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MATERIALES Y MÉTODOS
por Hamburguesa y Hamilton ( S1), y nos basamos nuestra sistema de estadificación del pinzón en él.
Sin embargo, el pollo (un pájaro precoces, orden Galliformes) es bastante divergentes de
pájaros cantores, tales como los pinzones (aves altricial, orden Passeriformes). No sólo es su
período de incubación diferentes, pero también diversos aspectos de la embriogénesis avanzan a distinto
las tasas relativas de los pinzones en comparación con el pollo. Por lo tanto, hemos utilizado marcada con DIG
sondas de ARN antisentido contra varios genes conocidos por estar involucrados en craneofacial
desarrollo para establecer etapas en las que, en particular, los primordios craneofacial pinzón
correspondido a diversas etapas en el desarrollo de pollo como se refleja en los patrones de expresión.
Para tener acceso a un gran número de embriones, hemos hecho uso de una especie fácilmente disponibles
de pájaros cantores, la Zebra Finch ( Taeniopygia guttata) que tiene una incubación idéntica
periodo de pinzones de Darwin. Mientras que originalmente la intención de aislar sondas para esta Finch
propósito, descubrimos que las sondas dirigidas contra genes de pollo fácilmente-reaccionaron cruz
con embriones Zebra Finch, por lo que aquellos fueron empleados para todas las hibridaciones. Residencia en
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estos datos moleculares, así como características craneofaciales morfológicos, hemos sido capaces de
desarrollar un sistema de estadificación robusto para Finch desarrollo craneofacial (Fig S1;. S2).
El examen posterior de los embriones del pinzón de Darwin verificó que su craneofacial
Bajo un acuerdo con el Parque Nacional Galápagos, recibimos las cuotas de recogida de embriones de Geospiza
G. difficilis y olivacea Certhidea en las islas de Santa Cruz y Genovesa. los machos que cantan y sus nidos fueron
identificados al comienzo de la estación húmeda. Después de la cría había comenzado nidos se verificaron todos los días.
Pinzones de Darwin hembras ponen garras de 3-5 huevos, uno por día. Para evitar la interrupción de la cría, se recogieron
sólo el tercer huevo que se establezcan y se incubaron al 100 o F. Los embriones se recogieron a E5 (st.26) y E6.5 (st.29) de
acuerdo con nuestra serie altricial puesta en escena desarrollo aviar. La serie de estadificación para el desarrollo songbird se
describirá en detalle en otra parte. material embrionario se fijó en 4% de paraformaldehído en tampón fosfato salino (PBS)
durante 2-3 horas a temperatura ambiente y se almacenó en el reactivo RNAlater (Ambion) a aproximadamente 5 o C durante
2-5 semanas. Las cabezas se rehidrataron en PBS, se congelaron en OCT y se saggitally cryosectioned medial (Fig. S3).
ribosondas antisentido polluelo se prepararon y utilizaron en embriones Finch de Darwin como se ha descrito previamente ( S2)
( Fig. S4). Se analizaron 19 jefes de pinzones de Darwin: G. magnirostris ( N = 3), G. fortis ( N = 4), G. fuliginosa ( N = 4), G.
conirostris
(N = 3), G. scandens ( N = 2), y G. (difficilis N = 3). Un polluelo bmp4 sonda se utilizó para en el lugar hibridaciones.
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manipulaciones de embriones de pollo y el análisis estadístico
Los huevos fertilizados se obtuvieron de SPAFAS (Norwich, CT), se incubaron a 100F, y se organizaron los embriones de
acuerdo con la hamburguesa y Hamilton ( S3). El RCAS :: bmp4 y RCAS :: Vaso constructos se han descrito previamente ( S4,
S5). Para infectar embriones para estudios in vivo que o bien inyectamos la parte distal del proceso frontonasal de embriones
de pollo st.24 o virus concentrado de alto título agrupados en el espacio semicerrado que rodea la cabeza de la etapa 15
embriones. RCAS (B) :: AP (fosfatasa alcalina) virus de alto título similares representada infección del epitelio y dermis
subyacentes de la cabeza después de 36 horas de infección (etapa 20) y 48 horas (etapa 22) (no mostrado) que varió de
irregular (10-20% de la superficie de la cabeza) al fondo (60-70% de la superficie de la cabeza). Los embriones infectados se
recogieron en las etapas 30 y 36, fijado durante la noche en paraformaldehído al 4% en PBS y se congelaron en OCT para la
sección sagital. Las cabezas de embriones fueron fotografiados y medidos en NIH Image 1.62. Estas unidades arbitrarias
fueron utilizados para el análisis de la función de la varianza (ANOVA caja de herramientas) en Excel X para calcular las
desviaciones estándar y pvalues para los datos. Para los huevos de etiquetado BrdU de la etapa 30 de tipo salvaje y los
embriones de pollo infectados se inyectó con 300 metro l de 50 metro g / ml de BrdU y se incubaron durante 60 minutos.
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Leyendas de las figuras SOPORTE
Adicional Figura 1.
Comparación del desarrollo prenatal de altricial (pájaros cantores, orden Passeriformes) y precoces (aves de corral, Orden
Galliformes) y la serie de puesta en escena de los pájaros cantores. Las comparaciones de tamaño de embriones del pinzón de
cebra ( T. guttata) y pollo ( G. gallus) de Hamburger-Hamilton ST.18 (A), st.24 (B) y st.26 (C). (D) Una parte de la serie de estadificación
Zebra Finch utilizado para la etapa embriones de pinzones de Darwin. Tenga en cuenta, que el tiempo de incubación de
T. guttata es idéntica a la de todas las especies de Darwin pinzones. (E, F) Las diferentes estructuras, como las extremidades y las
mandíbulas, se desarrollan a diferentes velocidades relativas de pájaros cantores y aves de corral. Por lo tanto, se utilizaron los
datos moleculares para correlacionar etapas de desarrollo craneofacial entre T. guttata y G. gallus, por ejemplo, patrón de expresión
de Shh en embriones de pollo y Zebra Finch. (G, H) Los patrones de expresión de Tbx2
C; 1 mm en E, F; 0,1 mm en G, H.
Adicional Figura 2. (AD) diferencias específicas de las especies aparecen relativamente pronto durante el desarrollo y se
mantienen en los embriones de G. scandens a medida que desarrollan picos largos y poco profundos y puntiagudas y estas
características específicas de las especies son fácilmente reconocibles por la etapa 33 en embriones de G. scandens ( SEGUNDO),
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Adicional Figura 3.
cabezas embrionario de la etapa 26 embriones de pinzones de Darwin seccionadas y mostradas en la Figura 1B. ( AF) Lider
como se revela por la presencia de la bolsa de Rathke la (RP; punta de flecha roja) y la apertura telencephalic (te). Tanto la
parte superior (UB) y picos (lb) inferiores se muestran. Muy alta Nomarski se utilizó de manera que las secciones de bajo
fondo podrían ser fotografiados a bajo aumento. La intensidad es un reflejo de la densidad celular y no de bmp4 señal. Las
barras de escala: 1 mm en A.
Adicional Figura 4.
( UN) Las seis especies de Geospiza mostrar formas distintas pico y tamaños. ( SEGUNDO) bmp2 fue expresado en el
epitelio ventral y las áreas inmediatamente adyacentes del mesénquima ventral en la etapa 26 embriones de G. fortis y G.
La expresión fue más fuerte G. magnirostris y G. conirostris embriones, las dos especies más grandes. ( DO) Bmp7 se
expresó en la ventral-más mesénquima de la FNP de todas las especies de la muestra ( RE) dominios de bmp4 expresión
en la prominencia del pico superior G. magnirostris en las etapas 26 y 29. Las barras de escala: 1 mm en B, C.
Adicional Figura 5.
Comparación de Col II expresión en st. 30 embriones cuyo epitelio ( UN) y el mesénquima ( SEGUNDO) estaban infectados con
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estructuras. vistas frontal y lateral de la cabeza de todo el embrión con el epitelio infectados con RCAS :: Bmp4. Las
cápsulas nasales rodeadas por el tejido MXP se indican con puntas de flecha blancas. La prominencia pico superior fue
Adicional Figura 6.
Propagación de la infección RCAS tal como se muestra con la sonda RSCH en pollo picos superior ilustrados
en la Figura 4D, H, L. ( UN) No hay infección RCAS en el control de los embriones de tipo salvaje. Fuerte
RCAS :: bmp4 ( SEGUNDO) y RCAS :: noggin ( DO) la infección puede ser detectada con RSCH en el lugar
hibridación.
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Figura S1
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Figura S2
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Figura S3
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Figura S4
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Figura S5
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Figura S6
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R EFERENCIAS
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