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El ácido cítrico (ácido orgánico tricarboxilico) es un producto químico utilizado con una
gran demanda en la industria alimentaria, ya que es un conservante y/o antioxidante
que se añade en el envasado de muchos alimentos enlatados, tales como verduras o
frutos. También puede emplearse como saborizante en bebidas (regulador de acidez)
y golosinas. Está presente en la mayoría de las frutas, sobre todo en cítricos como el
limón y la naranja (Bristhar, 2010). El ácido cítrico se obtiene mediante la fermentación
de la caña de azúcar e industrialmente se emplea el microorganismo Aspergillus Niger
en tanques para cultivo sumergido.
La glucosa es la principal fuente de carbono para la obtención del ácido cítrico, este
es un intermediario en el ciclo de Krebs, que en condiciones aeróbicas da como
resultado Acetil - CoA, esta última entra en el ciclo de Krebs para formar el metabolito
de interés (ácido cítrico) (Químicas, 2012).
En cuanto al proceso de obtención del ácido cítrico se deben tomar en cuenta ciertos
factores dentro de la fermentación, tales como: el pH, la temperatura, el grado de
agitación, la aireación, entre otros; ya que si no se controlan las condiciones de
producción se obtiene una disminución en el rendimiento. Una vez terminada la
fermentación, el metabolito de interés debe ser separado del resto de los
componentes del caldo de fermentación y esto se realiza mediante dos filtraciones, la
primera para remover las células muertas de Aspergillus Níger y la segunda para
separar el citrato cálcico del ácido cítrico. Lo que se obtiene es ácido cítrico diluido
con gran cantidad de agua por lo tanto debe purificarse para obtener el producto
sólido, así que se realiza un proceso de evaporación y cristalización, una vez
formados los cristales aún contienen humedad, la cual debe ser retirada mediante
centrifugación y posteriormente secado del producto.
López Ríos et al. evaluaron el suero de leche como sustrato para la producción de
ácido cítrico utilizando Aspergillus niger NRRL 2270. Compararon la hidrólisis ácida y
enzimática de la lactosa con el fin de proporcionar al microorganismo una fuente de
carbono más asimilable.; se determinó la producción de ácido cítrico al agregar
magnesio, carboximetil celulosa (CMC), gelatina y metanol al SE y concluyeron que
Aspergillus niger NRRL 2270 es un buen microorganismo para la producción de ácido
cítrico a partir de suero de leche ya que asimila fácilmente la lactosa sin necesidad de
una hidrólisis previa.
Velásquez, J. A et at. Obtuvieron el ácido cítrico por fermentación con aspergillus Commented [MI1]: Aunque mencionaste a los autores se
debe de citar al final del párrafo la referencia
niger utilizando sustrato de plátano dominico hartón maduro. Y evaluaron la eficiencia Commented [MI2]: Aspergillus
Objetivos Particulares
1. Identificar las enzimas importantes que intervienen en la vía metabólica de
Aspergillus niger para favorecer la producción de ácido cítrico.
2. Conocer y analizar los bioprocesos que se realizan para la obtención del
ácido cítrico.
3. Entender y analizar la vía metabólica de Aspergillus niger y entender la
importancia de cada gen, enzima, y compuesto, que intervienen en la
regulación del metabolismo.
Propuesta de Investigación
Organismo Hospedero
El hongo Aspergillus niger produce diversos compuestos de gran interés para las
industrias farmacéutica y de alimentos (enzimas, ácidos orgánicos, etc.), y es el
principal productor de ácido cítrico a nivel industrial por cultivo líquido. Se ha
observado que se obtiene un alto rendimiento de ácido cítrico cuando existe una alta
acumulación de este en el micelio, que puede estar asociada con una alta
concentración de glucosa y de oxígeno disuelto en el medio líquido. Comparados
con las cepas de Penicillium, los Aspergillus producen más ácido por unidad de
tiempo, debido a que presentan baja actividad de las enzimas isocitrato
deshidrogenasa y aconitasa hidratasa, y una alta actividad de citrato sintetasa. Las
anteriores constituyen ventajas importantes si se toma en cuenta que además la
formación de productos laterales no deseados como ácido oxálico, ácido isocítrico y
ácido glucónico puede ser fácilmente suprimida.
Nueva ruta metabólica para la producción de ácido cítrico
2.- Silenciamiento del gen An02g02920 de codifica para la enzima triosa fosfato
isomerasa (TPI) que cataliza la interconversión entre gliceraldehído-3-fosfato (GADP)
y dihidroxiacetona fosfato (DHAP), reacción que tiene lugar a través de un
intermediario.
3.- Sobreexpresión del gen An0708990 que codifica para la enzima la piruvato
quinasa que cataliza la transferencia de un grupo fosfato del ADP, produciendo una
molécula de piruvato y otra de adenosín trifosfato (ATP).Con el objetivo de tener
suficiente piruvato para ingresar al ciclo de Krebs y tener suficiente energía en forma
de ATP.
5.- Sobreexpresión del gen An04g02090 que codifica para la enzima piruvato
deshidrogenasa (PDH) es un complejo multi enzimático mitocondrial de muy elevado
peso molecular que cataliza la unión del CoA al piruvato que se descarboxila rindiendo
en el proceso NADH, con el objetivo de tener suficiente Acetil-CoA, para las
posteriores reacciones.
6.-Sobreexpresión de la enzima citrato sintasa: es una enzima del grupo de las Liasas,
que cataliza la condensación del Oxalacetato y la Acetil-CoA, para formar Citrato. Esta
reacción se considera la principal vía de entrada de Carbono al ciclo, pues la Acetil-
CoA se produce en grandes cantidades durante el catabolismo de Glucidos, Lípidos
y Aminoácidos, y su oxidación en el ciclo, produce la mayor parte de la energía
metabólica.
7.- Sobreexpresión del gen An11g00510 que codifica para la enzima ATP citrato
sintasa que cataliza la reacción química:
ADP + fosfato + acetil-CoA + oxalacetato = ATP + citrato + CoA
Sus 3 productos de esta enzima son ATP , citrato y CoA. La razón de la
sobreexpresión es tener suficiente citrato para la producción de ácido cítrico.
8.- Silenciamiento del gen An08g10530 que codifica para la enzima aconitasa que
cataliza la reacción sucesiva del ciclo de Krebs, en donde el ácido cítrico es
transformado en ácido isocítrico, el objetivo del bloqueo de esta enzima es que se
acumule nuestro producto de interés y no continúe el ciclo de Krebs. Una alternativa
propuesta para bloquear esta enzima es agregar EDTA (ácido
etilendiaminotetraacético) que actúa como secuestrante de Fe, que se encuentra en
la enzima aconitasa. Otra alternativa puede ser agregando Cu que se enlaza con la
enzima aconitasa mejor que el Fe, bloqueando de este modo la reacción.
9.- Silenciamiento del gen An15g00070 que codifica para la enzima Malato
deshidrogenasa que cataliza la reacción de oxidación del (S)-malato a oxaloacetato,
para no tener una gran carga metabólica, y todo el flujo metabólico se dirija a la
producción de citrato.
GLUCÓLISIS
= Inactivación de la enzima.
=Activación de la enzima.
Figura 5: Glucolisis especifica de Aspergillus niger. Se muestran las modificaciones del ciclo.Recuperada de:
http://www.kegg.jp/kegg-bin/highlight_pathway?scale=1.0&map=ang00010&keyword=
Tabla de los genes, enzimas y reacciones que participan en el ciclo de Krebs
de Aspergillus niger.
= Inactivación de la enzima.
=Activación de la enzima.
Figura 6: Ciclo de Krebs especifico de Aspergillus niger. Se muestran las modificaciones del ciclo.
Recuperado de: http://www.kegg.jp/kegg-bin/highlight_pathway?scale=1.0&map=ang00020&keyword=
Tabla de los genes, enzimas y reacciones que participan en el ciclo de Krebs
de Aspergillus niger.
S. cerevisiae
Malato deshidrogenasa (MDH2).
Fumarato reductasa citosólica soluble (Frds1)
Fumarasa truncada (Fumis).
R. oryzae
Fumarasa truncada (FumRs)
Una cepa silvestre de Aspergillus Níger será transformada con un plásmido (vector
de sobreexpresión) que contenga los genes Fum1s y FumRs, MDH2 y Fdrs1, además
de un sistema de sobreexpresión mediana por gpdA, pyrG y trpC. Para obtener una
cepa mutante de A Níger capaz de producir citrato en grandes cantidades.
2.- Fermentación
La fermentación se llevará a cabo a través del proceso de sumergido .Es el principal
proceso en uso en el que se inocula el medio, seguido de una agitación y aeración
vigorosa controladas en grandes fermentadores. El periodo de fermentación es de 3-
5 días.
● El jarabe de dextrosa pasteurizado, se introduce al fermentador para que se
lleve a cabo el proceso de transformación de sacarosa en ácido cítrico por
medio de Aspergillus Níger.
● Aspergillus Níger se inocula en el fermentador.
● Se ajusta el pH entre 2,8 y 1,5 y se añaden nutrientes como amoniaco NH3 y
sales de fermentación (el amoniaco representa una importante fuente de
nitrógeno, útil para que se lleve a cabo la germinación y crecimiento del hongo.
● El aire estéril se burbujea dentro del fermentador. La temperatura comprendida
es entre 28°C y 33°C.
● La biomasa se conforma por el micelio y el microorganismo muerto y constituye
un subproducto o un efluente del proceso, por esta razón una vez terminada la
fermentación, el flujo es pasado por un filtro rotatorio al vacío para separar el
micelio.
5.- Cristalización
En este proceso se separan los cristales formados del líquido saturado que se
denomina licor madre. Este licor se recircula a la etapa de intercambio iónico (celdas
de carbón) o al tanque de tratamiento por cal. Los cristales de ácido cítrico húmedos
se redisuelven y se recristalizan al vacío. Luego pasan a la centrífuga en donde es
eliminado el licor madre de los cristales formados.
6.- Secado
Se realiza en un equipo de lecho fluidizado, que permite retirar humedad.
6. M. Berg, J., L. Tymoczko, J. and Stryer, L. (2008). Bioquímica. 6ta ed. España:
Reverté, pp.476-480.
7. Alejandra Muñoz-Villa, A. S.-G.-L.-S. (2014). Ácido Cítrico: Compuesto
Interesante . Revista Científica de la Universidad Autónoma de Coahuila.