La tecnología de bio-140 (2013) 328-336

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síntesis dinámica de polihidroxialcanoatos por el consorcio bacteriano de líquido de

fermentación exceso de lodo simulado

Qianqian Jia Hui Wang ⇑ , Xiujin Wang

Escuela de Medio Ambiente, Universidad de Tsinghua, Beijing 100084, China

reflejos

Primero estudiado la síntesis de PHA dinámica en condiciones C-altos y N-ilimitadas. biomasa activa presenta una
asincronía a la síntesis de PHA en la matriz hidrolizado-similares. Se obtuvo un contenido de PHA más alta y el rendimiento
con 62.43% (w / w) y 0.71 g / L. No AGVs (> 30%) tuvo efectos negativos sobre la síntesis de PHA pero facilitó el
crecimiento celular. Proporcionar orientación para la producción de PHA a partir de exceso de líquido real lodos
fermentación.

información del artículo abstracto

Historia del artículo:
Recibido el 2 de de febrero de 2013
Recibido en forma revisada 25 de de abril de 2013 Aceptado el 26 de
de abril de 2013 Disponible en Internet el 6 de mayo de 2013
palabras clave:
ácidos grasos no volátiles líquidos Los
polihidroxialcanoatos (PHA) consorcio bacteriano
de lodos de fermentación de síntesis (no AGVs)
El proceso dinámico de polihidroxialcanoatos de síntesis (PHA) por el consorcio bacteriano en sustratos que simulan el exceso de líquido de lodo
de fermentación fue en profundidad investigado en este estudio. El rendimiento máximo contenido de PHA y PHA se obtuvo con 62,43% de la
pila seca y 0,71 g / L, que es la más alta en virtud de la alta concentración inicial de carbono (2.170 mg TOC / L) y las condiciones de nitrógeno
ilimitado hasta ahora. El crecimiento de la biomasa activa presenta una asincronía con la síntesis de PHA en esta condición hidrolizado-similares.
El consorcio estaba antes de utilizar ácido de carbono de número par para sintetizar 3-hidroxibutirato (HB) y luego el ácido de carbono-número
impar de 3-hidroxivalerato (HV). líquido fermentado con mayor porcentaje de ácidos grasos volátiles (AGV) es a favor de un contenido de PHA
más alto. No AGVs (> 30%), tales como proteínas y carbohidratos tenían efectos negativos sobre la acumulación de PHA pero facilitaron el
crecimiento celular. Un equilibrio se debe encontrar entre el crecimiento celular y la acumulación de PHA con el fin de lograr un rendimiento PHA
alta relativa.

dinámico PHA
2013 Elsevier Ltd. Todos los derechos reservados.

1. Introducción los plásticos convencionales ( Choi y Lee, 1999; Chua et al., 2003; Van Loosdrecht et al., 1997 ).

Los polihidroxialcanoatos (PHA) son biopolímeros producidos por numerosos microorganismos
como un material de carbono y la energía de almacenamiento intracelular ( Canetti et al., 1999 ).
Escuela politécnica- segundo- hidroxibutirato (PHB) y poli segundo- hidroxivalerato (PHV) son las
formas más comunes de PHA acumulado por microorganismos ( Chen y Wu, 2005; Song et al., 2001 ).
PHA son considerados como los nuevos materiales biológicos respetuosos del medio ambiente más
prometedores de ingeniería debido a las propiedades similares a los plásticos a base de petróleo con
la ventaja de ser biodegradables y renovables ( Braunegg et al., 1998; Keshavarz y Roy, 2010 ).
cultivo puro de bacterias naturales o modificadas por ingeniería genética de PHA productoras se
utiliza generalmente en la producción industrial de PHA. La principal limitación para la
comercialización de PHA es el alto costo de producción en comparación con
Una gran parte de los esfuerzos se han dedicado a la reducción de los costes de producción de
PHA por el uso de lodos activados como un cultivo mixto y carbono ricos uents fl ef o residuos (es
decir, las aguas residuales fábrica de papel, melaza de caña de azúcar, molino de aceite de palma
efluente y los residuos de alimentos) como las materias primas ( Albuquerque et al., 2010; Bengtsson
et al., 2008; Mumtaz et al., 2010; Venkateswar Reddy y Venkata Mohan, 2012 ). La combinación de
estos dos factores permite el ahorro de energía (no se requiere la esterilización) y reducción de
costes de material. Un nuevo proceso de producción de PHA conocido como '' fiesta y el hambre '' o ''
dinámico aeróbico alimentación (ADF) '' se ha desarrollado para mejorar tanto el contenido PHA y la
velocidad de almacenamiento de PHA específico de sistema de lodo activado ( Dionisi et al., 2001;
Majone et al., 1996; Sera fi m et al., 2004 ). En los últimos años, ha habido un gran interés en la
producción de PHA por lodos activados utilizando el exceso de líquido de lodo de fermentación como
fuente de carbono ( Cai et al., 2009; Jiang et al., 2009; Morgan-Sagastume et al., 2010 ). Desde
anaeróbico hydrolysisacidi fi cación es una de las tecnologías más importantes para lodos

⇑ Autor correspondiente. Tel .: +86 10 62772137; Fax: +86 10 62923541.

Dirección de correo electrónico: wanghui@tsinghua.edu.cn (H. Wang).

0960-8524 / $ - see front matter 2013 Elsevier Ltd. Todos los derechos reservados.
http://dx.doi.org/10.1016/j.biortech.2013.04.105
 Q. Jia et al. / Bio-Tecnología 140 (2013) 328-336
propuesta ( Mata-Alvarez et al., 2000 ), Por lo que es una gran manera de resolver el problema cada
vez más grave de la eliminación de los lodos y reducir los costos de producción PHAs con eficacia.
El líquido de lodo fermentado tiene sus propias características únicas en comparación con otras
fuentes de carbono. Su concentración inicial de carbono es generalmente mayor que 5000 mg / L
SCOD (demanda química de oxígeno soluble) o 2.000 mg / L TOC (carbono orgánico total) y que es
rico en nutrientes se hace referencia principalmente a nitrógeno correspondientemente con una baja
relación de nitrógeno de carbono (C / N) fluctuante de 5 a 12 ( Cai et al., 2009; Jiang et al., 2009;
Morgan-Sagastume et al., 2010; Xiong et al., 2012 ). Además, aunque los ácidos grasos volátiles
(AGV) son los principales productos de la hidrólisis de lodos y la fuente de carbono de alta calidad
para la síntesis de PHA, la composición del líquido de fermentación varía en gran medida con los
tipos de lodos y procesos hidrolizantes. En general, los AGV totales representan el 40-70% de la
SCOD total, mientras que los otros compuestos orgánicos (no-AGV), tales como proteínas y
carbohidratos solubles en cuenta para el resto 30-50% ( Jiang et al., 2009 ). La complejidad y la
inestabilidad de líquido de fermentación hace un gran di fi cultad para captar la ley de la síntesis de
PHA microbiana, lo que limita la aplicación de hidrolizado en la producción real PHA.
La utilización de sustratos (se refiere principalmente a carbono, nitrógeno y fósforo), el
crecimiento celular y la acumulación de PHA son tres movimientos clave durante todo el proceso de
síntesis de PHA. Hay muchos factores que pueden afectar al rendimiento microbiano. Algunos
estudios investigaron la influencia de la C / N en la acumulación de PHA ( Johnson et al., 2010; Sera fi
m et al., 2004; Wen et al., 2010 ), Mostrando que sólo bajo condición limitado en nitrógeno se puede
obtener alto contenido de PHAs, pero de alta C / N inhibiría el crecimiento de la biomasa activa para
el nitrógeno tiene una estrecha relación con el crecimiento celular. Sin embargo, Jiang et al. (2009)
señaló que hidrolizado de lodos sin nitrógeno de eliminación también se puede lograr alta
acumulación de PHA mediante el aumento de frecuencia de alimentación o la optimización de los
parámetros del proceso. Con los incrementos iniciales fuente de carbono de concentración, aumenta
el contenido de PHA, pero la tasa de síntesis de PHA disminuye en condiciones de nitrógeno limitado
(de Sera fi m et al., 2004 ). Además, la composición de AGV tiene una profunda influencia en la
domesticación microorganismos y la composición de PHA ( Chang et al, 2012.; Lemos et al., 2006 ).
Algunos métodos tales como el análisis metabólico y la modelización matemática se adoptan para
estudiar la influencia de la composición de AGV en la producción de PHA ( Jiang et al., 2011;
Pardelha et al., 2012 ).
Hasta el momento, se llevan a cabo casi todos los estudios con sustratos a la concentración de
carbono inicial limitado en nitrógeno o baja, que son muy diferente del líquido fermentado lodos real
que contiene tanto alta concentración de carbono y nitrógeno. Por otra parte, la influencia de la
no-AGV en el crecimiento celular y la acumulación de PHA no ha sido reportado. En este estudio, las
relaciones entre la utilización de sustratos, el crecimiento celular y la acumulación de PHA se
investigaron mediante el uso de líquidos en exceso de lodos de fermentación simulados que
contienen diferentes AGV y no AGVs como fuente de carbono. Los parámetros cinéticos y
estequiométricos calculados a partir de los resultados de las pruebas de producción por lotes de PHA
se usaron adicionalmente para demostrar los efectos de la no AGVs sobre la producción de PHA por
el consorcio bacteriano de simulada líquido de lodo de fermentación. Esto le ayudará a evaluar las
propiedades de exceso de líquido de lodo de fermentación usado para la producción de PHA, y
proporcionar orientación teórica y apoyo técnico para todo el proceso.
2. Métodos
2.1. activación consorcio bacteriano
El consorcio bacteriano utilizado para el experimento de producción de PHAs se aclimataron
desde el depósito de sedimentación secundario de una planta de tratamiento de aguas residuales en
Beijing, China. Los consortiumwas PHA productoras activados en un matraz cónico con 400 ml de
trabajar
329
volumen. El matraz estaba situado en un agitador con 150 rpm, 30 C. El régimen de escasez y
abundancia fue adoptado el uso de carbono-agotamiento (la concentración de carbono fue de menos
de un cuarto de la concentración inicial) como el punto de inflexión para entrar en fase hambruna. El
tiempo de la fase de la hambruna se mantuvo tres veces más larga que la fase de fiesta en cada
ciclo. Al final de cada ciclo, consorcio activado se recogió por centrifugación a 5000 rpm, 4ºC durante
5 min, todo el volumen de trabajo del sobrenadante fue retirado y se suministró el mismo volumen de
medio fresco.
El medio para la activación se compone de fuente de carbono y otros nutrientes necesarios. La
concentración inicial de carbono se mantuvo a 2.170 mg / L TOC (igual a 5,760 mg / L SCOD), y la C
/ N se ajustó a 10, que era similar con el valor del líquido de lodo de fermentación. El medio consistía
en 2240 l ácido acético L, 1120 l ácido propiónico L, 1120 l L norte- ácido butírico, 160 ml de una
solución N / P de stock (una solución sintética con alta concentración de nitrógeno y fósforo), 1,0 ml
de solución oligoelementos (por litro de agua ultrapura). La solución stock N / P constaba de 7,425 g
(NH 4) 2 ASI QUE 4,
0,652 g K 2 HPO 4, 0,510 g KH 2 correos 4 ( por litro de agua ultrapura). La solución de elementos traza
consistía en 1,5 g MnSO 4 H 2 O, 0,2 g CuSO 4-
5H 2 O, 0,2 g CoCl 2 6H 2 O, 0.2 g ZnSO 4 7H 2 O, 1,0 g H 3 BO 3, 0,2 g Na 2-
SiO 3 9 HORAS 2 O, 0,05 g Namoo 4 2H 2 O, 0,05 g NISO 4 6H 2 O, 1,0 g EDTA 2Na (por litro de agua
ultrapura). se añadió Thiurea (20 mg / L) para inhibir la fi cación Nitri. El pH de mezcla se ajustó a
7,0 ± 0,2 mediante la adición de NaOH 1 M o 1 M HCl. Se consideró un estado de equilibrio que se
obtiene cuando se obtuvieron valores estables para la longitud de la fase de fiesta, biomasa total y la
concentración de carbono residual de al menos tres ciclos. El consorcio bacteriano activado utilizado
como inóculo para pruebas de producción por lotes de PHA se cosechó después se alcanzó el
estado estacionario.
2.2. experimentos por lotes
Con el fin de investigar la síntesis de PHA a alta concentración de fuente de carbono inicial y la
condición de nitrógeno-ilimitado y los efectos de la no AGVs sobre la producción de PHA, seis
experimentos por lotes aeróbicas alimentados con diversas fuentes de carbono del ácido acético,
ácido propiónico, ácido butírico, suero bovino se realizaron albúmina (BSA, un compuesto modelo de
proteína soluble utilizado en este estudio), glucosa (un compuesto modelo de hidratos de carbono) y
extracto de levadura. La composición específico de cada se muestra en la tabla 1 . La concentración
inicial de carbono (2.170 mg TOC / L), la relación C / N (C / N = 10) y nutrientes tales como nitrógeno,
fósforo y oligoelementos fueron los mismos que el medio para la activación.
Lote de prueba de producción de PHA se llevó a cabo en un reactor por lotes con un volumen de
500 mL. Para cada prueba por lotes, el estado estacionario activa se recogió consorcio bacteriano
para inóculo al final de la fase de hambre y se concentró a una concentración de biomasa final de
alrededor de 2,000 mg / L, a continuación, 20 ml del líquido de inóculo se puso en cada reactor .
Después se añadió la solución de fuente de carbono en el reactor a fin de alcanzar una
concentración inicial de 2170 mg / L (como TOC). El volumen de líquido total mezclada en cada
reactor fue de 200 ml. Tres paralelos se establecieron para cada prueba por lotes. muestras de licor
mixto se recogieron en cierto intervalo de tiempo.
Los reactores se hicieron funcionar en un agitador de 150 rpm, 30 C. El
pH se ajustó a 7,0 ± 0,2 mediante la adición de NaOH 1 M y HCl 1 M y no controlada durante toda la
prueba.
2.3. métodos analíticos
Las muestras de licor mezclado tomadas de los ensayos por lotes se centrifugaron
inmediatamente a 4 C y 10.000 rpm durante 10 min. El sedimento se recogió por peso de células
secas (CDW) y análisis de PHA. El sobrenadante se filtró a través de un vaso fi bra de filtro (0,22 l metro).
El filtrado se analizó para AGV, TOC, nitrógeno total
330 Q. Jia et al. / Bio-Tecnología 140 (2013) 328-336

tabla 1
Composición de la cultura diferente simulando líquido exceso de lodo de fermentación (L 1).

Artículos sustrato fuente de carbono diferente VFA-100%

VFA-70% VFA-50% BSA Glucosa Levadura

SCOD (mg) 5760 5760 5760 5760 5760 5760

TOC (mg) 2170 2170 2170 2170 2170 2170
Ácido acético ( l L) 2240 1568 1120 0 0 0
Ácido propiónico ( l L) 1120 784 560 0 0 0
Ácido butírico ( l L) 1120 784 560 0 0 0
BSA (mg) 0 653,48 1089.00 4356.54 0 0
Glucosa (mg) 0 774,38 1290.63 0 5162.50 0
extracto de levadura (g) 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 6,883

(TN), nitrógeno de amoníaco (NH 3- N) y fósforo total (TP). TOC y TN se analizaron mediante un 3. Resultados y discusión
probador de articulación (TOC-CVSP, Shimadzu, Japón), TP y NH 3- N se determinaron de acuerdo
con los métodos estándar APHA ( APHA, 1995 ). 3.1. La utilización de sustratos, el crecimiento celular y la acumulación de PHA

Para analizar CDW, el sedimento obtenido después de la centrifugación se lavó mediante 3.1.1. Rendimiento de sistema
solución salina fisiológica por dos veces y pre-congelado a 80 C durante 8 h. El sedimento En condiciones de alta concentración de fuente de carbono inicial y la condición
congelado se fi nalmente se liofilizó hasta un peso constante por el secador por congelación (Alpha nitrogenunlimited, el reactor por lotes alimentados con ácido acético mixto, ácido propiónico y ácido
1-2LDplus, Cristo, Alemania). butírico se ha operado bajo abundancia y escasez régimen de un año desde julio de 2011.

AGVs se determinaron por cromatografía de gases (GC6890N / FID, Agilent, EE.UU.) con
detector de ionización de llama fl (FID) equipado con una columna HP-FFAP capilar (diámetro interior
de 0,25 mm y la longitud de 25 m). Antes de la inyección, el filtrado se acidifica con HCl 1 M para
ajustar el pH por debajo de 2,0 y se transfirieron a 2,0 ml vial cromatografía de gases. El AGV de C2
a C4 se analizaron.
determinación PHA se realizó de acuerdo con ( Oehmen et al., 2005 ) Con modificaciones
menores. biomasa liofilizada se resuspendió en 1 ml de metanol ácido (10% H 2 ASI QUE 4). A esta
solución 2 ml de cloroformo con 10 mg / ml se añadió de ácido benzoico (como patrón interno), y la
solución se mantuvo en un termotanque en 100 C durante 4 h. Después de enfriar, se utilizaron 1,0
ml de agua para la extracción de una noche. Se recogió la fase de cloroformo para el análisis de PHA
por cromatografía de gases (GC-2014, Shimadzu, Japón). Una curva de calibración se obtuvo
mediante la inyección de estándares de PHB y poli- segundo- hidroxibutirato-co segundo- hidroxivalerato
(PHBV, 12% PHV) (Sigma Aldrich, Spruce, EE.UU.) presentó previamente con el procedimiento
descrito para las muestras del reactor.
Figura 1 ilustra la típica concentración per fi l de todos los parámetros durante un ciclo de
funcionamiento del reactor. Después de la adición de sustrato, el carbono se absorbe rápidamente y
se almacena como PHA. el consumo de TOC y la producción de PHA fueron lineales durante casi
todo el periodo '' fiesta ''. contenido de PHA y CDW aumentaron simultáneamente hasta el final de ''
fiesta '' período cuando TOC permaneció menos de un cuarto de la concentración inicial. El contenido
de PHA y CDW alcanzado el valor máximo de 62,43% y 1,136 g / L, respectivamente, al final del
período '' fiesta '', este debe ser el más alto contenido de PHA y CDW obtenido hasta ahora por el
consorcio bacteriano utilizando alta concentración mezclado AGVs como la fuente de carbono bajo
condiciones de nitrógeno ilimitado deducida a partir de los resultados de estudios anteriores ( Johnson
et al., 2010; Wen et al., 2010 ). Esto demuestra que consorcio con alta capacidad PHA productoras
bajo alta concentración de nitrógeno puede ser adquirida mediante el uso de matriz apropiada y las
condiciones específicas de aclimatación fi c. En relación con los estudios anteriores, el tiempo del
período de fiesta era más largo que el valor reportado anterior (<12 h), esto fue debido a que en este
estudio, se utilizó la concentración de fuente de carbono inicial alta similar a la del hidrolizado real
(aproximadamente 180 Cmmol), que es mucho más alto que el valor utilizado antes (<60 Cmmol)
bajo el mismo C /

2.4. Cálculo

El contenido de PHA se expresó en una base de masa como contenido PHA (%) = g PHA / g 2500 1.4
TOC contenido TN
CDW. El rendimiento PHA (PHA, g / L) se calculó como CDW (g / L) multiplicar el contenido de PHA
(%). La biomasa activa (X, g / L) se estimó como X = CDW PHA. La concentración de biomasa activa PHA TP
70 1.2
se convirtió de gramo (g) en milimoles de carbono (Cmmol) de acuerdo con la fórmula molecular (C 5 H 2000

7 NO 2) para la biomasa. Los rendimientos de biomasa activa ( Y X / S, Cmmol X / Cmmol S) y PHA ( Y PD, Cmmol 60

HA / Cmmol S) sobre el sustrato consumido se calcula dividiendo respectivamente la cantidad de la CDW

contenido de PHA (%), TP (mg / L)

1500
TOC, TN (mg / l)

biomasa activa formada (X) y PHA formado (PHA) por la cantidad de fuente de carbono consumido. 50 0.8 1

La tasa de almacenamiento c PHB específico ( q PHB, mg PHB / g X h), velocidad de almacenamiento

CDW g / L

PHV fi específico ( q PHV, mg PHV / g X h) y especificidad c tasas de absorción de VFA ( q vfa, mg VFA / g 40 0.6
1000
X h) se calcula a partir de la regresión lineal de PHB y PHV producido o AGVs consumida dividida
30 0.4
por la biomasa activa correspondiente (X) frente al tiempo, respectivamente. Los parámetros de
rendimiento, tales como la productividad PHA (mgPHA / L h) y la tasa de captación de sustrato 500
20 0.2
específico ( qs, en mgTOC / L h) se calculó dividiendo la cantidad de la PHA producidos o sustrato
consumido por el tiempo transcurrido en la fase inicial (fase de fiesta) de los experimentos por lotes.
0 0 10 0
0 48 96 144 192 240 288

Tiempo (h)

Figura 1. Típica pro fi les de carbono orgánico total (TOC), nitrógeno total (TN), contenido de PHA, fósforo total (TP) y
el peso seco de células (CDW) durante un ciclo de la SBR reactor operado bajo condiciones de escasez y
abundancia.
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condiciones Ñ. El consumo lento de carbono también se observó por Sera fi et m al. (2004) ,
Concentración de la fuente de alto carbono (> 100 Cmmol) puede causar la inhibición de sustrato de
modo que la tasa de absorción de carbono fi co dejó caer hacia abajo y extendido período de tiempo
fiesta. Sin embargo, dicha extensión apenas influido la capacidad de almacenamiento de PHA del
consorcio, el contenido de PHA se va para arriba durante toda la fase de fiesta.
En la fase de hambre, las células empezaron a consumir PHA intracelular, el contenido
disminuido de forma evidente, especialmente después de agotada la carbono (> 144 h). El peso en
seco celular también disminuyó, pero no tan obvio como la PHA. Puesto que el nitrógeno permaneció
casi el mismo durante esta fase, se puede considerar que en la fase '' hambre '', PHA se utiliza
principalmente para el mantenimiento de células. Era similar con los resultados de Lemos et al.
(2006) y Morgan-Sagastume et al. (2010) . En relación con la absorción de TOC, nitrógeno y fósforo
se consumieron menos durante el ciclo. El nitrógeno no se agota en el extremo de la fase de
hambre, lo que sugiere que los cultivos no eran limitado en nitrógeno. Bajo condición limitado en
nitrógeno, los cultivos se agotar amoníaco rápidamente para el crecimiento celular ( Sera fi m et al.,
2004 ). La acumulación de nitrógeno y fósforo indicó que la demanda de estos dos elementos por el
consorcio PHA-almacenamiento puede mantener en cierta medida y era diferente de las bacterias
comunes. Se necesita investigación adicional para investigar la transformación del nitrógeno y del
fósforo durante el proceso de almacenamiento de PHA.
del contenido de PHA. Esta consistencia es muy significativa a escala industrial de producción
porque en el momento de la extracción de PHA se puede determinar fácilmente. Sin embargo, la
curva de biomasa activa no era coherente con CDW. La concentración de biomasa activa y el
contenido PHA aumentaron simultáneamente al comienzo de la fase de fiesta (0-48 h), y después se
observó un ligero asincronía de 48 h a 72 h entre el crecimiento celular activo y la producción de
PHA. crecimiento celular activo disminuyó mientras que el PHA aumentó continuamente. Después de
que el punto, la biomasa activa permaneció aproximadamente la misma hasta el final del ciclo
mientras que el rendimiento PHA se dejó caer lentamente ( Figura 2 ).
Se ha encontrado que el crecimiento celular está estrechamente relacionado con el suministro
de nitrógeno. Cuando el nitrógeno fue limitado, el cultivo mixto agotaría rápidamente nitrógeno
temprano en la fase de fiesta para selfgrowth, por lo que la biomasa activa aumentó muy lentamente
o incluso sigue siendo el mismo durante el proceso de síntesis de PHA ( Sera fi m et al., 2004; Wang
et al., 2010 ). En este experimento, el nitrógeno no se limita más, así que cuando la fuente de carbono
se suministró en exceso, el '' sobre-hambre '' consorcio asimila el carbono rápidamente a acumular
PHA y, al mismo tiempo, se utiliza el nitrógeno al crecer, por lo que hay era un aumento simultáneo
entre la biomasa activa y la producción de PHA en la fase temprana. En comparación con los
resultados de Sera fi et m al. (2004) que se llevó a cabo bajo condiciones de nitrógeno limitado (C / N
= 250), el rendimiento de biomasa activa Y X / S

(C / N = 10) se mejoró durante casi cuatro veces (0.070 y

0.019 Cmmol X / Cmmol S). Después de 48 h, una asincronía-fase corta apareció entre el
crecimiento de la biomasa activa y la síntesis de PHA. Este fenómeno era diferente de los estudios
3.1.2. El crecimiento celular y la acumulación de PHA
anteriores sobre la producción de PHA por cultivo microbiano mixto ( Chang et al, 2012.; Lemos et al.,
El rendimiento PHA más alto se obtuvo al final de la fase de fiesta ( t = 72 h) con 0,71 g / L, este
2006; Sera fi m et al., 2004 ). En este experimento, el nitrógeno no se limita, por tanto, la
fue el más alto rendimiento obtenido hasta ahora por el consorcio bacteriano usando alta fuente de
concentración de nitrógeno era todavía alto (alrededor de 200 mg / L) cuando el carbono se consume
carbono concentración inicial bajo condiciones de nitrógeno ilimitado comparar con los resultados de Jiang
medio-por debajo de 900 mg / L. En este caso, el carbono se convirtió en el factor limitante para el
et al. (2009) .El punto máximo fue consistente con el
consorcio ( Beun et al., 2002; Johnson et al., 2010 ). Beun et al. (2002) señaló que en condiciones
limitado en carbono, la competencia microbiana basaría en la captación de carbono. Como se
muestra en Tabla 2 (Reactor 1), el valor de Y P / S ( 0.212 Cmmol HA / Cmmol S) era alrededor de tres
veces mayor que la de Y X / S ( 0.070 C mmol X / Cmmol S), indicando que el carbono se utiliza
0.7 0.8 70

X PHA principalmente para la síntesis de PHA en lugar de crecimiento celular. La competición de carbono
limitado dio como resultado la disminución de la concentración de biomasa activa mientras que el
0.6 contenido de PHA 60
PHA se acumula continuamente. Como agota el carbono, el consorcio dejó de acumular PHA y entró
0.6 en la fase de la hambruna. La biomasa activa se mantuvo en un nivel especial mientras que el PHA
0.5 50
se redujo, lo que sugiere que el PHA se consume para el mantenimiento de células.
PHA (g / L) activo

0.4
contenido de PHA (%)

40
biomasa X g / L

0.4
0.3 30

0.2 20
0.2

0.1 10

3.1.3. Efecto de la utilización de AGV en la composición de PHA y la capacidad de síntesis de PHA

0 0 0

0 48 96 144 192 240 288

El consorcio era antes del uso de ácido acético, ácido butírico siguió, y ácido propiónico fi
Tiempo (h)
nalmente. El ácido acético se agotó en 72 h, el ácido butírico en 96 h, y ácido propiónico en 120 h ( Fig.

Figura 2. Evolución de la biomasa activa (X), rendimiento PHA (PHA) y el contenido de PHA durante el ciclo. 3 un). La proporción de HV aumentó gradualmente durante los primeros

Tabla 2
Los parámetros cinéticos y estequiométricos para los experimentos de producción de lotes de PHA con diversas fuentes de carbono.

Artículos X máx PHA máx qS YX/S Y PD la productividad PHA

VFA-100% 0,301 (0,003) 0,710 (0,005) 21.917 (0.010) 0,070 (0,001) 0,212 (0,002) 12.609 (0.035)
VFA-70% 0,320 (0,005) 0,496 (0,003) 13.729 (0.005) 0,082 (0,002) 0,161 (0,002) 7,277 (0,005)
VFA-50% 0,613 (0,005) 0,416 (0,002) 10.663 (0.005) 0,121 (0,001) 0,132 (0,001) 6,339 (0,004)
BSA 0,554 (0,003) 0,129 (0,002) 6,125 (0,005) 0,204 (0,003) 0,058 (0,002) 1,521 (0,002)
Glucosa 0,347 (0,002) 0,067 (0,001) 2,583 (0,005) 0,303 (0,001) 0,036 (0,001) 1,131 (0,003)
Extracto de levadura 1,533 (0,005) 0,190 (0,003) 38.745 (0.003) 0,400 (0,002) 0,004 (0,001) 1,424 (0,005)

Las desviaciones estándar entre paréntesis; BSA, albúmina de suero bovino; X max, en g X / L; PHA max, en g PHA / L; q S, en mg TOC / L h; Y X / S, en Cmmol X / Cmmol S; Y PD, en Cmmol HA / Cmmol S; productividad PHA, en mg PHA / L h.
 Q. Jia et al. / Bio-Tecnología 140 (2013) 328-336

un 3500 segundo
100%

El ácido propiónico El
3000 99%
ácido butírico ácido

acético
98%
2500

97%
2000

Proporción (%)
VFA (mg / L)

96%
PHV%
1500
95% PHB%

1000
94%

500
93%

0 92%
0 50 100 150 200 24 39,5 48 72 96 120 145 169 192 216 264 288
Tiempo (h) Tiempo (h)

ácido propiónico y ácido butírico (c), y la tasa de almacenamiento específico de PHB y PHV (d) durante el ciclo. 332

do 140 re 0.8

El ácido propiónico El
qphb

q PHV ( mgPHV / gX · h) q PHB ( mgPHB

120 0.6
ácido butírico ácido qphv

100 acético 40 0.4

- q VFA ( mgVFA / gX · h)

80 30 0.2

20
60
/ gX · h)

10
40 - 0,2 0

- 10 0
20 - 0.4

0 - 20 - 0.6
0 50 100 150 200 0 48 96 144 192 240 288

Tiempo (h) Tiempo (h)

Fig. 3. Los cambios dinámicos de la utilización de AGV y composición de PHA. maldición Tiempo de ácido acético, ácido propiónico, concentración de ácido butírico (a), la composición de PHA (PHB: PHV) (b), fi c tasa de absorción específica de ácido acético,

120 h, especialmente después del agotamiento de ácido acético ( t = 72 h), la proporción de HV tenía
un relativamente grande la ascensión, la relación más alta HV llegar a alrededor de 5% a 120 h ( Fig.
3 segundo). En comparación con PHB, el contenido de PHV era bastante bajo, esto puede ser
atribuido a la complejidad de la vía de metabolismo de los ácidos grasos volátiles y la utilización de
ácido propiónico para el crecimiento de la biomasa activa.
La relación entre la utilización de VFA y composición de PHA puede ser explicado como sigue.
Como ácido acético y ácido propiónico se ofrecieron al mismo tiempo, la acetil-CoA producido por el
ácido acético se utiliza principalmente para la síntesis de HB, y unos pocos combinada con
propionil-CoA producido por el ácido propiónico para formHV, por lo PHV no mejoró mucho en la
temprano 72 h. Después de ese punto, el ácido acético se consumió completamente; ácido
propiónico se convirtió en la principal fuente de carbono en comparación con el resto del ácido
butírico, así que la proporción de PHV comenzó a mejorar. Después de 120 h, ácido propiónico se
había agotado, una pequeña cantidad de ácido butírico hizo la proporción de aumento de PHB, por lo
que la proporción de PHV escalonada hacia abajo.
almacenamiento no se dio como resultado únicamente de consumo de ácido propiónico pero la
co-utilización de ácido propiónico y ácido acético. Tras alcanzar un máximo, la velocidad de
almacenamiento PHV fi específica disminuyó con una disminución en la tasa de consumo específico
de ácido propiónico, lo que sugiere que la biosíntesis de PHV fue especialmente relevante para la
utilización de ácido propiónico. Además, se puede observar a partir Fig. 3 d que se consumió el PHB,
sin embargo el PHV se sintetizó durante 96-120 h, este fenómeno indica que el consorcio bacterias
para HB o síntesis HV podría ser diferente.
La tasa de almacenamiento específico de PHB o PHV presentó un valor negativo con una ligera
onda después de 144 h, se indica la cantidad de PHA disminuyó a ser utilizado para el
mantenimiento de células. La tasa de almacenamiento específico de PHB (PHV) se puede considerar
como un indicador de la capacidad promedio de la síntesis de PHA microbiana, por lo que se puede
derivar de los resultados que la capacidad microbiana de sintetizar PHA escalado fi rstly y luego
debilitan abajo, y apenas cambió en el fin.

El análisis cinético de la captación de VFA y PHB (PHV) Tasa de almacenamiento podría ayudar
a comprender la relación entre la utilización de VFA y la formación de PHA más profundamente ( Fig.
3 c y d). Como se muestra en
Fig. 3 c, la tasa de absorción máxima de ácido acético (123,94 mg / g X h) apareció a las 48 h,
mientras que el valor correspondiente fue de
39,27 mg / g X h para el ácido butírico en 40 h, y 46,17 mg / g X h para el ácido propiónico en 96 h.
Esto indicó que el ácido acético y butírico consume más rápido que el ácido propiónico en la fase
temprana. Correspondiente a Fig. 3 d, la tasa de almacenamiento PHB fi co presentó un aumento y
alcanzó un valor máximo a las 48 h causados ​por la absorción de ácido acético y butírico. Se obtuvo
el índice de almacenamiento PHV fi específico máximo a las 72 h distintos de 96 h, lo que sugiere
que la alta PHV
3.2. Efectos de la no-AGVs sobre el crecimiento celular y la acumulación de PHA
3.2.1. Efectos de mezclado no AGVs
Con el aumento de la proporción no AGVs en la fuente de carbono, la fuente de carbono
mantenido que no podía ser utilizado aumentó al final del ciclo que se indica que la utilización de la
no-AGV fue más lento que AGVs puros por la PHA productoras bacteriana consorcio ( Fig. 4 un). El
contenido de PHA aumentó más rápidamente cuando la proporción no AGVs en los sustratos a
disminuir a partir de 100% a 70% y 50%, el más alto contenido de PHA eran 70%, 63% y 48%,
respectivamente ( Fig. 4 segundo). Por el contrario, la biomasa activa creció mejor con el aumento de
la no-AGV y el máximo
 Q. Jia et al. / Bio-Tecnología 140 (2013) 328-336 333

un 2500 segundo
VFA-100% VFA-100%

VFA-70% VFA-70%
2000
VFA-50%
VFA-50%

contenido de PHA (%)

1500
TOC (mg / L)

1000

500

0
0 48 96 144 192 240 288 0 48 96 144 192 240 288
20 30 40 50 60 70 80
Tiempo (h) Tiempo (h)

VFA-70% VFA-50% 0 10
do 0.8
VFA-100%

0.6
X (g / L)

0.4

0.2

0
0 48 96 144 192 240 288
Tiempo (h)

Fig. 4. Evolución de TOC (a), el contenido de PHA (b), y la biomasa X activo (c) bajo diferente relación de AGVs durante el ciclo.

concentraciones de biomasa activos fueron 0,30, 0,32 y 0,61 g / L, respectivamente ( Fig. 4 do).
La cinética y la estequiometría de las fuentes de carbono consortiumwith bacterianas de
diferente relación de AGVs se compararon en Tabla 2 . Los cultivos alimentados con 100% AGVs
mostraron una tasa de captación de sustrato específico ( q S, 21,917 mg TOC / L h) y la productividad
PHA (12,609 mg PHA / L h) más altos que los alimentados por 70% y 50% AGVs ( q S, 13.729 y 10.663
mg TOC / L h; la productividad PHA, 7.277 y
6,339 mg PHA h / L). El rendimiento de PHA sobre el sustrato consumido mostró una disminución
mientras que el rendimiento de biomasa activa mostró un incremento con la relación no AGVs
elevada ( Y PD, 0,212-0,132 Cmmol HA / Cmmol S y Y X / S, 0,070 a 0,121 Cmmol X / Cmmol S).
Comparando los resultados de las tres series de experimentos, se puede señalar que los AGV eran
más fáciles de usar que no AGV y la alta proporción de ellos podría mejorar la productividad de PHA.
Los no AGVs tales como hidratos de carbono y proteína soluble tenían efectos negativos sobre la
acumulación de PHA pero facilitaron el crecimiento celular activo. La presencia de sustratos
orgánicos-AGV no degradables podría frenar la producción de PHA, ya que pueden ser utilizados (i)
para el crecimiento de organismos no PHA producir durante todo el ciclo, (ii) como sustrato de
almacenamiento, pero en la forma de polisacáridos durante la banquete.
Sobre la base de los resultados anteriores, no AGVs debe ser controlado correctamente durante
el proceso de fermentación el exceso de lodo con el fin de obtener sustratos adecuados con alta
concentración AGVs para la producción de PHA en la realidad.
La relación de AGV y no AGV no sólo afecta a la cantidad de la PHA y la biomasa activa, pero
también afecta el orden de estos dos procesos. Fig. 5 ilustra la evolución de la biomasa activa y el
contenido PHA bajo diferente relación de AGVs durante el ciclo. Puede verse que con el aumento de
la proporción no AGVs, relación entre el crecimiento celular activo y la acumulación de PHA había
sufrido un cambio sutil. El punto máximo de crecimiento celular activo se-retrasa tiempo detrás del
pico de la acumulación de PHA, es decir, el tiempo para el crecimiento celular sostenida extendido
con el aumento de la no-AGVs proporción en sustratos iniciales, por lo tanto la acumulación de PHA
se debilita relativamente . En la fase de hambre, aproximadamente 40%, 30% y 20%
almacenado-PHA se consumió hasta el final del ciclo, respectivamente, lo que sugiere que la
demanda de PHA para el mantenimiento reduce debido a la permanecido no AGVs para el
crecimiento celular.
Los resultados son significativos para la producción de PHA realista por el cultivo microbiano
mixto utilizando el exceso de líquido de lodo de fermentación como sustrato. La asincronía del
crecimiento celular y la acumulación de PHA indica que el punto de tiempo para recoger la biomasa
para la extracción de PHA debe ser razonablemente determinado, debido a que el punto de
rendimiento máximo PHA puede no ser consistente con la de contenido máximo de PHA cuando la
proporción no VFA de líquido de fermentación se cambian. El crecimiento de las células debe ser
tomado en cuenta.
Los resultados anteriores implican que un exceso de fermentación de lodos con alto AGV está a
favor de un contenido de PHA más alto, pero un equilibrio
334 Q. Jia et al. / Bio-Tecnología 140 (2013) 328-336

un 0.35 segundo
0.35
AGV-100% AGV-70%
0.3 0.3 70

0.25 0.25 60

0.2 0.2

contenido de PHA (%)

50

contenido de PHA (%)

X (g / L)

X (g / L)
0.15 0.15 40

0.1 0.1 30

0.05 0.05 20

contenido de PHA contenido de PHA

0 0 0 10

0 48 96 144 192 240 288 0 48 96 144 192 240 288

Tiempo (h) X Tiempo (h) X

do 0.7
AGV-50%
0.6
60

0.5
50

0.4

contenido de PHA (%)

X (g / L)

40

0.3

10 20 30 40 50 60 70 80 30
0.2

20
0.1
contenido PHA 0

0 0 10

0 48 96 144 192 240 288

Tiempo (h) X

Fig. 5. Relación del crecimiento celular y la acumulación de PHA bajo diferente relación de AGVs durante el ciclo de (a, VFA = 100%; B, VFA = 70%; c, VFA = 50%).

debe ser encontrado entre el crecimiento celular y la acumulación de PHA con el fin de lograr un
rendimiento PHA alta relativa.
3.2.2. Efectos de la suela no AGVs
Se puede observar a partir Fig. 6 que el extracto de levadura era muy fácil de ser utilizado como
fuente de carbono, se consume más rápidamente entre el sustrato de carbono único tres. Sin
embargo, el TOC se utiliza principalmente para el crecimiento celular, la síntesis de PHA puede ser
casi ignorada. Aunque el polvo de extracto de levadura es un gran material como factor de
crecimiento, no se puede utilizar para la síntesis de PHA. BSA se adoptó como una sustancia modo
de la proteína soluble. TOC de BSA podría ser utilizado, pero mucho más lento que polvo de
levadura, porque BSA también contenía nitrógeno, que era necesaria para el crecimiento microbiano,
por lo tanto, las células activas tenían cierto crecimiento, pero no tan rápida como levadura en polvo
y presentan una tendencia más suave. El crecimiento celular lento en BSA podría atribuirse a la
habituación del consorcio bacteriano aclimatado a partir de los lodos por la mezcla de cadena corta
AGV. Por lo tanto, era difícil de utilizar BSA, una especie de macromolécula, para el crecimiento
celular. No hubo aumento obvio en el contenido de PHA que mantiene de 15% a 20%, por lo BSA no
es una fuente de carbono adecuada para la síntesis de PHA tampoco. La glucosa se adoptó como
una sustancia modo de sacárido. En este estudio, la glucosa no es la fuente de carbono-usado fácil y
el TOC consume más lentamente, aproximadamente sólo el 40% TOC utilizado dentro de los 10
días. masa celular microbiana y el contenido de PHA se mantuvo casi el mismo durante el ciclo.
Los cambios de parámetros cinéticos para estos tres conjuntos de experimentos en Tabla 2 puede
ayudar a explicar los fenómenos observados. Los cultivos alimentados con extracto de levadura
mostraron una tasa de captación de sustrato específico ( q S, 38,745 mg TOC / L h) mucho más alta
que la de BSA y
sustratos de glucosa ( q S, 6,125 y 2,583 mg TOC / L h), lo que sugiere que el extracto de levadura era
más fácil de usar que los otros dos. Sin embargo, el carbono se utiliza principalmente para el
crecimiento celular ( Y X / S,
0.400 Cmmol X / Cmmol S) distinto de la producción de PHA ( Y PD,
0.004 Cmmol X / Cmmol S). Los bajos valores de productividad PHA y Y PD de las tres fuentes de
carbono no AGV únicos indicaron que no eran los sustratos adecuados para la producción de PHA
por este consorcio bacterias acclimating del lodo activado.
Los hallazgos indicaron que el consorcio bacteriano enriquecido en este trabajo no podría utilizar
fácilmente la glucosa o BSA a acumular PHA. Cuando el líquido de fermentación se suministra como
la fuente de carbono, la mayoría de la PHA era probablemente de la fermentativa AGV. Esto puede
estar asociado con la condición de aclimatación y estructura de la comunidad de los
microorganismos.
4. Conclusiones
El proceso de síntesis de PHA dinámico se investigó con alta concentración inicial de carbono
(2.170 mg TOC / L) y el sustrato de nitrógeno-ilimitado simulando el exceso de líquido de lodo de
fermentación. El crecimiento de la biomasa activa presenta una asincronía con la síntesis de PHA en
esta condición. Se obtuvo un contenido de PHA más alta y el rendimiento con 62.43% (w / w) y 0.71
g / L. El consorcio estaba antes de utilizar de número par ácidos de carbono para sintetizar HB y
luego las impares ácidos de carbono para HV. No AGVs (> 30% TOC), tales como proteínas y
carbohidratos solubles tenido efectos negativos sobre la acumulación de PHA pero facilitó el
equilibrio growth.A célula debe ser encontrado para lograr un alto rendimiento de PHA relativa.
 Q. Jia et al. / Bio-Tecnología 140 (2013) 328-336 335

un 3000 segundo
BSA Extracto de
BSA Extracto de
Glucosa levadura
2500 Glucosa levadura

2000

contenido de PHA (%)

TOC (mg / L)

1500

1000

500

0
0 48 96 144 192 240 288 0 48 96 144 192 240 288
10 15 20 25 30 35 40
Tiempo (h) Tiempo (h)

Extracto de Levadura 0 5
do
BSA Glucosa

1.6 2

1.2
X (g / L)

0.8

0.4

0
0 48 96 144 192 240 288

Tiempo (h)

Fig. 6. Evolución de TOC (a), el contenido de PHA (b), y activa la biomasa X (c) en los tres sustratos de carbono único durante el ciclo.

Expresiones de gratitud
Los autores agradecen sinceramente el profesor Chen Guoqiang, de la Universidad de Tsinghua
por su amable ayuda en la revisión del manuscrito. Este trabajo fue apoyado por la Iniciativa de la
Universidad de Tsinghua Cientí fi co del Programa de Investigación (Nos. 20101081834,
20121087922) y el proyecto nacional clave en el Control de Contaminación y Gestión en China
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