“AÑO DEL DIÁLOGO Y LA RECONCILIACIÓN NACIONAL”

UNIVERSIDAD PERUANA LOS ANDES

FACULTAD DE CIENCIAS DE LA SALUD
E.A.P. DE TECNOLOGÍA MÉDICA

ESPECIALIDAD: LABORATORIO CLÍNICO Y ANATOMÍA PATOLÓGICA

“ELECTROINMUNOTRANSFERENCIA
NORTHERN BLOT Y SOURTHERN BLOT ”

CÁTEDRA : TALLER DE INVESTIGACION II

CATEDRÁTICA : Lic.T.M. EFRAIN MOSTES HIJAR

ALUMNA : LOPEZ MALLMA, My

NIVEL ACADÉMICO: VIII

Huancayo – Perú
2018
 INTRODUCCION

En las últimas décadas la tecnología de recombinación del ADN también

conocida como ingeniería genética, o más acertadamente recombinación
genética in vitro, ha revolucionado la biología. El campo de la salud es uno de
los más beneficiados con el desarrollo de esta tecnología. Las investigaciones
que se realizan en esta área están enfocadas a un diagnóstico oportuno de
enfermedades, así como su posible tratamiento a través de la terapia con
moléculas recombinantes e introducción de genes. Además, la manipulación de
genes proporciona una herramienta fundamental para la eliminación futura de
enfermedades mortales para el hombre. Existen varias técnicas basadas en la
hibridación entre ellas PCR, CGH ISH: FISH, CISH, SISH y las de nuestro
estudio que son las técnicas de transferencia o “blotting”: Las técnicas Southern
blot y Northern blot se utilizan para separar y caracterizar ADN y ARN
respectivamente. La técnica de Southern fue desarrollada por Edwin Southern
para separar ADN y por analogía la separación de ARN se denominó Northern y
la transferencia de proteínas que se denominó Western blot. El Southern Blot,
que detecta la presencia de ciertas secuencias en el ADN, se usa, por ejemplo,
para estudiar mutaciones en el genoma. El Northern, en cambio, permite detectar
qué genes son transcriptos en determinadas condiciones. Hemos visto que dos
células del mismo organismo se distinguen por los genes que expresan y no por
su ADN. El Southern Blot nos permite evidenciar el mismo material genético y el
Northern Blot, la expresión de diferentes genes.
 INDICE

Contenido
INTRODUCCION ........................................................................................................................ 2
CAPÍTULO I ................................................................................................................................ 4
NORTHERN BLOT .................................................................................................................... 4
1. DEFINICION: .............................................................................................................. 4
2. PROCEDIMIENTO: .................................................................................................... 5
2.1. GELES: .................................................................................................................... 5
2.2. SONDAS: ................................................................................................................ 6
3. APLICACIONES: ....................................................................................................... 6
4. VENTAJAS E INCONVENIENTES: ........................................................................ 7
5. REVERSE NORTHERN BLOT: ............................................................................... 8
CAPÍTULO II ............................................................................................................................... 9
SOURTHERN BLOT ................................................................................................................. 9
1. DEFINICION: .............................................................................................................. 9
2. PASOS DE SOUTHERN BLOT: ............................................................................. 9
2.1.EXTRACCIÓN DEL ADN: ..................................................................................... 10
2.2.DIGESTIÓN DEL ADN CON UNA ENDONUCLEASA DE RESTRICCION: 10
2.3.ELECTROFORESIS EN GEL DE AGAROSA: .................................................. 10
2.4.PREPARACIÓN DE UN ENSAYO DE SOUTHERN (SOUTHERN BLOT): . 10
2.5.HIBRIDACIÓN CON SONDA RADIOACTIVA: .................................................. 11
2.6.DETECCIÓN DE LOS RFLPS MEDIANTE AUTORRADIOGRAFÍA: ............ 11
2.7. .................. REENSAYAR EL RESULTADO DEL SOUTHERN CON SONDAS
ADICIONALES: .............................................................................................................. 11
3. DIAGNÓSTICO MOLECULAR DE ENFERMEDADES: ............................................ 12
4. APLICACIONES:.............................................................................................................. 12
ANEXOS .................................................................................................................................... 13
NORTHERN BLOT .................................................................................................................. 14
SOURTHERN BLOT ............................................................................................................... 17
 CAPÍTULO I
NORTHERN BLOT

1. DEFINICION:
La transferencia de Northern, o RNA blot, es una técnica utilizada en la
investigación de biología molecular para estudiar la expresión génica
mediante la detección de ARN (o ARNm aislado) en una muestra. Con
Northern Blot es posible observar el control celular sobre la estructura y la
función determinando las tasas de expresión génica particulares durante
la diferenciación y la morfogénesis, así como en condiciones anormales o
enfermas. La transferencia Northern implica el uso de electroforesis para
separar las muestras de ARN por tamaño, y la detección con una sonda
de hibridación complementaria a parte o a toda la secuencia diana. El
término "northern blot" se refiere en realidad específicamente a la
transferencia capilar de ARN desde el gel de electroforesis a la membrana
de transferencia. Todo el proceso se conoce comúnmente como
transferencia Northern. La técnica de Northern Blot fue desarrollada en
1977 por James Alwine, David Kemp y George Stark en la Universidad de
Stanford, con contribuciones de Gerhard Heinrich. El Northern blot toma
su nombre de su similitud con la primera técnica de transferencia,
Southern blot , llamada así por el biólogo Edwin Southern. La principal
diferencia es que el ARN, en lugar del ADN, se analiza en la transferencia
de northern.
2. PROCEDIMIENTO:
Un procedimiento de inmunotransferencia general comienza con la
extracción del ARN total de una muestra de tejido homogeneizada o de
células. El ARNm eucariótico se puede aislar a través del uso de
cromatografía de oligo (dT) celulosa para aislar solo aquellos ARN con
una cola de poli (A). Las muestras de ARN luego se separan mediante
electroforesis en gel. Dado que los geles son frágiles y las sondas no
pueden entrar en la matriz, las muestras de ARN, ahora separadas por
tamaño, se transfieren a una membrana de nylon a través de un sistema
capilar o de transferencia a vacío. Una membrana de nylon con carga
positiva es la más eficaz para usar en la transferencia Northern, ya que
los ácidos nucleicos con carga negativa tienen una gran afinidad por ellos.
El tampón de transferencia utilizado para la transferencia generalmente
contiene formamida porque disminuye la temperatura de recocido de la
interacción sonda - ARN, eliminando así la necesidad de altas
temperaturas, lo que podría causar la degradación del ARN. Una vez que
el ARN se ha transferido a la membrana, se inmoviliza a través de un
enlace covalente a la membrana mediante luz ultravioleta o calor.
Después de que una sonda ha sido marcada, se hibrida con el ARN en la
membrana. Las condiciones experimentales que pueden afectuar la
eficacia y la especificidad de la hibridación incluyen la fuerza iónica, la
viscosidad, la longitud del dúplex, los pares de bases mal emparejados y
la composición de la base. La membrana se lava para garantizar que la
sonda se haya unido específicamente y para evitar que surjan señales de
fondo. Las señales híbridas son luego detectadas por una película de
rayos X y pueden ser cuantificadas por densitometría. Para crear
controles para comparación en una transferencia Northern, las muestras
que no muestran el producto genético de interés se pueden usar después
de la determinación por microarrays o RT-PCR.

2.1. GELES:
Las muestras de ARN se separan más comúnmente en geles de
agarosa que contienen formaldehído como agente
desnaturalizante para que el ARN limite la estructura secundaria.
Los geles pueden teñirse con bromuro de etidio (EtBr) y verse bajo
luz ultravioleta para observar la calidad y la cantidad de ARN antes
de la transferencia. La electroforesis en gel de poliacrilamida con
urea también se puede usar en la separación de ARN, pero se usa
con mayor frecuencia para ARN o micro ARN fragmentados. Una
escala de ARN a menudo se ejecuta junto con las muestras en un
gel de electroforesis para observar el tamaño de los fragmentos
obtenidos, pero en las muestras de ARN total las subunidades
ribosómicas pueden actuar como marcadores de tamaño. Dado
 que la subunidad ribosómica grande es 28S (aproximadamente 5
kb) y la subunidad ribosómica pequeña es 18S (aproximadamente
2 kb) aparecen dos bandas prominentes en el gel, la más grande a
cerca del doble de la intensidad de la más pequeña.

2.2. SONDAS:
Las sondas para Northern blot están compuestas de ácidos
nucleicos con una secuencia complementaria a todo o parte del
RNA de interés, pueden ser DNA, RNA o oligonucleótidos con un
mínimo de 25 bases complementarias a la secuencia diana. Las
sondas de ARN (riboprobes) que se transcriben in vitro son
capaces de soportar pasos de lavado más rigurosos que previenen
parte del ruido de fondo. Comúnmente, el ADNc se crea con
cebadores marcados para que la secuencia de ARN de interés
actúe como la sonda en la transferencia de northern. Las sondas
deben etiquetarse con isótopos radiactivos (32 P) o con
quimioluminiscencia en la que la fosfatasa alcalina o la peroxidasa
de rábano picante (HRP) descomponen sustratos
quimioluminiscentes produciendo una emisión detectable de luz. El
marcaje quimioluminiscente puede ocurrir de dos maneras: o bien
la sonda está unida a la enzima, o la sonda está marcada con un
ligando (p. Ej., Biotina ) para el cual el ligando (p. Ej., Avidina o
estreptavidina ) está unido a la enzima ( por ejemplo, HRP). La
película de rayos X puede detectar señales tanto radioactivas como
quimioluminiscentes y muchos investigadores prefieren las señales
quimioluminiscentes porque son más rápidas, más sensibles y
reducen los riesgos para la salud que acompañan a las etiquetas
radiactivas. La misma membrana puede probarse hasta cinco
veces sin una pérdida significativa del ARN diana.

3. APLICACIONES:
La transferencia de Northern permite observar el patrón de expresión de
un gen particular entre tejidos, órganos, etapas de desarrollo, niveles de
estrés ambiental, infección de patógenos y durante el transcurso del
tratamiento. La técnica se ha utilizado para mostrar la sobreexpresión de
oncogenes y la regulación a la baja de genes supresores de tumores en
células cancerosas en comparación con el tejido "normal", así como la
expresión génica en el rechazo de órganos trasplantados. Si se observa
un gen regulado al alza por una abundancia de ARNm en la transferencia
 Northern, la muestra puede secuenciarse para determinar si el gen es
conocido por los investigadores o si se trata de un hallazgo novedoso. Los
patrones de expresión obtenidos en determinadas condiciones pueden
proporcionar una idea de la función de ese gen. Dado que el ARN se
separa primero por tamaño, si se usa solo un tipo de sonda, la variación
en el nivel de cada banda en la membrana puede proporcionar
información sobre el tamaño del producto, sugiriendo productos de
empalme alternativos del mismo gen o motivos de secuencia repetitiva.
La varianza en el tamaño de un producto génico también puede indicar
supresiones o errores en el procesamiento de la transcripción. Al alterar
el objetivo de la sonda utilizado a lo largo de la secuencia conocida, es
posible determinar qué región del ARN falta. BlotBase es una base de
datos en línea que publica northern blots. BlotBase tiene más de 700
transferencias Northern publicadas de muestras de humanos y ratones,
en más de 650 genes en más de 25 tipos diferentes de tejidos. Se pueden
buscar transferencias de Northern mediante una identificación de
transferencia, referencia de papel, identificador de gen o tejido. Los
resultados de una búsqueda proporcionan la identificación de la
transferencia, especie, tejido, gen, nivel de expresión, imagen de
transferencia (si está disponible) y enlaces a la publicación de la que se
originó el trabajo. Esta nueva base de datos proporciona el intercambio
de información entre los miembros de la comunidad científica que no se
había visto anteriormente en la transferencia de northern, como lo era en
el análisis de secuencias, la determinación del genoma, la estructura de
proteínas, etc.

4. VENTAJAS E INCONVENIENTES:
El análisis de la expresión génica se puede realizar mediante varios
métodos diferentes, incluidos RT-PCR, ensayos de protección de RNasa,
microarrays, RNA-Seq , análisis seriados de la expresión génica (SAGE),
así como el northern blotting. Las micromatrices se utilizan con bastante
frecuencia y, en general, son consistentes con los datos obtenidos de las
transferencias de northern; sin embargo, a veces el Northern blot puede
detectar pequeños cambios en la expresión génica que las micromatrices
no pueden. La ventaja de que los microarrays tienen sobre las
transferencias de northern es que miles de genes se pueden visualizar a
la vez, mientras que el northern blot suele buscar uno o un pequeño
número de genes. Un problema en la transferencia Northern es a menudo
la degradación de la muestra por RNasas (tanto endógenas a la muestra
como a través de la contaminación ambiental), que pueden evitarse
mediante la esterilización adecuada de los materiales de vidrio y el uso de
inhibidores de RNasa tales como DEPC ( dietilpirocarbonato ). Los
productos químicos utilizados en la mayoría de las transferencias de
 northern pueden ser un riesgo para el investigador, ya que el
formaldehído, el material radiactivo, el bromuro de etidio, el DEPC y la luz
ultravioleta son todos dañinos bajo ciertas exposiciones. En comparación
con la RT-PCR, la transferencia Northern tiene una sensibilidad baja, pero
también tiene una alta especificidad, lo que es importante para reducir los
resultados falsos positivos. Las ventajas de usar Northern Blot incluyen la
detección del tamaño de ARN, la observación de productos de empalme
alternativos, el uso de sondas con homología parcial, la calidad y cantidad
de ARN se puede medir en el gel antes de la transferencia y las
membranas se pueden almacenar y reprobado por años después de
borrón. Para la transferencia Northern para la detección de ARNm de
acetilcolinesterasa, la técnica no radioactiva se comparó con una técnica
radioactiva y se encontró tan sensible como la radiactiva, pero no requiere
protección contra la radiación y consume menos tiempo.

5. REVERSE NORTHERN BLOT:

Los investigadores de vez en cuando usan una variante del procedimiento
conocido como Northern blot inverso. En este procedimiento, el ácido
nucleico del sustrato (que está fijado a la membrana) es una colección de
fragmentos de ADN aislados, y la sonda se extrae con ARN de un tejido
y se marca radiactivamente. El uso de microarrays de ADN que se han
generalizado a finales de la década de 1990 y principios de la de 2000 se
parece más al procedimiento inverso, ya que implican el uso de
fragmentos de ADN aislados adheridos a un sustrato y la hibridación con
una sonda hecha a partir de ARN celular . Por lo tanto, el procedimiento
inverso, aunque inicialmente poco común, permitió que el análisis del
norte evolucionara hacia un perfil de expresión génica , en el cual muchos
(posiblemente todos) los genes en un organismo pueden tener su
expresión monitoreada.
 CAPÍTULO II
SOURTHERN BLOT
1. DEFINICION:
Southern blot, hibridación Southern o, simplemente, Southern es un
método de biología molecular que permite detectar la presencia de una
secuencia de ADN concreta en una mezcla compleja de este ácido
nucleico. Para ello, emplea la técnica de electroforesis en gel de agarosa
con el fin de separar los fragmentos de ADN de acuerdo a su longitud y,
después, una transferencia a una membrana en la cual se efectúa la
hibridación de la sonda. Su nombre procede del apellido de su inventor,
un biólogo inglés llamado Edwin Southern.

2. PASOS DE SOUTHERN BLOT:

2.1. EXTRACCIÓN DEL ADN:
Se puede extraer ADN de casi cualquier tejido humano. Las
posibles fuentes de ADN en la escena de un delito incluyen
sangre, semen, tejido de una víctima muerta, células del folículo
capilar y saliva. El ADN extraído de las pruebas del delito
("indicios" o "vestigios" biológicos) se compara con el extraído de
muestras de referencia, obtenidas de personas conocidas,
habitualmente de la sangre.

2.2. DIGESTIÓN DEL ADN CON UNA ENDONUCLEASA

DE RESTRICCION:
El ADN extraído de la muestra se trata con una endonucleasa de
restricción, que es una enzima que corta el ADN bicatenario en
donde tenga una secuencia característica. La enzima que se usa
más frecuentemente para el análisis legal es HaeIII, que corta el
ADN en la secuencia 5'-GGCC-3'.

2.3. ELECTROFORESIS EN GEL DE AGAROSA:

Tras la digestión del ADN, los fragmentos de ADN resultantes se
separan según su tamaño mediante electroforesis en geles de
agarosa. Durante la electroforesis, las moléculas de ADN, que
poseen carga negativa, migran hacia el electrodo positivo. Al
avanzar las moléculas de ADN, su velocidad de migración se ve
reducida por la matriz del gel de agarosa. Las moléculas menores
se mueven más deprisa a través de los poros del gel que las de
mayor tamaño. Como resultado, se produce una separación
continua de los fragmentos de ADN de acuerdo con su tamaño, de
modo que los fragmentos más pequeños avanzan la mayor
distancia con referencia al origen o punto de aplicación de la
muestra.

2.4. PREPARACIÓN DE UN ENSAYO DE SOUTHERN

(SOUTHERN BLOT):
Tras la electroforesis, las moléculas de ADN separadas se
desnaturalizan mientras permanecen en el gel de agarosa,
impregnando éste con una disolución alcalina. Tras la
neutralización de ésta, el DNA monocatenario resultante se
transfiere a la superficie de una membrana de nailon, realizando
así una copia o "calco" (la traducción más literal del inglés blot,
conservando este sentido, es "secante"). Este proceso de
 desnaturalización y transferencia se conoce como método de
Southern en recuerdo de quien lo inventó, Edward Southern. Al
igual que la aplicación de un secante a un papel con la tinta húmeda
transfiere una réplica de la imagen del papel al secante, el "calco"
del ADN en el gel a la membrana de nailon conserva la distribución
espacial de los fragmentos de ADN conseguida en el gel como
resultado de la electroforesis.

2.5. HIBRIDACIÓN CON SONDA RADIOACTIVA:

Una sonda de locus único es una molécula pequeña de ADN o ARN
capaz de hibridar (es decir, de formar un dúplex ADN-ADN o ADN-
ARN) con el ADN de un fragmento de restricción concreto en el
ensayo de Southern. La formación de la molécula dicatenaria
(dúplex) depende del emparejamiento de bases complementarias
entre las secuencias de la sonda y del ADN presente en el"calco".
Las sondas de locus único se marcan habitualmente con un isótopo
radiactivo para facilitar su detección, y se eligen para que detecten
un locus genético polimórfico en un solo cromosoma humano. El
ensayo de Southern resultante de la etapa 4 se incuba en una
disolución que contiene una sonda radiactiva de locus único, bajo
condiciones de temperatura y concentración de sales que
favorezcan la hibridación. Tras producirse ésta, se lava el exceso
de sonda no unido, de modo que la única radiactividad que quede
en la membrana de nailon sea la asociada al ADN del locus diana.

2.6. DETECCIÓN DE LOS RFLPS MEDIANTE

AUTORRADIOGRAFÍA:
Las posiciones de hibridación de la sonda radiactiva sobre la
membrana del ensayo de Southern se detectan mediante
autorradiografía. En esta técnica, la membrana de nailon se coloca,
una vez lavada, junto a una película de rayos X dentro de una caja
que las aísle de la luz. La película registra las posiciones donde hay
desintegración radiactiva. Tras su exposición y el revelado
fotográfico, el registro resultante de la hibridación de Southern se
conoce como autorradiografía

2.7. REENSAYAR EL RESULTADO DEL SOUTHERN CON

SONDAS ADICIONALES:
En un análisis legal de DNA se suelen caracterizar polimorfismos
de ADN en varios cromosomas diferentes. Tras el revelado de una
autorradiografía para la primera sonda, se puede lavar la
 radiactividad con una disolución a elevada temperatura, que deja
el ADN en su sitio, e hibridarlo con una segunda sonda radiactiva
que se una a un locus diferente. Se repiten así las etapas 5-7,
detectando cada vez un locus diferente. El grupo de
autorradiografías de una misma transferencia de Southern se
conoce como un "perfil de ADN".

3. DIAGNÓSTICO MOLECULAR DE ENFERMEDADES:

El Southern Blot es una técnica que puede proveer información que puede
ser usada para el diagnóstico molecular de algunas enfermedades
génicas, ejemplo de ellas serían el Síndrome de Angelman, Síndrome de
Prader-Willi y Síndrome X frágil. Esta técnica resulta ser la más sensible
para el diagnóstico de algunas patologías como es el caso del Síndrome
Angelman y el Síndrome de Prader-Willi.

4. APLICACIONES:
Sur de transferencia puede ser utilizado para la clonación basada en
homología en la base de la secuencia de aminoácidos de la proteína
producto del gen diana. Se diseñan oligonucleótidos que son similares a
la secuencia diana. Los oligonucleótidos se sintetizan químicamente,
radiomarcado, y se utilizan para cribar una biblioteca de ADN, o de otras
colecciones de fragmentos de ADN clonados. Las secuencias que
hibridan con la sonda de hibridación se analizaron adicionalmente, por
ejemplo, para obtener la secuencia de longitud completa del gen objetivo.
En segundo lugar, la transferencia Southern también se puede utilizar
para identificar los sitios metilados en los genes particulares. Son
particularmente útiles las nucleasas de restricción MspI y HpaII, ambos de
los cuales reconocen y escinden dentro de la misma secuencia. Sin
embargo, HpaII requiere que un C dentro de ese sitio ser metilado,
mientras que MspI escinde sólo el ADN no metilado en ese sitio. Por lo
tanto, los sitios metilados dentro de una secuencia analizados con una
sonda particular, se pueden escindir por el anterior, pero no el último,
enzima.
ANEXOS
 NORTHERN BLOT

 Diagrama de flujo que describe el procedimiento

general para la detección de ARN mediante transferencia
Northern.
 Configuración del sistema de transferencia capilar
para la transferencia de ARN desde un gel de
electroforesis a una membrana de transferencia.

 El ARN se ejecuta en un gel de agarosa con

formaldehído para resaltar las subunidades
ribosómicas 28S (banda superior) y 18S (banda
inferior).
 SOURTHERN BLOT

 Se muestra la dotación genética (azul) de un

individuo homocigoto (A) y uno heterocigoto (B) para
un marcador; tras hibridarse con una sonda
específica (rosa) se observa el resultado del
Southern a la derecha.

 Southern blot: identificación de ADN

 Esquema de Southern Blot.