Disciplina:

BIOLOGIA MOLECULAR

Prof. Dr. José Ferreira Marinho Júnior

Paulista – 2017.2
PRIMER
• Conceito de primer de PCR
Os primers são fitas de DNA, complementares, isto é se ligam por
complementaridade ao início da sequência de DNA que se quer multiplicar.

• Como desenhar um primer?????

Escolha do alvo, região conservada do DNA:

- Consultar bancos de genes (Ex.: GenBank)
 • Breve Histórico Genoma
• Início anos 80 – início discussões sobre mapeamento

• 1984 – EUA – lançamento programa efetivo para mapeamento do

genoma (HGP, Human Genome Program), pouco tempo depois,
laboratórios do Japão, Europa e Austrália se uniram ao trabalho

• Em abril de 2003, a finalização do Projeto Genoma Humano

(HGP ou PGH) foi noticiada por vários meios de comunicação
como sendo a “decifração do código genético humano”.
• O mais surpreendente da descoberta foi o número de genes: de
30 a 40 mil, sendo que o esperado era o de pelo menos 100 mil
deles.
• Atualmente... SABE-SE A SEQUENCIA DOS GENES... ENTRETANTO.
Não representam 100% do GENOMA, em virtude de sequências
não-codificadoras
Desenho dos primers
Desenho dos primers

As primeiras reações de PCR utilizavam primers

projetados manualmente, ou seja, baseados
inicialmente apenas na sua complementaridade com
a seqüência alvo

Primeiro passo ??????

Sequência a qual deseja se amplificar

Desenho dos primers
 Tamanho dos primers

 Muito curto -> baixa especificidade resultando em

amplificação não específica ,

Muito longo -> diminui a eficiência de ligação ao DNA

molde em temperatura normal de anelamento devido à
maior probabilidade de formação de estruturas
secundárias
Desenho dos primers
 Tamanho dos primers
Normalmente de 18 a 28 bases
 Probabilidade de encontrar uma das 4 bases no DNA - ¼;

 Probabilidade de encontrar um dinucleotdeo

qualquer - 1/16;

 Probabilidade de encontrar uma qualquer seqüência

de 4 bases - 1/256;

 Probabilidade de encontrar uma seqüência qualquer

de 16 bases – 1/4 294 967 296.
Desenho dos primers
 Tamanho do amplicon

 150-1000 bp para PCR comum, evitar >3 kb

 Evitar amplicons muito curtos para poder

distinguí-los de possíveis dímeros de primers!
Desenho dos primers
 Temperatura de Melting

A temperatura na qual 50% da dupla fita de DNA se dissocia

para fita simples

 Determinado pelo comprimento, composição de base e

concentração dos primers no mix da PCR
 Desenho dos primers
 Temperatura de Anelamento
(Ta)

Ta ótima
52°C - 60°C
Ta baixo aumenta a eficiência da PCR mas diminui a especificidade
Ta alto aumenta a especifcidade mas diminui efciência da PCR
Ta >65°C pode ser recomendado para a amplificação de alvos com
elevado conteúdo de GC
• Exercício
Sobre os nossos Genes, Genoma...
• Nosso genoma é formado por aproximadamente 30 mil genes. (Verdadeiro)
(V ou F?)

• Estes genes representam 100% de nosso genoma. (V ou F?)

• FALSO... Sequências não codificadoras.

• Nossos genes são formados por polímeros de nucleotídeos?Verdadeiro

• Nossos genes podem ser transferidos, artificialmente, de uma espécie

a outra? Verdadeiro

• A seqüência de bases nitrogenadas de alguns genes determina a

seqüência de aminoácidos nas proteínas?
Verdadeiro
• Exercício
Sobre os primers...
Considere a necessidade de amplificação da sequência de 120 pares de
base (pb) abaixo demonstrada.

5’-CTGGCCTCAA TCTCACAGTC TGCCTGCATC CGCGTACTCT

GCCCTCATTC CGCGTGCAGG
ACTATGACGT AGCAGCAGGT GACCTTTACG GAGGATAAGA
GCAATGCGCT TATTACAGTG-3’

Marque a opção que apresenta, respectivamente, os iniciadores senso e

antissenso:

(A) 5’-GACTGTGAGATTGAGGCCAG-3’ e 5’-CACTGTAATAAGCGCATTGC-3’.

(B) 5’-CTGGCCTCAATCTCACAGTC-3’ e 5’-GCAATGCGCTTATTACAGTG-3’.
(C) 5’-GACTGTGAGATTGAGGCCAG-3’ e 5’-GTGACATTATTCGCGTAACG-3’.
(D) 5’-GACCGGAGTTAGAGTGTCAG-3’ e 5’-GCAATGCGCTTATTACAGTG-3’.
(E) 5’-CTGGCCTCAATCTCACAGTC-3’ e 5’-CACTGTAATAAGCGCATTGC-3’.
• Exercício
Sobre os primers...
Considere a necessidade de amplificação da sequência de 120 pares de
base (pb) abaixo demonstrada.

5’-CTGGCCTCAA TCTCACAGTC TGCCTGCATC CGCGTACTCT

GCCCTCATTC CGCGTGCAGG
ACTATGACGT AGCAGCAGGT GACCTTTACG GAGGATAAGA
GCAATGCGCT TATTACAGTG-3’

Marque a opção que apresenta, respectivamente, os iniciadores senso e

antissenso:

(A) 5’-GACTGTGAGATTGAGGCCAG-3’ e 5’-CACTGTAATAAGCGCATTGC-3’.

(B) 5’-CTGGCCTCAATCTCACAGTC-3’ e 5’-GCAATGCGCTTATTACAGTG-3’.
(C) 5’-GACTGTGAGATTGAGGCCAG-3’ e 5’-GTGACATTATTCGCGTAACG-3’.
(D) 5’-GACCGGAGTTAGAGTGTCAG-3’ e 5’-GCAATGCGCTTATTACAGTG-3’.
(E) 5’-CTGGCCTCAATCTCACAGTC-3’ e 5’-CACTGTAATAAGCGCATTGC-3’.
• Exercício
Sobre os primers...
Considere a necessidade de amplificação da sequência de 120 pares de
base (pb) abaixo demonstrada.

5’-CTGGCCTCAA TCTCACAGTC TGCCTGCATC CGCGTACTCT

GCCCTCATTC CGCGTGCAGG
ACTATGACGT AGCAGCAGGT GACCTTTACG GAGGATAAGA
GCAATGCGCT TATTACAGTG-3’

Marque a opção que apresenta, respectivamente, os iniciadores senso e

antissenso:

(A) 5’-GACTGTGAGATTGAGGCCAG-3’ e 5’-CACTGTAATAAGCGCATTGC-3’.

(B) 5’-GACTGTGAGATTGAGGCCAG-3’ e 5’-GTGACATTATTCGCGTAACG-3’.
(C) 5’-CTGGCCTCAATCTCACAGTC-3’ e 5’-GCAATGCGCTTATTACAGTG-3’.
(D) 5’-GACCGGAGTTAGAGTGTCAG-3’ e 5’-GCAATGCGCTTATTACAGTG-3’.
(E) 5’-CTGGCCTCAATCTCACAGTC-3’ e 5’-CACTGTAATAAGCGCATTGC-3’.