“Técnicas para la toma de muestra, preparación y procesamiento del cariotipo”

El ácido desoxirribonucleico es la molécula que porta la información genética que es transmitida por
herencia entre las generaciones y que contiene la información esencial para: la formación de un
nuevo organismo y para las células de dicho organismo durante su vida. Esta molécula está
presente en casi todas las células del organismo por lo que su extracción es bastante fácil de
conseguir por cualquier muestra biológicas, como cabello, huesos, semen, saliva, sangre, entre
otros.
El análisis cromosómico proporciona un conocimiento básico de los cambios genéticos
responsables de las cromosomopatías y, en el caso del cáncer, de los procesos que suceden
durante la transformación maligna de las células tumorales. Durante las últimas décadas se han
descrito un elevado número de alteraciones cromosómicas recurrentes frecuentemente asociadas
con subtipos tumorales particulares. Además, estas aberraciones citogenéticas han contribuido a
establecer en muchos casos el pronóstico de la enfermedad y en algunos incluso indicar
tratamientos específicos. Por todo ello, muchas decisiones terapéuticas están basadas en estos
hallazgos genéticos.
A los estudios citogenéticos convencionales desarrollados en la década de los sesenta se han
añadido en los últimos años otras metodologías que han permitido mejorar la sensibilidad y la
especificidad de los hallazgos citogenéticos. Estos sistemas son derivadas de la hibridación in situ
fluorescente (HISF). Las más usadas han sido la hibridación genómica comparada (HGC), la HISF
multicolor o SKY y la HISF de bandeo multicolor (Rx FISH), que, junto con la reacción en cadena de
la polimerasa (PCR), ocurren permitido profundizar en el diagnóstico citogenético de las
cromosomopatías.
A continuación, se desarrollará la técnica de reacción en cadena de la polimerasa (PCR):

Técnica de PCR:
La molécula de ADN tiene una gran estabilidad, lo que facilita su transporte y almacenamiento, y
esto hace posible que se pueden mantener congeladas muestras durante mucho tiempo y realizar
estudio genéticos posteriores.
Mediante la técnica de PCR es posible amplificar la molécula de ADN de forma exponencial en el
laboratorio, y para realizar un análisis genético se necesita una mínima o muy poca cantidad de
muestra, ya que, a partir de una sola molécula de ADN se pueden obtener millones de copias, ya
que esta molécula se puede separar.
La PCR se utiliza en muchas áreas de la biología y la medicina, como la investigación en biología
molecular, el diagnóstico médico, ya sea en microbiología como virus, bacterias y parásitos, para
huellas genéticas, como demostrar paternidad, violaciones, entre otros.
Al igual que la replicación de ADN en un organismo, la PCR requiere de una enzima ADN polimerasa
que produzca nuevas cadenas de ADN mediante el uso de las cadenas existentes como molde. La
ADN polimerasa que normalmente se utiliza en la PCR se llama Taq polimerasa, por la bacteria
tolerante al calor de la que se aisló (Thermus aquaticus).
Esta bacteria vive en aguas termales y fuentes hidrotermales. Su ADN polimerasa es muy
termoestable, por lo que es ideal para la técnica de PCR, ya que esta utiliza altas temperaturas
repetidamente para desnaturalizar el molde de ADN o separar sus cadenas.
Al igual que otras ADN polimerasas, la Taq polimerasa solo puede hacer ADN si hay un cebador,
una corta secuencia de nucleótidos que proporciona un punto de partida para la síntesis de ADN.
En una reacción de PCR, la región de ADN que será copiada, o amplificada, se determina por los
cebadores que él o la investigadora elija.
Los cebadores para PCR son pedazos cortos de ADN de cadena sencilla, generalmente de
unos 202020 nucleótidos de longitud. En cada reacción de PCR se utilizan dos cebadores que están
diseñados para flanquear la región blanco (la región que debe ser copiada). Es decir, les agregan
secuencias que harán que se unan a cadenas opuestas del molde de ADN solo en los extremos de
la región a copiar. Los cebadores se unen al molde mediante complementariedad de bases. Cuando
los cebadores se unen al molde, la polimerasa los extiende y la región que se encuentra entre ellos
se copia.
Pasos de la PCR
Los ingredientes clave para una reacción de PCR son Taq polimerasa, cebadores, ADN molde y
nucleótidos (los bloques básicos del ADN). Los ingredientes se colocan en un tubo, junto con los
cofactores que necesite la enzima, y se someten a ciclos repetidos de calentamiento y enfriamiento
que permiten la síntesis del ADN.
Los pasos básicos son:
 Desnaturalización: la reacción se
calienta bastante para separar, o
desnaturalizar, las cadenas de ADN. Esto
proporciona los moldes de cadena
sencilla para el siguiente paso.
 Templado: la reacción se enfría para que
los cebadores puedan unirse a sus
secuencias complementarias en el molde
de ADN de cadena sencilla.
 Extensión: la temperatura de la reacción
se eleva para que la Taqpolimerasa
extienda los cebadores y sintetice así
nuevas cadenas de ADN.
Este ciclo se repite 25-35 veces en una reacción de PCR típica, que generalmente tarda 24 horas,
según la longitud de la región de ADN que se copia. Si la reacción es eficiente, puede producir miles
de millones de copias a partir de una o unas cuantas copias de la región blanco; eso es porque no
solo se usa el ADN original como molde en cada ciclo. En realidad, el nuevo ADN que se produce
en una ronda puede servir como molde en la siguiente ronda de síntesis de ADN.
Habitualmente, los resultados de una reacción de PCR se visualizan al usar electroforesis en gel,
que es una técnica en la que una corriente eléctrica impulsa fragmentos de ADN a través de una
matriz de gel y los fragmentos de ADN se separan según su tamaño. Típicamente se incluye un
estándar, o marcador de peso molecular, para que pueda determinarse el tamaño de los fragmentos
en la muestra de PCR.
La técnica de Southern blot

La técnica de Southern blot la desarrolló, en 1975, Edwin Southern y es una estrategia estándar
para analizar ADN previamente digerido con enzimas de restricción.

Esta técnica se utiliza para determinar la presencia de un gen o fragmentos del ADN específicos en
una mezcla de ácidos nucleicos previamente extraídos.

Se basa en la aplicación de dos procesos fundamentales: la desnaturalización o separación de las

cadenas complementarias del ADN y la hibridación o unión de dos cadenas complementarias. Este
fundamento es compartido por todas las técnicas de hibridación.

Procedimiento técnico
1. Extracción:
Se aísla el ADN de cualquier célula del
organismo excepto de glóbulos rojos, ya que
carecen de núcleo.
Para el análisis molecular de un paciente, el
ADN puede obtenerse de linfocitos. Sin
embargo, la extracción puede hacerse
también de otras fuentes: cultivos celulares,
células de líquido amniótico, vellosidades
coriónicas o cualquier órgano biopsiado.
2. Digestión del ADN con
endonucleasas de restricción:
Una vez extraído el ADN, se digiere con enzimas de restricción y los fragmentos se separan por
electroforesis en geles de agarosa, de acuerdo con su carga/masa.
3. Electroforesis en Gel de agarosa:
Los fragmentos se separan por electroforesis en geles de agarosa, de acuerdo con su carga/masa.
En algunas ocasiones se utilizan geles de acrilamida cuando los fragmentos que se van a separar
son muy pequeños. En este procedimiento electroforético, como ya se mencionó, las muestras se
someten a un campo eléctrico; como los fragmentos de ADN tienen carga negativa (por sus grupos
fosfato) todos se mueven en la misma dirección hacia el electrodo positivo, y los fragmentos más
pequeños migran más rápidamente.
Las moléculas de ADN separadas pueden visualizarse mediante su tinción con bromuro de etidio.
En este momento el procedimiento no es informativo, debido a que el fragmento de interés se
encuentra inmerso en millones de fragmentos creados por las enzimas de restricción.

4. Preparación del Southern blot

El ADN se desnaturaliza para obtener cadenas sencillas, mediante un proceso químico,

generalmente por tratamiento con álcalis. A continuación, los fragmentos se transfieren del gel a un
soporte sólido, como membranas de nitrocelulosa o de nailon. Existen diferentes métodos para la
transferencia, como la capilaridad, el vacío o la electrotransferencia. Es importante señalar que la
finalidad de la transferencia es crear una réplica de lo que se tenía en el gel, ahora en un soporte
mucho más sólido, como es una membrana.

5. Hibridacion con sonda radioactiva:

Por último, para identificar uno o más fragmentos entre millones de fragmentos, se utiliza una sonda
específica marcada con alguna molécula reportera (por ejemplo, “radiactividad”, 32P-dCTP). La
sonda se pone en contacto con la membrana de nitrocelulosa y en aquellos lugares en donde la
sonda encuentre su secuencia complementaria se pegará. La sonda emitirá radiactividad, la cual se
detectará mediante un proceso de revelado con placas de rayos X. La emisión de la sonda
corresponderá únicamente al fragmento de interés.

6. Detección de los RFLP por vía autoradiográfica:

La localización de las zonas radioactivas en el southern blot es detectada en la autoradiografía. En

esta técnica, la membrana de nilón se coloca debajo de un film de rayos-x en un contenedor de luz,
este imprime la localización de las zonas radioactivas.

7. Re-utilización del Southern blot con sondas adicionales:

En los análisis de ADN forenses, se investiga el polimorfismo del ADN de diferentes cromosomas.
Después de revelado el Autorad del locus estudiado, se puede lavar la radioactividad con el southern
blot con soluciones a temperaturas altas y luego se coloca otra sonda radioactiva y repetir los pasos
5-7. Este set obtenido así es denominado perfil de ADN.