INTRODUCCIÓN

La celulasa es una enzima perteneciente al grupo de enzimas conocidas como

Hidrolasas, las cuales, y generalmente se encuentran de forma extracelular en los
microorganismos que la poseen, a su vez esta enzima es producida por una amplia
variedad de bacterias y hongos aeróbicos o anaeróbicos, mesófilos o termófilos, las
bacterias celulolíticas más abundantes y conocidas son las aerobias, algunos
ejemplos de ellas son los siguientes:
Cellulomonas sp.

Vibrio sp.

Bacillus sp.

Pseudomonas sp.

Cytophagas sp.

La celulosa es el principal componente de los tejidos vegetales, es una

macromolécula no ramificada de longitud variable, conformada por monómeros de
glucosa unidos entre sí por enlaces Beta-1,4 dando origen a micro fibrillas
cristalinas, la cual es un polímero insoluble.
Existen diferentes procedimientos para la identificación y enumeración de
microrganismos capaces de utilizar la celulosa, siendo la base de estos la hidrolisis
de los sustratos celulósicos, entre ellos destaca el uso de medio de cultivo Rojo
Congo, porque permite evidenciar la hidrolisis de polisacáridos, debido a que el
colorante forma complejos con las moléculas no hidrolizadas, así mismo facilita la
diferenciación entre microrganismo celulolíticas y no celulolíticas mediante zonas
de aclaramiento alrededor de la colonia. La actividad del sistema enzimático en el
complejo celulolítico se determina a través de la cantidad de glucosa liberada
mediante la prueba de DNS, en esta técnica se demuestra la presencia del grupo
carbonilo libre de los azucares reductores que implica la oxidación del grupo
funcional aldehído de la glucosa, así, este método funciona de manera cuantitativa.
Dentro del programa de gestión ambiental de este sector los residuos sólidos
generados son tratados en pilas de compostaje, sin embargo, otra alternativa
biotecnológica es la utilización de microorganismos celulíticos capaces de degradar
Dentro del programa de gestión ambiental de este sector los residuos sólidos
generados son tratados en pilas de compostaje, sin embargo, otra alternativa
biotecnológica es la utilización de microorganismos celulíticos capaces de degradar
Dentro del programa de gestión ambiental de este sector los residuos sólidos
generados son tratados en pilas de compostaje, sin embargo, otra alternativa
biotecnológica es la utilización de microorganismos celulíticos capaces de degradar
estos residuos, con la consecuente producción de azúcares fermentables que a su
vez puedan ser usados como sustrato glicosídico natural.
Los principales factores del medio ambiente que afectan la transformación son el
nivel de nitrógeno disponible, la temperatura, aireación, humedad, pH, la presencia
de otros carbohidratos y la proporción relativa de lignina en los restos vegetales
(Alexander, 1980).
El polisacárido está localizado en la pared celular donde se encuentra como
unidades submicroscópicas de forma alargada conocidas como micelas. A su vez,
estas micelas se arreglan en estructuras más grandes, las microfibrillas, las cuales
están suficientemente empaquetadas para prevenir la penetración no sólo de
enzimas sino de pequeñas moléculas semejantes al agua (Lynd, et al, 2002).
Estructuralmente, la celulosa es un carbohidrato compuesto de unidades de glucosa
unidas en una larga cadena lineal por enlaces β en los átomos de carbono 1 y 4 de
la molécula de azúcar.
Una importante característica de la celulosa, relativamente inusual de los
polisacáridos es su estructura cristalina, sin embargo las fibras individuales no son
puramente cristalinas, lo que genera regiones amorfas y contienen espacios en sus
microfibrillas lo cual permite la formación de microporos y capilares lo
suficientemente espaciosos para permitir la penetración de moléculas relativamente
grandes incluyendo, en algunos casos enzimas celuloliticas (Lynd, et al, 2002).
Finalmente este arreglo asimétrico que caracteriza las regiones amorfas es crucial
para la biodegradación de la celulosa (Malherbe y Cloete, 2002)
Objetivos
Objetivo general:
microorganismos presentes en el ambiente con potencial de ser sujetos para
la biodegradación de material compuesto de celulosa. .

Objetivos específicos:

 Obtención de un consorcio microbiano a partir de lixiviado de residuo vegetal

del compostaje.

 Elaboración de un medio de cultivo selectivo el cual nos permita la

identificación cualitativa de microorganismos con actividad celulolítica.
Justificación
En la búsqueda de fuentes alternativas que sean menos contaminantes, renovables y
económicamente más accesibles, la obtención de microorganismos con actividad
celulítica son necesarios dentro del programa de gestión ambiental de este sector
los residuos sólidos generados son tratados en pilas de compostaje, sin embargo, otra
alternativa biotecnológica es la utilización de microorganismos celulíticos capaces de
degradar estos residuos, con la consecuente producción de azúcares fermentables que
a su vez puedan ser usados como sustrato glucosídicos naturales por lo que resulta
una opción económicamente accesible y ecológicamente amigable en comparación a
los procesos convencionales.

Hipótesis
Los microorganismos nativos aislados de la composta y residuos agroindustriales en
descomposición tienen la capacidad de producir diversos tipos de enzimas celulolíticas con
potencial para degradar residuos dañinos al ambiente.

Metodología:

1. Colecta de muestra.
1.1 Toma de muestra de lixiviado de composta orgánica.
El muestreo del lixiviado de residuo vegetal se realizó a partir del compostaje
ubicado en la Universidad Politécnica del Estado de Morelos localizada en Blvd.
Paseo Cuauhnáhuac 566, Lomas del Texcal, 62574 Jiutepec, Mor.

2. Cultivo de microorganismos obtenidos de la muestra.

2.1 Preparación de medio agar-nutritivo.
Reactivos Cantidad (gr/100ml)
Peptona 0.5
Extracto de levadura 0.3
Agar- agar 1.5
pH 6.8 a 25º C

NOTA: Este medio nos permite la obtención de microorganismos en general

ya que dispone de nutrientes y condiciones adecuadas para su crecimiento.
2.2 Preparación de diluciones seriadas 1: 10 de la muestra lixiviado llevando a
cabo 5 diluciones
Homogeneizar 1 mL de la muestra del lixiviado en 9 mL de agua destilada estéril.
Efectuando diluciones de la siguiente manera (2.2.1-2.2.5)

2.2.1 Tomar del tubo “1” 1mL de lixiviado y verter en el tubo “2” que contiene
agua estéril y homogenizar el contenido del tubo.

2.2.2 Tomar del tubo “2” 1mL de lixiviado y verter en el tubo “3” que contiene agua
estéril y homogenizar el contenido del tubo.
.

2.2.3 Tomar del tubo “3” 1mL de lixiviado y verter en tubo “4” que contiene agua
estéril y homogenizar el contenido del tubo.
.

2.2.4 Tomar del tubo “3” 1mL de lixiviado y verter en tubo “4” que contiene agua
estéril y homogenizar el contenido del tubo.

2.2.5 Tomar del tubo “4” 1mL de lixiviado y verter en tubo “5” que contiene agua
estéril y homogenizar el contenido del tubo.
2.2.6 Sembrado de cajas de las distintas diluciones (1D, 2D, 3d, 4d) en condiciones
aerobias.
2.2.7 Sembrado de cultivo puro en condiciones de anaerobiosis.
NOTA: Incubar a 35-37 ºC durante 24-48 horas.

3. Aislado de microorganismos con posible actividad celulolítica.

3.1Preparación de medio CMC (1% sin rojo Congo)

Reactivos Cantidad (g/L)

Carboximetilcelulosa (CMC) 10
Peptona universal 2.5
Sulfato de amonio 0.5
Cloruro de calcio 0.5
Fosfato monobásico de potasio 0.1
Fosfato dibasico de potasio 0.1
Agar-agar 15
Ajustar pH a 7 +/- 2

3.2 Sembrado de colonias aisladas obtenidas en el cultivo anterior.

4. Identificación o caracterización cualitativa de la actividad celulolítica

a través de medio selectivo.
 4.1 Preparación de medio rojo Congo (1% con CMC y sin extracto
de levadura)

Reactivos Cantidad (g/L)

Carboximetilcelulosa (CMC) 10
Peptona universal 2.5
Sulfato de amonio 0.5
Cloruro de calcio 0.5
Fosfato monobásico de potasio 0.1
Fosfato dibasico de potasio 0.1
Agar-agar 15
Rojo Congo 1% 1 ml
Ajustar pH a 7 +/- 2

Reactivos Cantidad (g/L)

Rojo Congo 10
NaCl 100

4.2 Resembrado de colonias aisladas obtenidas del medio CMC al

1%.

4.3 Identificación cualitativa de la actividad celulolítica por medio de

la Prueba cualitativa con Rojo Congo.

Usado en ensayos para evidenciar la hidrólisis de polisacáridos debido a

que el colorante forma complejos con las moléculas aún no hidrolizadas,
facilitando así la diferenciación entre microorganismos celulolíticos y no
celulolíticos por la formación de zonas de aclaramiento alrededor de las
colonias (Hendricks, et al., 1995).
Colecta y almacenamiento de la muestra.

Figura 2. Almacenamiento de la muestra a 4ºC durante 7 días.

Figura 1 Toma de muestra del lixiviado del
compostero.

Preparación de medio de cultivo Agar Nutritivo y rojo Congo 1%.

Figura 3. Preparación y esterilización de

medio Agar nutritivo. Figura 4. Preparación y esterilización de Rojo Congo al 1%.

Cultivo de microorganismos obtenidos de la muestra con diferentes

diluciones y en condiciones de anaerobiosis.
 Plaqueo de medio CMC 1% con Rojo Congo.

Figura 5. Obtención de microorganismos con actividad Figura 6. Obtención de microorganismos con actividad
celulolítica en medio CMC 1% en condiciones aerobias. celulolítica en medio CMC 1% en condiciones anaerobiosis.

Figura 7. Plaqueo del medio CMC 1% con rojo Figura 8. Incubación del medio CMC 1% con rojo Congo
a temperatura ambiente.
Congo.

Identificación y caracterización cualitativa de la actividad celulolítica con las

diferentes diluciones en medio CMC 1% con Rojo Congo.

Figura 9. Caracterización cualitativa de la activad Figura 10. Caracterización cualitativa de la activad

celulolítica (dilución E-2) a las 12 hrs de crecimiento. celulolítica (dilución E-3) a las 12 hrs de crecimiento.

Figura 11. Caracterización cualitativa de la activad Figura12. Figura Caracterización cualitativa de la activad
celulolítica (dilución E-4) a las 12 hrs de crecimiento. celulolítica (dilución E-5) a las 12 hrs de crecimiento.
 ANALISIS DE LOS RESULTADOS

Fig.1. Crecimiento de bacterias con actividad Fig.2. Crecimiento de bacterias con actividad
celulolítica en agar rojo congo y CMC 1%. celulolítica en agar rojo congo y CMC 1%.

Fig.4. A la izquierda (Fig.2.) podemos apreciar el crecimiento

Fig.3. Hongo con actividad pectinasa
sembrado en agar rojo congo y CMC 1%.
de bacterias con actividad celulolítica en agar rojo congo y
CMC 1%, en esta caja se puede observar una disminución en
la tonalidad del medio en la parte de los extremos de la caja y
un aumento de color rojo al centro, mientras que a la derecha
(Fig.1.) se observa una coloración uniforme dentro de toda la
caja.

En las imágenes anteriores podemos observar los resultados más representativos de la identificación de microorganismos con
actividad celulolítica, obteniendo distintas formas de crecimiento, cada una representaba un crecimiento particular, en la Fig.1.
podemos observar como las bacterias que crecían en el medio lo hacían de forma lineal sobre el paso del asa bacteriológica, mientras
que en el segundo caso (Fig.2.), se puede notar la segregación de una mucosa perteneciente a la bacteria, la cual se esparció a lo largo
de la caja de cultivo. En la Fig.3. con la finalidad de obtener un control, se sembro un hongo con actividad previamente conocida
(pectinasa) y suponiendo que el hongo segregaría enzimas capaces de degradar la celulosa debido a su origen (cascara de pepino),
encontrándonos con la inhibición del crecimiento del mismo y convirtiéndose en un control negativo para crecimiento de este mismo
en medio CMC 1% y rojo congo. A sí mismo en la FIg.4. podemos observar las distintas tonalidades del medio rojo congo 48 horas
post-siembra de las cepas aisladas con anterioridad.
Conclusión

Para finalizar con el anterior procedimiento, se llegó a las siguientes afirmaciones:

- Los microorganismos que crecieron en el medio CMC 1% con rojo congo poseen actividad
celulasa.
- El hongo que se utilizó como control de positivo para actividad pectinasa no posee actividad
celulasa o bien, su crecimiento se vio inhibido debido a que el medio CMC 1% con rojo congo
no contenía los requerimientos nutricionales secundarios para su desarrollo.
- Las bacterias que presentaron crecimiento en el medio CMC 1% con rojo congo, las cuales
son presentadas en la Fig.1. del apartado de análisis de resultados, podrían tener actividad
celulasa de tipo membranal, esto debido a que el cambio de coloración del medio solo se
notaba ligero alrededor de las colonias aisladas.
- Las bacterias que presentaron crecimiento en el medio CMC 1% con rojo congo, las cuales
son presentadas en la Fig.2. del apartado de análisis de resultados, tienen actividad
celulolítica, pero estas la presentan en forma de excreción de enzimas, las cuales se podrían
encontrar presentes en la mucosa que es excretada de la misma forma por la bacteria,
teniendo así una forma de degradar los polímeros de celulosa.
- La carboximetil celulosa o CMC debe de tener una tiempo de preparación previo de 24 horas
para poder ser utilizada de forma sencilla en el proceso de elaboración del medio CMC 1%,
además de que debe de estar expuesta a pH alcalino para disociar un poco las cadenas de
polímeros (Estamos bien pendejos).
REFERENCIAS


 Ayala, S: Sànchez, D. 2001 Caracterización y evaluación de la actividad
celulolítica de microorganismos aislados a partir de composta. Microbiología
Industrial. Facultad de Ciencias. Pontificia Universidad Javeriana. Bogotá.
 Ranby, B.G.; Rydholm, S.A. IX Cellulose and Cellulose Derivatives. En High
Polymers. Vol. X, Polymers Processes.

 Schildknecht. C.E, Ed. Interscienced Publishers INC., New York. pp. 353- 1963.

 Klemm, D.; Philipp, B.; Heinze, T.; Heinze, U.; Wagenknecht, W.

Comprenhensive Cellulose Chemistry. Vol. 1, Fundamentals and Analytical
Methods.