Práctica número 6: “Extracción de RNA”

Reporte de Práctica
García Kunz Susana, Rivera Perea Hugo Josue,
Servín Valadez Akari Denisse, Vázquez Barrios Albany
(Sección: I)
Asignatura: Laboratorio de Biología Molecular
Licenciatura QFBT
Periodo 2018-2
Fecha de entrega: 18-04-2018

RESUMEN
El ARN es una molécula encargada de dirigir la síntesis de proteínas ya que
traduce la información proveniente del ADN que determina la estructura de
éstas. El RNA es lábil, la temperatura y el pH influyen en la degradación del
mismo. Para extraer al ARN se utilizaron 500 µL del reactivo Trizol , que es una
solución monofásica de fenol e isotiocianato de guanidina que causa la lisis
celular, desnaturaliza las proteínas de interferencia de la muestra y mantienen
la integridad del ARN por la inhibición efectiva de las RNAsas que son enzimas
estables que no requieren cofactores para su acción. Con éste método se
puedo lograr un rendimiento de ARN total extraído en un intervalo de 4-7
µg/mL dependiendo del tejido donde se tomó la muestra. Se le agregó Et-OH
absoluto para poder eliminar todas las impurezas de la muestra, así como
desechar el ADN que en esta práctica no necesitamos. Para evaluar la pureza e
integridad del RNA extraído se hicieron lecturas de absorbancia y una
electroforesis horizontal en gel de agarosa al 2%. En esta práctica se extrajo,
cuantificó y se evaluó la pureza del ARN extraído de una muestra de bacteria,
obteniéndose como resultado
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Palabras clave: RNA, Trizol. Hidroxiquinileína, bromuro de etidio, isotiocianato
de guanidina
INTRODUCCIÓN
RNA o ARN (monocatenaria) que sigue una
dirección de 5’ a 3’. Está constituida
El ARN es la molécula que se
por una base nitrogenada (adenina,
encarga de dirigir las etapas
citosina, guanina o uracilo), una
intermedias de la síntesis de
pentosa (ribosa) y un grupo fosfato.
proteínas. Es una macromolécula
El ARN se sintetiza a partir de un
polinucleotídica de una sola cadena
segmento de ADN que servirá de
molde (transcripción), (Gregorio, ARN transferencia (ARNt): se
2012). encarga de llevar los aminoácidos a
los ribosomas con el fin de
incorporarlos al proceso de síntesis
proteica, asimismo, se encarga de
codificar la información que posee el
ARN mensajero a una secuencia de
proteínas.

Fig 1.- Estructura de ARN

El ARN cumple con diversas
funciones sirve para intermediar en
la información genética y de
catalizador en la síntesis de
proteína, es decir, el ARN copia la
información de cada gen del ADN y, Fig 3.- ARN de transferencia
luego pasa al citoplasma, donde se ARN ribosómico (ARNr): forma
une al ribosoma para dirigir la parte de los ribosomas y actúa en la
síntesis proteica. actividad enzimática, el mismo se
Se conocen los siguientes tipos de encarga de crear los enlaces
ARN o RNA: peptídicos entre los aminoácidos del
polipéptido en el proceso de síntesis
ARN mensajero (ARNm): de proteínas.
conocido como ARN codificante,
posee el código genético que
determina el esquema de los
aminoácidos para formar una
proteína;

Fig 4.- ARN ribosomal

FACTORES QUE AFECTAN LA

DEGRADACIÓN DEL ARN.
El azúcar presente en el RNA es la
Fig 2.- ARN mensajero ribosa, que posee un grupo hidroxilo
(OH) libre en la posición 2', participa
en la formación de un intermediario
en el mecanismo de hidrólisis y
determina que el RNA sea
químicamente inestable, y se
hidrolice fácilmente en una solución
acuosa alcalina. Además el ARN es
una molécula lábil, los cambios de
pH y te temperatura pueden
ocasionar su degradación por
ruptura de enlaces fosfodiéster,
(Facultad de Ciencias Exactas,
2009). Otro factor es la presencia de
RNAsas que son proteínas con
actividad enzimática presentes en
bacterias, hongos, plantas
superiores y mamíferos que
participan en procesos fisiológicos
diversos tales como: muerte celular,
replicación del DNA, transcripción,
procesamiento y edición del RNA.
Las Ribonucleasas, por tanto, son
enzimas (nucleasas) que catalizan la
hidrólisis de ARN en componentes
más pequeños. Pueden dividirse en
endonucleasas y exonucleasas, son
extremadamente comunes, lo que
resulta en periodos de vida muy
cortos para cualquier ARN en un
ambiente no protegido, (Gemma,
2014)
Que le hace el trizol al RNA
Es el agente que se emplea durante
las extracciones, principalmente de
ARN, aunque también se pueden
obtener el ADN y las proteínas con
pequeñas variaciones del protocolo.
El Trizol funciona tanto para tejidos
animales, como para vegetales.
Componentes: los principios activos
del Trizol son principalmente fenol
(un compuesto volátil tóxico)
hidroxiquinoleína, que es un
inhibidor de ARNasas, tiocianato de
guanidina, tiocianato de aminio y
glicerol.
Conservación: El TRIzol es sensible a
la luz por lo que se recomienda
guardarlo en un recipiente no
transparente y muchas veces se
aconseja que se envuelva en papel
de aluminio para más seguridad.
Descripción del reactivo: El Trizol es
un líquido rosa brillante o rosa
translucido. El olor del fenol es
extremadamente fuerte. El TRIzol
mantiene la integridad de los ácidos
nucleicos durante la
homogeneización del tejido.
Además, rompe células y
componentes celulares. La
homogenización del tejido tiene que
hacerse en frio para evitar la
degradación del ADN o el ARN, pero
una vez añadido el Trizol su
degradación se ve seriamente
reducida
Técnica de isotiocianato de
guanidina/fenol-cloroformo para
extracción de ARN total
El isotiocianato de guanidina y el
fenol se utilizan como componentes
de la solución de lisis. El
isotiocianato de guanidina es un
potente desnaturalizante de
proteínas con capacidad de inhibir
ARNsas, por lo que es ampliamente
utilizado en la extracción de ARN. El
fenol y el cloroformo se utilizan en
la extracción del ARN con los
mismos fines que en la extracción
del ADN (formar las fases orgánica y
acuosa, desnaturalizar proteínas e
inactivar nucleasas).
La solución fenólica empleada en la
extracción del ARN es ácida (pH 5 a
6), para favorecer la extracción del
ARN sobre la del ADN, ya que a pH
ácido, el ADN es retenido en la fase
orgánica y en la interfase, dejando
el ARN en la fase acuosa.
Posteriormente, el ARN es purificado
a partir de la fase acuosa mediante
precipitación a baja temperatura
con isopropanol y con ayuda de una
centrifugación de manera similar a
como se hace con ADN.
Bromuro de etidio
El bromuro de etidio que actúa
como marcador de los ácidos
nucleicos. El bromuro de etidio se
puede adquirir comercialmente
tanto en forma sólida (polvo) como
en disolución acuosa, con
concentraciones del orden del 1%,
siendo la forma diluida la de uso
más frecuente.
El bromuro de etidio en forma de
polvo es muy tóxico por inhalación.
Está clasificado como mutágeno de
categoría 2 según el Reglamento
CLP (Reglamento 1272/2008), lo que
significa que se sospecha que la
exposición crónica a bromuro de
etidio puede provocar daños
hereditarios.
polimerasa amplifica la secuencia
diana que crea los productos de
PCR. SYBR se une entonces a cada
nueva copia de ADN de doble
cadena. Por lo que el resultado es
un aumento en la intensidad de la
fluorescencia proporcional a la
cantidad de producto de PCR
producido. Se ejecuta con PCR en
tiempo real y así se puede
cuantificar la cantidad de DNA
inicial.
Además de marcar los ácidos
nucleicos puros, SYBR Green
también se puede utilizar en el
etiquetado del ADN dentro de las
células para lacitometría de
flujo y microscopía de fluorescencia.
En estos casos se requiere el previo
tratamiento con ARNasa para
reducir la cantidad de ARN en las
células.
OBJETIVOS
General Realizar una extracción de
RNA observando en electroforesis
con relación a su peso molecular.

Sybergreen
El SYBR Green se utiliza en varias METODOLOGÍA
áreas de la bioquímica y la biología
molecular. Se emplea como
colorante para la cuantificación de
ADN de doble cadena en algunos
métodos de PCR cuantitativa o para
la visualización del ADN en
la electroforesis con geles de
agarosa.
Cuando se añade colorante SYBR
Green a una muestra nucleotídica,
inmediatamente se une a todo el
ADN de doble cadena presente en la
muestra. Durante la PCR
cuantitativa, la DNA
RESULTADOS

Foto 1: Extrayendo el
sobrenadante
 Foto 2: Muestra de RNA después de
centrifugarse
Foto 5: Marcador de peso en electroforesis

Foto 3: Tubo rosa con trizol y restos de

proteínas, tubo incoloro con muestra de RNA

Foto 4: Electroforesis de RNA (3 línea)

ANÁLISIS
DE RESULTADOS
Se realizó una extracción de RNA
por medio de un raspado de células
en cajas Petri, y Trizol, para
degradar DNA, por lo que en la
electroforesis no se aprecia ninguna
línea en la parte superior, sino, se
observan dos líneas mas abajo, sin
embargo se sabe que no es RNA
total ya que no se encuentran en la
parte inferior en una sola banda, por
lo que se puede inferir que es RNA
ribosomal, una banda perteneciente
a la subunidad 23s (1500 pb) y la
otra a la subunidad 16s (1000pb).
Normalmente estas dos
subunidades tienen un peso
diferentes (23s, 2000 y 16s, 1500)
pero el cambio en el peso se podría
deber al tipo de bacteria de la cuál
se extrajo el RNA

CONCLUSIONES
Se realizó una electroforesis en gel
de Agarosa, observando
correctamente una extracción de
rRNA en la parte inferior del gel
REFERENCIAS

 Ramón Contreras. (2012).

TRIzol. 16/04/2018, de La
Guía Sitio web:
https://biologia.laguia2000.co
m/tecnicas-en-biologia/trizol
 Javier Nuñez. (2013).
Significado de ARN.
16/04/2018, de Graus Sitio
web:
https://www.significados.com/
arn/