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Introducción
Enterotoxigenic E. coli (ETEC) son una causa importante de enfermedad diarreica y
muerte, especialmente en niños en países en desarrollo. En 2010, la mortalidad anual por
enfermedad debida a ETEC enterotoxigénica se estimó en 157,000 muertes (9 por ciento de
todas las muertes atribuidas a diarrea) y aproximadamente 1 por ciento de todas las muertes
en niños de 28 días a 5 años [ 1 , 2 ]. Dentro de las poblaciones susceptibles, ETEC
promueve un ciclo de enfermedad diarreica grave, disfunción de barrera intestinal y
malnutrición, que impide el crecimiento saludable, la función cognitiva y la supervivencia a
largo plazo [ 3 , 4 ]. ETEC también es bien reconocido como una causa de enfermedad
diarreica en adultos sanos mientras viajan a áreas endémicas de ETEC [ 5 ] o por la
ingestión de alimentos contaminados [ 6 , 7], con un reconocimiento creciente de que estas
infecciones pueden conducir a disbiosis intestinal crónica y síndrome de intestino irritable
post-infeccioso [ 8 - 10 ].
La ETEC causa enfermedad en el intestino delgado por medio de factores de colonización
(CF) y por la producción de una enterotoxina lábil al calor (LT) y / o una pequeña
enterotoxina no inmunogénica termoestable (ST). En general, la mayoría de ETEC
producen ST y LT [ 5 , 11 - 14 ]. La LT induce la secreción a través de una subunidad A
enzimáticamente activa (LT-A) y una subunidad B pentámera de unión celular (LT-B)
[ 15 ]. La subunidad A está compuesta de dos componentes, A1 y A2. El componente A1
(21 kD), la porción enzimáticamente activa de la toxina, está unida de forma no covalente
al pentámero B a través del péptido A2 (7 kD) [ 16 - 18 ]. La expresión de LT también
facilita la adherencia bacteriana a las células epiteliales y la colonización intestinal
[ 19 , 20 ]. En áreas donde ETEC es endémico, el riesgo de episodios diarreicos recurrentes
disminuye después de los cinco años de edad, concurrente con el desarrollo de anticuerpos
anti-LT [ 11 , 21 , 22 ]. La importancia de los anticuerpos anti-LT en la protección contra la
enfermedad diarreica ETEC se ha demostrado con varios estudios de desafío ETEC en
adultos humanos y en un estudio de campo que monitorea a los lactantes que reciben de
forma natural leche materna que contiene IgA anti-LT [ 23 , 24 ]. Estos informes han
sugerido fuertemente que una respuesta anti-LT proporciona una inmunidad significativa
contra la secreción mediada por LT y posiblemente la colonización por ETEC; por lo tanto,
un antígeno relacionado con LT debe ser un componente importante de una vacuna de
ETEC efectiva.
La subunidad B de LT a menudo se presume que es el componente inmunodominante de la
toxina y las vacunas potenciales contra ETEC frecuentemente incluyen LT-B como uno de
los antígenos de la vacuna.La evidencia de inmunodominancia de la subunidad B en LT y
la enterotoxina del cólera estrechamente relacionada proviene de análisis de anticuerpos de
sueros de pacientes o estudios en animales con TC que encontraron una mayor capacidad
neutralizante de anticuerpos de la subunidad B que los anticuerpos anti-subunidad A
[ 25 - 29 ] Estos hallazgos llevaron a la creencia de larga data de que la subunidad B es el
principal antígeno protector contra la LT [ 24 , 30 - 32 ].
La subunidad A de LT, aunque crítica para la enterotoxicidad, no se ha evaluado
exhaustivamente para inmunogenicidad y a menudo se pasa por alto como un potencial
antígeno protector contra ETEC, aunque ha habido algunos intentos de desintoxicar
genéticamente la subunidad A para su uso como toxoide [ 33 ].Sin embargo, LT-A es
claramente antigénico y una serie de informes describen la producción de anticuerpos
monoclonales anti-A a partir de aislados clínicos de ETEC [ 34 - 36 ]. Además, un estudio
de 1984 sobre pacientes que se recuperaban del cólera o infección ETEC encontró
predominantemente anticuerpos séricos anti-B en pacientes con cólera pero anticuerpos
séricos anti-A y anti-B equivalentes en pacientes ETEC (aunque ambos análisis se
realizaron mediante ELISA usando subunidades CT) [ 37 ]. Por lo tanto, no se conoce bien
la importancia relativa de la subunidad A de LT como antígeno protector contra ETEC. El
propósito de este estudio fue evaluar la respuesta inmune contra la subunidad A de LT así
como su potencial como antígeno protector cuando se administra solo o en combinación
con la subunidad B de LT. Logramos este objetivo a través de un enfoque combinatorio,
evaluando las respuestas séricas humanas, los modelos de vacunación animal y los estudios
de neutralización de toxinas.
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Materiales y métodos
Resultados
En estudios anteriores, hemos clonado con éxito los genes de LT, LT-A y LT-B y proteínas
individuales purificadas libres de contaminación cruzada [ 16 - 18 , 38 ]. Para examinar
críticamente las propiedades de las subunidades A y B, realizamos una variedad de análisis,
que incluyen ELISA, Western blot, inmunoblot y ensayo de neutralización de toxinas. La
combinación de estas técnicas nos permitió examinar tanto epítopos conformacionales
como lineales y diferentes fuentes de antígenos (subunidades recombinantes o toxina LT
desnaturalizada y coagulada).
Figura 1
El conjunto de sueros humanos expuestos a ETEC contiene anticuerpos contra las
subunidades A y B de LT.
(A) Suero de prueba ETEC (agrupado 10 días después de la administración oral Desafío H10407 )
respuestas de anticuerpos anti-LT, anti-A y anti-B detectadas mediante ELISA (línea gris, círculos)
en comparación con sueros control comercialmente adquiridos (líneas negras, círculos vacíos)
usando diluciones de cada muestra.(B) Prueba de inmunoblot de suero (1) de ETEC-desafío o suero
de control (2) para anticuerpos anti-LT usando carriles cargados de LT sin hervir o carriles cargados
de LT cargado. En geles de SDS-PAGE sin hervir, LT se ejecuta como una proteína polimérica de
84 kD, subunidad B pentamérica (56 kD) y LT-A (28 kD). Cuando se hierve y se somete a SDS-
PAGE, LT se separa en LT-A (28 kD) y LT-B monomérica (11,5 kD). (C) ETEC-desafío suero o
suero de control anti-LT, anti-A, o anti-B respuestas detectadas con una inmunotransferencia
modificada usando un aparato de transferencia de ranura para cargar 0.1 μg de proteína (LT, A, A1
o B) con raw imágenes (arriba) y densidad de banda cuantificada de estas imágenes para proteínas
cargadas sin hervir graficadas (abajo).
Fig 4
Los anticuerpos de la subunidad anti-A o anti-B neutralizan la toxicidad de LT, con
respuestas máximas cuando ambas están presentes.
(A) Neutralización de la secreción de fluido intestinal mediada por toxinas en el ensayo de ratón
patentado después de la alimentación intragástrica con tampón (1) o 25 μg de LT combinado con
sueros de control negativo anti-A (2), anti-B (3) (4) o toxina sola (5). (B, E) Neutralización de la
intoxicación de cAMP de células epiteliales en células Caco-2 después de 3 h de tratamiento con
0.1 μg de LT preincubados con control positivo GM1 monosialogangliósido (GM1 + LT), varias
diluciones y combinaciones de antisuero, o toxina sola . (C) Bloqueo de la unión de la toxina GM1
mediante detección mediante ELISA usando 0,1 μg de toxina LT preincubada con antisueros o
sola. (D) Transferencia de Western de lisados de células Caco-2 después de 3 horas de tratamiento
con 0,1 μg de toxina LT preincubada con antisueros. Las transferencias se sondearon para proteínas
ADP-ribosiladas utilizando macrodominios de rAF1521 (transferencia de fondo) y luego se
volvieron a explorar para determinar la presencia de la subunidad B usando suero de conejo anti-B
(transferencia superior). Las casillas indican proteínas con ADP-ribosilación alterada,
potencialmente Gsα. Las pruebas de significancia para la secreción y los paneles de AMPc se
realizaron usando un ANOVA de una vía con la prueba posterior de Tukey's Multiple
Comparison. Los valores P se codificaron de la siguiente manera: * <0,05, ** <0,01, *** <0,001.
Para el ensayo de cAMP, las células CaCo-2 se trataron con una cantidad de LT suficiente
para provocar la acumulación máxima de cAMP en 3 horas (es decir, 0,1 μg). Para este
ensayo, el LT se preincubó primero con GM1 (control positivo) o diluciones en serie de
suero anti-A o anti-B de conejo ( Fig. 4B ).Curiosamente, se observaron dos efectos
diferentes. Para anti-LT-A, la neutralización de LT disminuyó gradualmente cuanto más se
diluyó el suero, comenzando de 1: 8 (100%) a 1: 256 (0%). Por el contrario, el anti-LT-B
parecía tener un umbral marcado en el que la neutralización pasaba de cero a ninguno en
una sola dilución de 2 veces (64-128). Esto sugiere que existe un nivel umbral de anti-B por
encima del cual se bloquea LT que se une a la célula y cualquier nivel inferior puede no ser
eficaz.
Posteriormente, examinamos si estos antisueros actúan para bloquear la actividad de unión
o enzimática de LT usando placas de ELISA recubiertas con GM1 o un ensayo de
ribosilación de ADP intracelular. Para ambos ensayos, se preincubó LT con conejo anti-A,
conejo anti-B, suero control negativo, o tampón antes de la adición. Los anticuerpos anti-B
impidieron la unión de GM1 ( figura 4C ), la entrada de toxina en la célula ( figura 4D ,
transferencia superior) y la actividad enzimática ( figura 4D , transferencia inferior).Por el
contrario, los anticuerpos anti-A solo previenen la actividad enzimática de la toxina dentro
de las células epiteliales. Estos resultados indican que los anticuerpos contra la subunidad B
evitan la unión de toxinas y la entrada a las células intestinales, mientras que los
anticuerpos contra la subunidad A previenen la actividad enzimática de la toxina dentro de
los compartimentos intracelulares.
También examinamos la sinergia potencial entre anti-A y anti-B para la neutralización de
toxinas. Para este ensayo, combinamos suero anti-A y anti-B a diluciones que no mostraron
una neutralización completa de la toxina en la figura 4B (por ejemplo, 1:16 anti-A; 1: 128-
256 anti-B). Como se ve en la Fig. 4E , las diluciones de anti-B a niveles de 1: 128-256
fueron incapaces de neutralizar la inducción de LT de cAMP, a menos que se combinara
con anti-A. Además, la capacidad neutralizante de anti-A se vio enormemente potenciada
por la presencia de anti-B. Por lo tanto, las respuestas antitoxinas se maximizan cuando los
anticuerpos a ambas subunidades están presentes.
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Discusión
El desarrollo de una vacuna efectiva contra ETEC se ha complicado por una serie de
factores, incluida la ausencia de un mercado de países desarrollados sustancial para
compensar el costo del desarrollo, el enfoque en los viajeros como objetivo primario de la
vacuna, la gran cantidad de serotipos potenciales y antígenos del factor colonizador y el
éxito (relativo) de la vacuna contra el cólera de la subunidad B de células enteras. Esto
condujo primero al desarrollo de candidatos de vacuna ETEC eliminados combinados con
la subunidad B de la toxina del cólera como el principal componente anti-toxina. Estudios
más recientes han utilizado cepas ETEC muertas o vivas atenuadas combinadas con la
subunidad B de LT [ 44 , 45 ]. Se han realizado algunos intentos para incluir un
componente de LT-A, que incluye un parche transcutáneo basado en LT que previene con
éxito la diarrea de ETEC solo con LT en los viajeros (aunque no en todas las diarreas de
ETEC) [ 40 ]. Además, LT-A es difícil de purificar sin contaminación con LT-B y es
insoluble en la mayoría de los tampones acuosos. Como resultado, la mayoría del desarrollo
de la vacuna ETEC ha incluido a la subunidad B como el único componente anti-toxina.
El propósito de este estudio fue evaluar la respuesta inmune contra la subunidad A de LT
así como su potencial como antígeno protector cuando se administra solo o en combinación
con la subunidad B de LT.Para evitar el problema de la contaminación cruzada con
pequeñas cantidades de proteínas competidoras (a menudo un problema en estudios más
antiguos que usan cromatografía de disociación), utilizamos LT, LT-A y LT-B
recombinantemente producidos purificados en columnas de cromatografía prístina como
antígenos e inmunógenos en una serie de ensayos in vitro e in vivo . Tenemos una amplia
experiencia en la purificación y caracterización de LT y sus subunidades, así como en la
evaluación de sus propiedades inmunológicas y fisiológicas [ 16 - 18 , 31 , 38 , 46 ].
Nuestros estudios muestran claramente que ambas subunidades LT son
inmunogénicas. Sueros humanos de individuos desafiados con una cepa prototípica de
ETEC de tipo salvaje, así como los sueros de individuos que viven en un área endémica de
ETEC, tenían anticuerpos detectables contra LT, LT-A y LT-B detectados mediante ELISA
e inmunoblot (Figs . y and22 y S1 Fig .). No se identificó una subunidad inmunodominante
clara para LT, sin embargo, los anticuerpos contra la subunidad A incluían a menudo tanto
epítopos conformacionales como no conformacionales, mientras que los de la subunidad B
eran principalmente conformacionales. ilustra que la subunidad A de LT es naturalmente
inmunogénica, como la subunidad B de LT, similar a estudios anteriores [ 34 - 37 ].
Durante la infección bacteriana con ETEC, la expresión de la toxina LT se produce
directamente en las superficies gastrointestinales y posiblemente utilizando sistemas de
administración especializados, como las vesículas de la membrana externa [ 47 ]. Hemos
demostrado previamente que la subunidad A de LT también es más susceptible que la
subunidad B a la escisión proteolítica en un dominio A1 y la degradación [ 18 ]. En
consecuencia, la inmunogenicidad de LT y sus subunidades podría ser distinta en el
contexto de la vacunación antigénica frente a la infección bacteriana. En nuestros estudios
de inmunización murina, confirmamos que se detectaron respuestas robustas de anticuerpos
después de la inmunización con subunidades individuales, pero estas se maximizaron en
combinación con construcciones A + B o AB5 mezcladas ( Fig. 3 ). Se observó una menor
respuesta sérica con la inmunización de la subunidad A después de la inmunización
sublingual que con la inmunización intranasal, como cabría esperar dada la dinámica más
complicada de la captación de antígenos en el epitelio sublingual (sin la presencia de una
subunidad B de unión a GM1) y presencia de proteasas salivales. Las propiedades
sinérgicas de A + B mezclado con respecto a niveles más altos de respuestas inmunológicas
se han visto previamente en nuestros estudios que evalúan las propiedades adyuvantes de la
subunidad A o B mezcladas [ 18 ]. Esto sugiere que la inmunogenicidad de la toxina LT, al
igual que la adyuvanticidad, no depende de la estructura de holotoxina AB5, aunque la
inducción de respuestas sistémicas de anticuerpos es máxima con al menos dos señales
recibidas de las subunidades A y B.
Una conclusión importante de nuestro estudio es que ambas subunidades pueden ser
inmunoprotectoras y neutralizar la secreción diarreica mediada por LT ( Fig. 4 ). También
establecimos ensayos específicos para evaluar en qué punto los anticuerpos neutralizan o
previenen la intoxicación de las células epiteliales, incluida la unión a GM1, la entrada
celular, la ribosilación de ADP y la acumulación de cAMP ( Fig. 4 ).Estos ensayos
representan un potencial para la evaluación mejorada de anticuerpos neutralizadores de LT
que es más cuantificable y específico que el análisis de células suprarrenales Y-1 utilizado
históricamente que evalúa el tratamiento de redondeo celular / no redondeamiento post-
toxina [ 33 - 36 ]. Los anticuerpos policlonales de suero de conejo pudieron neutralizar los
efectos citotóxicos y enterotóxicos de la LT nativa al bloquear la unión y entrada en las
células (anti-LT-B) o la actividad enzimática intracelular de la toxina (anti-LT-A y anti-LT-
B ) Además, los anticuerpos contra ambas subunidades LT actuaron de forma sinérgica
para neutralizar la holotoxina cuando se combinaron. Tomados en conjunto, estos datos
apoyan la inclusión tanto de LT-A como de LT-B en vacunas prospectivas contra ETEC.
Una pregunta importante que no fue respondida por este estudio es qué forma de antígeno
LT es óptima: un toxoide AB5, como dmLT, o combinaciones de proteínas derivadas de
toxinas, como LT-A + LT-B. Se observaron diferencias mínimas entre dmLT y LT-A +
LT-B en nuestros estudios de inmunización con ratones en dosis y rutas evaluadas. Sin
embargo, se necesitarían estudios más extensos para evaluar las diferencias entre estas
proteínas tanto en la estabilidad de la formulación como en los resultados de la vacunación
cuando se combina con otros antígenos de ETEC. La cuestión de la forma del antígeno LT
se complica aún más por la vía de administración y si también se desean las propiedades
adyuvantes de una proteína derivada de LT [ 17 , 18 ]. Lo que queda claro de estos
resultados es que los análisis de anticuerpos que incluyen holotoxina LT o ambas
subunidades A y B producen resultados más informativos que los obtenidos solo con la
subunidad B. Con estas técnicas de análisis en mente, futuros estudios de vacunas ETEC
pueden comenzar a responder a estas preguntas utilizando combinaciones de antígenos LT
con un enfoque de inmunización específico (por ejemplo, vacunas orales atenuadas vivas o
muertas por calor en contraste con subunidades inyectadas por vía parenteral) o proteínas
de fusión).
En conclusión, las subunidades A y B contribuyen a la inmunoprotección contra la diarrea
mediada por LT, dando como resultado respuestas de anticuerpos que se dirigen a aspectos
únicos de la biología de la toxina y proporcionan una mayor neutralización de la toxina
cuando se combinan. Por lo tanto, parece probable que la inclusión de ambos epítopos de
subunidades en los candidatos a la vacuna ETEC promueva una respuesta neutralizante más
robusta a la toxina LT que la subunidad B sola.
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información de soporte
S1 Fig
Las muestras de suero de un área endémica de ETEC contienen anticuerpos contra
las subunidades A y B de LT.
El suero del paciente humano de Sierra Leona se evaluó para anticuerpos contra LT,
subunidad A y subunidad B en comparación con suero de control adquirido
comercialmente. (A) Suero de paciente humano de Sierra Leona (líneas negras) o suero de
control (círculos vacíos) respuestas de anticuerpos anti-LT, anti-A y anti-B detectadas
mediante ELISA mediante densidad óptica de 405 nm (OD) (B) Paciente humano suero de
Sierra Leona, suero control, o ninguna prueba de inmunoblot en suero para anticuerpos
anti-LT no conformacionales para las subunidades A o B del monómero. Todos los carriles
se cargaron con proteína LT hervida con la ubicación de las bandas A y B indicadas.
(EPS)
Haga clic aquí para obtener un archivo de datos adicional. (1.2M, eps)
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Expresiones de gratitud
Los autores de este estudio desean agradecer al Dr. Robert F. Garry y al Dr. David Sach por
el acceso a muestras humanas, a Lisa Read por sus valiosas discusiones sobre literatura
ETEC, a David Bauer y Louise Lawson por asistencia de laboratorio y a Robin Baudier por
su asesoramiento editorial .
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Declaración de financiación
Este trabajo fue apoyado en parte por una subvención de los Institutos Nacionales de Salud
(R56 AI099008-01A1). Este financiador proporcionó apoyo en forma de sueldos para el
autor [JDC], pero no tuvo ningún papel adicional en el diseño del estudio, la recopilación y
el análisis de datos, la decisión de publicar o la preparación del manuscrito. Las funciones
específicas de estos autores se articulan en la sección "Contribuciones del autor". La
afiliación actual del Dr. Branco, Zalgen Labs, no participó en este estudio.
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Disponibilidad de datos
Los datos relevantes están contenidos en el documento y sus archivos de Información de
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