando en una reducción de la superficie
ocupada por lechos de pastos marinos y un
aumento considerable en el área ocupada por lodos.
Esto a su vez, altero la composición de las especies
de la zona y redujo considerablemente la población
total de fauna marina.
Sin embargo, debido a su compleja estructura
natural, la lignina exhibe una alta resistencia a la
degradación química y biológica, suscitando el
mayor obstáculo para la decoloración del efluente
gestado, de esta forma, los tratamientos de aguas
para la reducción de: Demanda biológica y química
de oxígeno; sólidos suspendidos; compuestos
orgánicos; ácidos grasos entre otros, no producen
un efecto sustantivo en la degradación y
eliminación de lignina presente en el RIL.
Sin embargo, aquellos que, si generan un efecto
considerable en la reducción de color del RIL, no
han sido tomados aún como una alternativa real,
debido a los altos costos de inversión y
funcionamiento que requieren. Entre los que han
demostrado ser más efectivos se muestran en la
Tabla 1.
Tabla 1. Tecnologías utilizadas para la remoción o
degradación de lignina en RILes celulósicos, y sus
respectivas efectividades.
Remoción
Tecnología Referencia
color (%)
Membranas 90 [2]
(Nano
filtración). 99,2 [2]
Oxidación 99 [7]
avanzada 99 [8]
Adsorción
(carbón
>90 [9]
activado,
15 g/L.)
Ahora, si se amplía la gama a los tratamientos
biológicos, se encuentra uno de los métodos más
efectivos y de bajo costo para la degradación de
lignina. Se trata de los hongos de pudrición blanca,
cuya producción de enzimas ligninolíticas (Lacaca,
Manganeso Peroxidasa (MnP), Lignino Peroxidasa
(LiP)) han sido objeto de múltiples estudios, desde
la factibilidad de generación de enzimas en
distintas condiciones de temperatura, pH y
nutrición, hasta la inmovilización del
microorganismo para la extracción del producto
que permite degradar el polímero [10].
Este tipo de hongos producen enzimas
inespecíficas que oxidan los diferentes radicales
sustituyentes y los anillos aromáticos que
componen la lignina, generando radicales
catiónicos libres que pueden continuar el proceso
degradativo hasta darse una mineralización
completa formando agua y CO2 [11].
El foco de estudio, será la producción de enzima
Laccasa a través del crecimiento de Trametes
versicolor, debido a varios estudios que han
demostrado buenos resultados en degradación de
lignina tanto en RILes textiles [12], como en RILes
celulósicos [10], [13].
Sin embargo, los efluentes generados en cada
industria, poseen distintas propiedades y mezclas
de compuestos químicos, que pueden diferenciar
sus resultados a otros estudios similares. Es por
esto, que el siguiente Paper tiene como objetivo
mostrar los resultados obtenidos para la
decoloración de un RIL celulósico, generado en
una empresa ubicada en la Séptima Región de
Chile, cuyo fundamento teórico es la degradación
de la lignina mediante la secreción de enzima
Laccasa a partir de Trametes versicolor, crecido en
un medio de cultivo químico (salvachua) y un
medio natural (solución de salsa de tomate).
De esta forma, comparar la eficiencia de ambos
procesos y posteriormente, determinar si es factible
desarrollar la incubación del hongo en un medio de
cultivo más económico, como la salsa de tomate.
2. MATERIALES Y MÉTODOS
2.1. Preparación de RIL celulósico.
Se recepcionó cierta cantidad de RIL celulósico
perteneciente a la empresa Celulosa Arauco y
Constitución S.A., almacenándose en una cámara
de frío para mantener sus propiedades invariables
durante todo el proceso experimental. Las
cantidades de RIL a utilizar en los experimentos, se
filtraron utilizando 3 papeles filtros de 0.45 𝜇𝑚,
superpuestos, en un embudo Büchner, sobre un
matraz Kitasato, con el objetivo de colocar una
manguera conectada a una bomba de vacío, y así,
favorecer el filtrado del RIL.
2.2. Cultivo sólido.
Se utilizó una cepa de Trametes versicolor
(Universidad Técnica Federico Santa María,
Campus Santiago), la que fue reactivada en 4
placas Petri que contenían: g/L (extracto de malta
30; peptona 5; agar 15) ajustado a un pH de 7.6. Por
cada placa se sembraron 10 esporas de 5 mm de
diámetro, y se incubaron por 8 días a 30°C.
2.3. Preparación de micelio.
Para el crecimiento y desarrollo propicio del
microorganismo, se prepararon tres matraces
Fernsbach (Erlenmeyer de 2 L) con 200 ml de
medio de cultivo salvachua: g/L (glucosa 20;
FeSO4 ∙ 7H2 O 0.2; (NH4)2SO4 4.5; KH2PO4 4.5;
corn steep solids 13.5; CaCO3 3.5) y 1.3 ml de
soybean oil, ajustado a un pH de 5.6 utilizando
NaOH 10N. En cada uno de los matraces
Erlenmeyer se inocularon 10 esporas de 5 mm de
diámetro, de las placas Petri anteriormente
descritas, y se llevaron a incubación durante 8 días
a 30°C sin agitación. Al octavo día se trasvasijaron
cada uno de los cultivos a una juguera para
triturarlo y refrigerarlo hasta la formación del
cultivo sumergido.
2.4. Cultivo sumergido - reacción. Tabla 4. Reactivos utilizados para la formación
del medio de cultivo para cada experimento.
Se realizaron 4 cultivos sumergidos diferentes (en
triplicado), cuyo propósito fue el crecimiento del MS25 MS50 Control
hongo y la secreción de su enzima Laccasa, Reactivos [g]
250 ml 200 ml 300 ml
además, se añadió directamente el RIL en estudio. Glucosa 7.7 10 22.2
Cada cultivo se realizó en matraces Erlenmeyer de FeSO4 ∙ 7H2 O 0.1 0.1 0.2
250 ml, cuyas composiciones (micelio triturado + (NH4)2SO4 1.7 2.3 5.0
RIL + medio de cultivo) se muestran en la Tabla 2 KH2PO4 1.7 2.3 5.0
y Tabla 3. corn steep
5.2 6.8 15.0
solids
La preparación del medio salvachua* para MS25 y
CaCO3 1.3 1.8 3.9
MS50 se indican en la Tabla 4, cada volumen
soybean oil (ml) 0.5 0.7 1.4
indicado se destina para cada medio en triplicado.
Mientras que las soluciones de salsa de tomate se Ajustar a un pH de 5.6 utilizando NaOH 10N.
realizaron en una proporción de 85% v/v de agua y
15% v/v de salsa. Para MT25 se prepararon 250 ml, 2.6. Mediciones – barrido espectral.
para MT50 se prepararon 200 ml y para el control
biótico 300 ml (todos en triplicado). Las mediciones realizadas para obtener las curvas
espectrales, se dividen en dos partes. La primera se
Ya preparados los 18 cultivos sumergidos en atañe a los barridos del cultivo químico y natural en
matraces Fernsbach (3 MS25, 3 MS50, 3 MT25, 3 el día cero (sin el RIL), con estos se pudo establecer
MT50, 3 controles bióticos naturales, 3 cultivos una línea base para las demás curvas que,
bióticos químicos), se incubaron sin agitación, representaron la espectroscopía del cultivo
durante 12 días a 30°C, y se muestreó 1 ml de cada sumergido (medio de cultivo + RIL + Micelio).
matraz diariamente para realizar las mediciones
correspondientes. De esta forma, se logró determinar la decoloración
efectiva del RIL, producto de la degradación de
lignina. La segunda parte compete a la medición
2.5. Extracción y preparación de las muestras. espectroscópica realizada a las muestras extraídas
diariamente, a cada uno de los cultivos de reacción.
Diariamente se extrajo 1 ml de muestra de cada
cultivo sumergido, que se disponían en tubos Cada medición se realizó en un equipo
Eppendorf de 1.5 ml, para permitir el centrifugado espectrofotómetro UV-Visible, en cubetas de paso
de la muestra y así poder extraer sólo el óptico 1 cm, agregando una proporción de 10% v/v
sobrenadante. muestra – 90% v/v agua (1 ml total), para obtener
curvas espectrales que no superasen absorbancias
Tabla 2. Composición de los cultivos sumergidos, de 0.8, así cumpliendo la Ley de Beer-Lambert.
utilizando medio nutritivo salvachua.
2.7. Mediciones – Actividad enzimática.
Medio salvachua - Medio salvachua - Para detectar y cuantificar el desarrollo de la
25% RIL (MS25) 50% RIL (MS50)
actividad enzimática de Laccasa, se mide la
Compuesto ml Compuesto ml absorbancia detectada a 436 nm, en el segundo 0, 5
Micelio 10 Micelio 10 y 10, de una mezcla compuesta de 500 𝜇𝐿 de
RIL 25 RIL 50 muestra (desde el día 1 – día 6), con 250 𝜇𝐿 de
Salvachua* 65 Salvachua* 40 reactivo ABTS (concentración: 20 mM; cuyo
1
factor de extinción molar es 29300 ), y 250 𝜇𝐿
𝑀𝑐𝑚
Tabla 3. Composición de los cultivos sumergidos, de acetato buffer pH 5 (200 mM). Mientras, que
utilizando medio nutritivo salsa de tomate. para los días 7 a 12, se disminuyó la cantidad de
muestra analizada a 250 𝜇𝐿, debido al incremento
Medio tomate - Medio tomate - de actividad enzimática, y por ende, de la
25% RIL (MT25) 50% RIL (MT50) absorbancia medida (debe cumplir con la Ley de
Compuesto ml Compuesto ml Beer-Lambert). La cantidad de buffer sube a 500
Micelio 10 Micelio 10 𝜇𝐿, manteniéndose los 250 𝜇𝐿 de ABTS.
RIL 25 RIL 50
S. Tomate 65 S. Tomate 40
La mezcla se agitó breve y rápidamente, ya que, qué tipo de nutriente es más efectivo en el
comienza a reaccionar de inmediato y la actividad desarrollo y crecimiento del microorganismo.
enzimática es detectada.
2.8. Mediciones – glucosa.
Para medir la concentración de glucosa en el
cultivo sumergido, se formó 1 ml de solución
compuesta de 10% v/v de muestra y 90% v/v de
reactivo DNS (3,5 dinitrosalicílico) (durante los
días 1-6) y de 20% v/v de muestra y 80% v/v de
DNS (durante los días 7-12), en tubos de ensayos.
Luego, se llevó a calentar en baño maría durante 5
minutos en agua a ebullición, para después Figura 1. Decoloración de RIL celulósico por
enfriarlo rápidamente, evitando la continuación de Trametes versicolor en cultivo de reacción MS25.
la reacción cromóforo. Por último, se extrajeron 3 ( ) Glucosa mg/ml, ( ) Decoloración %.
ml de cada tubo de ensayo y se llevaba a medición
en el equipo espectrofotómetro UV-Visible,
midiendo la absorbancia a 540 nm.
2.9. Mediciones – Lignina.
Se midió la absorbancia a 320 nm de una solución
de 1 ml (25% v/v de muestra y 75% v/v agua), en
el día 0 y en el día 12. Las muestras se tomaron de
los matraces con los cultivos de reacción formados
con el RIL + medio de cultivo + micelio triturado.
Luego para obtener los valores porcentuales de Figura 2. Decoloración de RIL celulósico por
lignina se utilizó el método que aparece en la Trametes versicolor en cultivo de reacción MS50.
página 9 de [14]. ( ) Glucosa mg/ml, ( ) Decoloración %.

3. RESULTADOS Y CONCLUSIONES

3.1. Concentración de glucosa.

Como se observa desde la Figura 1 hasta la Figura
4 la concentración de glucosa en los cultivos
químicos se reduce hasta cero en el día 6 a 7,
mientras que, para el cultivo sumergido con salsa
de tomate, llega al mínimo entre los días 4 y 5. Se Figura 3. Decoloración de RIL celulósico por
espera que la actividad enzimática llegue a sus Trametes versicolor en cultivo de reacción MT25.
niveles más altos alrededor los días mencionados. ( ) Glucosa mg/ml, ( ) Decoloración %.

De estos resultados se pueden concluir ciertos

aspectos, como el crecimiento exitoso de los
microorganismos inoculados en ambos medios de
cultivo, permitiendo la secreción de Laccasa a
partir del decaimiento en los niveles de nutrientes
necesarios para su desarrollo y metabolismo. Sin
embargo, es posible determinar, que la pendiente
de consumo en el medio químico es más inclinada,
conllevando a dos suposiciones: (1) Prefiere el
nutriente a partir de medio químico salvachua para
Figura 4. Decoloración de RIL celulósico por
su desarrollo, por ende, lo consume más rápido. (2)
Trametes versicolor en cultivo de reacción MT50.
Sin embargo, se deberá esperar los resultados de la
actividad enzimática producida, para determinar ( ) Glucosa mg/ml, ( ) Decoloración %.
 𝑦𝑔𝑙𝑢𝑐𝑜𝑠𝑎=0 − 𝑦𝑔𝑙𝑢𝑐𝑜𝑠𝑎=𝑚á𝑥
𝑚𝑥 = (1)
𝑥𝑔𝑙𝑢𝑐𝑜𝑠𝑎=0 − 𝑥𝑔𝑙𝑢𝑐𝑜𝑠𝑎=𝑚á𝑥
∗ 𝑚𝑀𝑆25 = -5,502 ∗ 𝑚𝑀𝑆50 = -6,102
∗ 𝑚𝑀𝑇25 = -3,246 ∗ 𝑚𝑀𝑇50 = -3,134
De todas formas, se observa un crecimiento exitoso
(a priori).
3.2. Actividad enzimática.
Se observó un crecimiento de la actividad
enzimática desde el día 3 para el cultivo sumergido
con salvachua, alcanzando un peak en el día 7 para
MS50 y en el día 8 para MS25. Por otro lado, en
los cultivos con salsa de tomate, se alcanzan peaks
en los días 6 y 7 para MT50 y MT25
respectivamente, es decir, un día antes que para el
medio químico. Los niveles de secreción de
Laccasa alcanzaron los valores mostrados en la
Tabla 5.
A partir de los datos expuestos en la tabla, se
esclarece que: Si bien, la concentración inicial de
glucosa en MS fue mayor (casi el doble) en
comparación con MT, la riqueza del nutriente
pareciera ser mayor en el medio de tomate
preparado, ya que la actividad enzimática de MS25
sólo supera en 29,3 U/L a la Laccasa producida en
MT25, siendo la concentración inicial de glucosa
en MS25, más del doble que en MT25. Más aún, se
observa que la actividad enzimática en MS50 fue
bastante menor en comparación con MT50, por lo
tanto, se concluye que el medio de cultivo natural,
tiene mejores efectos sobre la capacidad de
secreción enzimática de Trametes versicolor. Este
punto podría afectar de forma positiva en la
decoloración del RIL, suponiendo que la mayor
decoloración se verá en MS25, seguida por MT25,
MT50 y muy por debajo a MS50.
3.3. Decoloración.
Tal como muestra la Figura 1, la decoloración total
que experimenta el RIL en MS25 fue cercana al
80%, mientras que en MS50 fue mucho más baja,
superando apenas el 25%.
Tabla 5. Peak de actividad enzimática detectada
para cada cultivo de reacción.
Cultivo sumergido Act. enzimática [U/L]
MS25 420.205
MS50 225.42
MT25 390.96
MT50 386.25
Por otro lado, los cultivos sumergidos con medio
natural de tomate superaron el 60% de
decoloración en el caso de MT25 y 45% para
MT50.
Sin embargo, una característica inherente a la
decoloración del RIL, es la presencia de un
fenómeno de adsorción del polímero al micelio
triturado, reflejado claramente en una primera
etapa, cuando el nivel de glucosa aún está a
concentraciones lejanas del cero terminal y el
consiguiente aumento en la decoloración del RIL.
La cuantificación de la adsorción (paralela al
crecimiento del microorganismo) y degradación es
justamente uno de los objetivos de la investigación,
siendo analizado en MS25 y MT25, ya que, fueron
los experimentos con mejores resultados y más
cercanos a lo esperado.
En el caso de MS25 (Figura 5), se observa una clara
decoloración por adsorción hasta el día 4, llegando
a niveles de un 24,5%. A partir de este día, el
microorganismo va consumiendo de forma crítica
la fuente nutritiva (glucosa), activando la secreción
de enzima ligninolítica, inciando la decoloración
por degradación, llegando a su peak en el día 8,
donde la actividad enzimática es máxima. Luego,
la producción de Laccasa comienza a decaer,
generando una disminución en la pendiente
creciente de decoloración.
Por otro lado, los resultados expuestos en la Figura
6, permiten decretar como un hecho que existe una
fase de adsorción antes del inicio de la actividad
enzimática. Con un posterior incremento de la
decoloración producto del peak de producción de
Laccasa y finalmente un descenso en ella.
Cabe destacar que en ambos casos (además de
MS50 y MT50, se pueden verificar en las Figura 2
y Figura 4), existen descensos en el porcentaje de
decoloración obtenido, lo que responde
esencialmente al proceso natural de desorción de
Figura 5. Decoloración de RIL celulósico por
Trametes versicolor en cultivo de reacción MS25.
( ) Act. Enzimática. mg/ml, ( ) Decoloración %.
lignina en el micelio, como consecuencia del
metabolismo del microorganismo. Por último, es
importante establecer 3 conclusiones principales de
la investigación:
(1) Si bien, en MS25 se obtuvo la mayor
decoloración del RIL, pareciera que el micelio
se nutre de mejor forma con el medio cultivo
natural de tomate, ya que, la pendiente del
consumo de glucosa es menor (se alimenta
lentamente), sin embargo, su producción de
Laccasa, en términos proporcionales, es
mucho mayor que en el medio químico de
salvachua. Por lo tanto, en este sentido se
recomendaría utilizar un medio natural de
tomate como fuente de alimentación para
Trametes versicolor.
(2) Cada uno de los experimentos entregó
evidencias suficientes de la influencia de la
adsorción de lignina en el micelio. Ahora bien,
se pudo observar que en promedio la
decoloración por medio de este fenómeno, no
supera el 20%, porcentaje bastante relevante.
3.4. Biodegradación de lignina.
Mediante el procesamiento de datos, para la
cuantificación de lignina en el día 0 y 12, se
obtuvieron los siguientes porcentajes de
degradación de lignina, %: MS25, 53; MS50, 21;
MT25, 46; MT50, 32.
(3) Por lo tanto, se determinó que es factible
biodegradar lignina utilizando Trametes
versicolor, en ambos medios de cultivo, con
mejor eficiencia (proporcional) en el jugo de
tomate. Sin embargo, se cree posible poder
mejorar tanto la decoloración del RIL como la
degradación de la lignina, ya que, tal como se
ha demostrado en [10] y [12].
Figura 6. Decoloración de RIL celulósico por
Trametes versicolor en cultivo de reacción MT25.
( ) Act. Enzimática mg/ml, ( ) Decoloración %.
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