lOMoARcPSD|2610911

Práctica 7 - Cuantificación de Microorganismos Totales

Microbiología Experimental (Universidad Nacional Autónoma de México)

Su distribución está prohibida | Descargado por Mirna Ortiz (mirnacabrera92@yahoo.com)

 lOMoARcPSD|2610911

MICROBIOLOGÍA EXPERIMENTAL

Grupo: 6 Horario: Lunes y Miércoles (13:00 – 16:00) Equipo: 2

Integrantes: Correa García, Víctor Josué
Torres Santander, Fernando

Informe práctico7:«Cuantificación de Microorganismos Totales»

Existen numerosos métodos que permiten establecer el número de microorganismos en una determinada
muestra. Los resultados de dichos métodos nos son de utilidad para interpretar el grado de contaminación
bacteriana, estandarizar la concentración de inóculos, entre otras cosas.
En general los ensayos de cuantificación microbiana se agrupan de distinta manera, dependiendo del tipo
de aplicación, la determinación de la cantidad total de microorganismos incluye el conteo de
microorganismos tanto vivos como muertos, en cuanto a la determinación de viables, únicamente incluye
la cantidad de microorganismos vivos.
Keywords: Cuantificación de Totales, Método de Breed, Nefelometría, Reductasas.

Resultados

Durante el desarrollo de la práctica se realizó la Finalmente se obtuvo el promedio para posteriormente

determinación de la cuantificación de microorganismos estimar la cantidad total de levaduras presente en un 1
totales, esto se llevó a cabo mediante la utilización de mL de muestra.
tres tipos de pruebas diferentes:
. Promedio de levaduras / Campo = 20 levaduras
Prueba Microorganismo Cuantificado
Breed Saccharomyces Cerevisiae b) Nefelometría
Nefelometría E. coli y C. freundii Para esta prueba se requiriórealizar una calibración del
Reductasas Microorganismos Aerobios espectrofotómetro la cual se construyó utilizando la
escala de McFarlandobteniendo así dos curvas de
Tabla 1. Microorganismos cuantificados en las calibración.
pruebas de cuantificación total.
Tubo [E. coli] U. Klett
a) Método de Breed 1 300 x 106 48
Para realizar esta prueba se utilizó un volumen conocido 2 600 x 106 101
de la muestra de levaduras (10 µL) por medio del empleo 3 900 x 106 155
de un asa calibrada. Este volumen se extendió de manera 4 1200 x 106 193
uniforme en un área marcada de 1cm2 en un 5 1500 x 106 278
portaobjetos. Posteriormente se realizó la determinación 6 1800 x 106 281
del diámetro del campo del microscopio el cual fue de 18 7 2100 x 106 340
divisiones, es decir, 0.18 mm. 8 2400 x 106 390
9 2700 x 106 600
Se realizó una tinción de Gram de la muestra y se 10 3000 x 106 495
observó el portaobjetos al microscopio, se realizó el
conteo de 5 campos, obteniendo así: Tabla 3. Resultados de la calibración B
No. de campo Cantidad de levaduras
1 25
2 15
3 17
4 9
5 33

Tabla 2. Levaduras contadas por campo.

Microbiología Experimental Química Farmacéutico Biológica

Su distribución está prohibida | Descargado por Mirna Ortiz (mirnacabrera92@yahoo.com)

 lOMoARcPSD|2610911

MICROBIOLOGÍA EXPERIMENTAL

Grupo: 6 Horario: Lunes y Miércoles (13:00 – 16:00) Equipo: 2

Tubo [E. coli] U. Klett Debido a que el coeficiente de correlación es mayor en la
1 300 x 106 50 curva C, se utilizó esta curva para realizar las
2 600 x 106 95 determinaciones posteriores.
6
3 900 x 10 160
4 1200 x 106 196 Las muestras problemas que se utilizaron fueron
5 1500 x 106 273 Escherichia Coli y Citrobacter freundii.
6 1800 x 106 310
7 2100 x 10 6
320 Los resultados obtenidos de la nefelometría fueron:
8 2400 x 106 397
9 2700 x 106 435 U. Klett U. Klett
Hora
E. coli C. freundii
10 3000 x 106 505
8:00 0 0
Tabla 4. Resultados de la calibración C 8:30 28 30
9:00 43 55
A partir de los datos anteriores se obtuvieron las gráficas 9:30 135 268
de calibración. 10:00 234 500
10:30 400 500
11:00 475 530
Curva de calibración del 11:30 430 410
espectrofotómetro B 12:00 600 425
700
12:30 350 370
600 320 281
y = 2E-07x - 16.4 13:00
500 R² = 0.9272 13:30 630 312
Unidades Klett

400 14:00 360 380

14:30 320 -
300
200 Tabla 5. Resultados de nefelometría para E. coli y C.
100
freundii
0 c) Reductasas
0 2E+09 4E+09 Esta prueba se realizó para cuantificar los
[E. coli] microorganismos presentes en tres tipos de muestras
diferentes de leche (Bronca o cruda, pasteurizada y
Figura 1. Curva de calibración B ultrapasteurizada).
La prueba consistió en agregar en un tubo de ensayo 10
Curva de Calibración del gotas del indicador redox y 10 mL de la muestra de
Espectrofotómetro C leche. Para la prueba se utilizaron dos tipos distintos de
600 indicadores, el azul de metileno y la resazurina
500 y = 2E-07x + 5.1333 Los resultados obtenidos fueron los siguientes:
Unidades Klett

R² = 0.9909
400
300
Tiempo de cambio en la
Muestra
coloración
200
Leche Bronca < 20 min
100 Leche
0
5.3 – 8 horas
Pasteurizada
0 2E+09 4E+09 Leche
[E. coli] Más de 8 horas
Ultrapasteurizada

Figura 2. Curva de Calibración C Tabla 6. Resultados para muestras con azul de

metileno

Microbiología Experimental Química Farmacéutico Biológica

Su distribución está prohibida | Descargado por Mirna Ortiz (mirnacabrera92@yahoo.com)

 lOMoARcPSD|2610911

MICROBIOLOGÍA EXPERIMENTAL

Grupo: 6 Horario: Lunes y Miércoles (13:00 – 16:00) Equipo: 2

Muestra Tonalidad
Leche Bronca Blanca Concentración Concentración
Hora
Leche Pasteurizada Rosa E. coli C. freundii
Leche Ultrapasteurizada Violeta-Rosa 08:00 0 0
Tabla 7. Resultados para muestras con resazurina. 08:30 1.40E+08 1.53E+08
09:00 2.32E+08 3.06E+08
Análisis de resultados 09:30 7.97E+08 1.61E+09
a) Cuenta de Breed 10:00 1.40E+09 3.04E+09
10:30 2.42E+09 3.04E+09
Una vez obtenido el promedio de levaduras, se procedió 11:00 2.88E+09 3.22E+09
a realizar los cálculos necesarios para la cuantificación,
11:30 2.61E+09 2.48E+09
los cuales se muestran a continuación:
12:00 3.65E+09 2.58E+09
Primero se obtiene el área del campo observado: 12:30 2.12E+09 2.24E+09
13:30 1.93E+09 1.69E+09
Diámetro Campo = 0.18 mm
13:30 3.83E+09 1.88E+09
A = π r2 A = 0.025 mm2 14:00 2.18E+09 2.30E+09
14:30 1.93E+09 -
Una vez obtenida el área podemos extrapolar al área
delimitada de 1 cm2 que se cubrió con la muestra: Tabla 8. Datos de la concentración de
microorganismos en las dos muestras
20 𝑙𝑒𝑣𝑎𝑑𝑢𝑟𝑎𝑠 𝑙𝑒𝑣𝑎𝑑𝑢𝑟𝑎𝑠
100 𝑚𝑚2 × 2
= 80 000
0.025 𝑚𝑚 𝑐𝑚2
Curva de crecimiento de E. coli
Posteriormente se realiza el cálculo para la cantidad de
5.00E+09
levaduras por mililitrosabiendo que se esparció la
cantidad de 10 µL. 4.00E+09
3.00E+09
[E. coli]

80 000 𝑙𝑒𝑣𝑎𝑑𝑢𝑟𝑎𝑠 𝑙𝑒𝑣𝑎𝑑𝑢𝑟𝑎𝑠

1000 𝜇𝐿 × = 8 × 106 2.00E+09
10 𝜇𝐿 𝑚𝐿
80, 000 levaduras – 10 µL 1.00E+09
0.00E+00
Expresando así el resultado obtenido: 0.00 1.00 2.00 3.00 4.00 5.00 6.00 7.00
Tiempo (h)
𝑙𝑒𝑣𝑎𝑑𝑢𝑟𝑎𝑠
8 × 106
𝑚𝐿 Figura 3. Curva de Crecimiento de E. coli
b) Nefelometría

Una vez obtenida la curva de calibración y su regresión

lineal, se procedió a obtener la concentración de
microorganismos en las muestras para así poder construir
las curvas de crecimiento y realizar la cuantificación en
la fase exponencial.

Microbiología Experimental Química Farmacéutico Biológica

Su distribución está prohibida | Descargado por Mirna Ortiz (mirnacabrera92@yahoo.com)

 lOMoARcPSD|2610911

MICROBIOLOGÍA EXPERIMENTAL

Grupo: 6 Horario: Lunes y Miércoles (13:00 – 16:00) Equipo: 2

c) Reductasas
Curva de crecimiento de C. freundii
3.5E+09 Para el análisis de esta prueba, se realizó una
3E+09 comparación con los datos de la literatura:
[C. freundii]

2.5E+09
2E+09 Colorante Tiempo UFC /mL Calidad
1.5E+09 Más de 8 h < 5 × 10 5
Excelente
1E+09 Muy
500000000 5.3– 8h 5 × 105
buena
0 Azul de 5 × 105
0.00 2.00 4.00 6.00 8.00 2-5.3 h Buena
Metileno − 4 × 106
Tiempo (h) 4 × 106
20 min – 2 h Mala
− 20 × 106
Figura 4. Curva de crecimiento de C. freundii < 20 min > 20 × 106 Pésima

La determinación del número de generaciones y del Tabla 9. Calidad de la leche con base en la prueba de
tiempo de generación se determinó considerando que en reductasas con azul de metileno.
el caso de E. coli la fase log ocurrió desde el tiempo 1.5
h hasta 3.5 horas. Para C. freundii, la fase exponencial Colorante Tonalidad Calidad
comenzó en el tiempo 1.5 h y terminó hasta las 2.5 h. Violeta Excelente
Violeta – Rosado Buena
log 𝑁𝑓 − log 𝑁𝑜 Resazurina
𝑛= Rosa Mala
0.301 Blanca Pésima
𝑇𝑖𝑒𝑚𝑝𝑜 𝑑𝑒 𝐺𝑒𝑛𝑒𝑟𝑎𝑐𝑖ó𝑛 Tabla 10. Calidad de la leche con base en la prueba de
𝑔=
𝑛 reductasas con resazurina.
- Escherichia coli Dado lo anterior las muestras de leche dieron los
2.88 𝑥 109 − 2.32 𝑥 108 siguientes resultados:
𝑛=
0.301
Azul de Metileno
𝑛 = 3.63 Muestra Calidad UFC / mL
Bronca Pésima > 20 × 106
3ℎ − 1 ℎ
𝑔= Pasteurizada Muy buena 5 × 105
3.63 Ultrapasteurizada Excelente < 5 × 105
𝑔 = 0.55 ℎ = 33 𝑚𝑖𝑛
Tabla 11. Análisis de la calidad de las muestras de
leche con azul de metileno.
- Citrobacter freundii
Resazurina
3.04 𝑥 109 − 3.06 𝑥 108
𝑛= Muestra Calidad UFC / mL
0.301 Bronca Pésima > 20 × 106
Pasteurizada Mala 4 × 106 − 20 × 106
𝑛 = 3.31
Ultrapasteurizada Buena 5 × 105 − 4 × 106
2ℎ−1ℎ
𝑔= Tabla 12. Análisis de la Calidad de las muestras de
3.31
leche con resazurina.
𝑔 = 0.30 = 18 𝑚𝑖𝑛
Como podemos observar las pruebas difieren un poco en
algunos casos, ya que en el caso de la leche pasteurizada,

Microbiología Experimental Química Farmacéutico Biológica

Su distribución está prohibida | Descargado por Mirna Ortiz (mirnacabrera92@yahoo.com)

 lOMoARcPSD|2610911

MICROBIOLOGÍA EXPERIMENTAL

Grupo: 6 Horario: Lunes y Miércoles (13:00 – 16:00) Equipo: 2

con la prueba de azul de metileno nos dice que la calidad Conclusiones
es muy buena y en cambio con la resazurina es mala.
Para la ultrapasteurizada, la calidad es diferente también, La cuantificación de microorganismos totales es una
siendo excelente con la prueba de azul de metileno y con prueba que se requiere conocer y realizar de manera
la resazurina solamente es buena. habitual en el laboratorio de microbiología, es por ello
Para la leche bronca, ambas pruebas coinciden en los que la realización de esta práctica es importante.
resultados. En conclusión, se logró la determinación de la
cuantificación total de los distintos microorganismos a
Pero es importante destacar como se obtuvieron los través de las pruebas de cuenta de Breed, nefelometría y
resultados; para la leche cruda los resultados se por prueba de reductasas.
interpretaron de acuerdo al tiempo ya que estas muestras
viraron en el tiempo de clase, posteriormente se metieron Bibliografía
a incubación los tubos con azul de metileno quienes
estuvieron cerca de 24 horas en incubación por lo que los  Ramirez, G., et.al., Manual de Prácticas de
resultaros solo se estimaron en comparación con los Microbiología General, Facultad de Química,
tubos con reszarsurina que se incubaron en gaveta, por lo UNAM: México, 2011; pp. 147 – 151, 159.
que los resultados en leche pasteurizada y  Martín R., Presentación de Crecimiento
ultrapasteurizada solo se estimaron por comparación y microbiano, consultado el 11 de Octubre del
naturaleza de la leche. 2015

Microbiología Experimental Química Farmacéutico Biológica

Su distribución está prohibida | Descargado por Mirna Ortiz (mirnacabrera92@yahoo.com)