Estudio de proteínas argonautas (HILI, HIWI, eIF2C) y su relación con proteínas de

golpe de calor como posibles biomarcadores en tumores del sistema nervioso

central.

Objetivo General

Contribuir con la identificación de nuevos biomarcadores con valor pronóstico y predictivo

en pacientes con tumores malignos del sistema nervioso central.

Objetivos Específicos

Investigar si la expresión de las proteínas: eIF2C, HIWI, HILI se asocian a la progresión

tumoral y a la resistencia al tratamiento con temozolomida (TMZ) en líneas celulares
humanas derivadas de gliomas y en tumores gliales.

Líneas celulares

a. Estudiar la expresión de: eIF2C, HIWI, HILI en las líneas celulares: Gli36,
U87 y DBTRG.05MG.

b. Inducir un modelo de glioma (línea celular) resistente al tratamiento con

TMZ. Evaluar la expresión de las proteínas: eIF2C, HIWI, HILI, Hsp27 y
Hsp70.

c. Analizar en las líneas celulares parentales y en el modelo resistente a

TMZ: proliferación, migración, capacidad de formación de colonias y muerte
celular. Correlacionar con la expresión de las proteínas estudiadas.

d. Evaluar interacciones entre la proteína de golpe de calor Hsp27 y las

proteínas argonautas eIF2C, HIWI, HILI, en un modelo de glioma (línea
celular) resistente al tratamiento con TMZ.

Muestras Biológicas

a. Analizar la expresión de eIF2C, HIWI, HILI en muestras tumorales de

gliomas. Correlacionar los resultados con características histo-patológicas
(celularidad, neo-vascularización, necrosis) de los gliomas.

Antecedentes

Los gliomas son las neoplasias primarias más comunes del sistema nervioso
central y se clasifican según la estirpe celular que les dio origen en: astrocitomas,
oligodendrogliomas y oligoastrocitomas (Kleihues P & Cavenee W 2000). La distinción
entre los subtipos es de gran importancia ya que numerosos reportes han mostrado que la
mayoría de los tumores oligodendrogliales presentan un mejor pronóstico y mejor
respuesta a la quimioterapia comparados con los astrocitomas del mismo grado
(Cairncross et al. 1998) Por lo tanto, la clasificación adecuada es indispensable en la
evaluación diagnóstica y terapéutica de los gliomas, pero debido a la falta de marcadores
específicos, los patólogos deben basarse solamente en criterios histológicos y estos
poseen un componente subjetivo. Varias características radiológicas e histológicas han
tratado de ser definidas como marcadores pronósticos pero lamentablemente ninguno de
estos parámetros predice realmente los resultados observados (Freije et al. 2004). Estos
tumores son tratados principalmente por cirugía, la radioterapia y la quimioterapia son
también utilizadas, pero la respuesta a estos tratamientos en general no es muy
satisfactoria. La temozolomida (TMZ) es el agente quimioterápico estándar utilizado en
gliomas malignos, pero la resistencia a esta droga es el problema principal para obtener
resultados exitosos en estos tumores altamente mortales (Sun E et al 2012).

Las células tumorales exhiben la capacidad de auto-renovación, por lo cual es

posible que su regulación sea similar a la de las células madre (stem-cells).
Probablemente la de-regulación de la auto-renovación es requerida para el desarrollo del
cáncer (Lee et at 2006), aunque también parecen estar implicadas en la resistencia a
terapias (Beier et al 2011). Las células tumorales “stem-like” (TSCs: Tumor Stem-like
Cells) son más resistentes a la radio y quimioterapia que las células progenitoras
tumorales que proliferan rápidamente y que las células tumorales bien diferenciadas. Las
TSCs sobreviven a intensas terapias oncológicas y luego son las que dan lugar a
recidivas mortales para el paciente.

A fines de la década del ’90 se determinó que una familia de proteínas, conocidas
como Argonautas, son requeridas para la auto-renovación de las células madre en
diversos organismos (Sun G et al 2011, Lee et at 2006). Las proteínas de la familia
Argonauta se asocian a los ARN pequeños (small RNA) y forman complejos ARN-proteína
llamados RISC (RNA-Induced Silencing Complexes: complejos de silenciamiento
inducidos por ARN) además son los componentes mejor identificados de la maquinaria de
los RNA interferencia (RNAi) (Li et al 2010). Los seres humanos tenemos 8 proteínas
argonautas, 4 de las cuales pertenecen a la subfamilia eIF2C/AGO (EIF2C1/hAGO1,
EIF2C2 /hAGO2, EIF2C3/hAGO3, y EIF2C4/hAGO4) mientras el resto pertenece a la
subfamilia PIWI (PIWIL1/HIWI,PIWIL2/HILI, PIWIL3 y PIWIL4/HIWI2) (Sasaki et al. 2003).
La subfamilia eIF2C/AGO está presente en animales, plantas y levaduras de fisión y se
ha postulado que estas proteínas podrían tener funciones regulatorias en la auto-
renovación de las TSCs (Carmell et al. 2002). La subfamilia PIWI está presente solo en
animales y los genes PIWI son expresados principalmente en células germinales. Con sus
patrones de expresión las proteínas PIWI podrían participar de la proliferación de las
células germinales y su sobreexpresión podría causar desarrollo de malignidad en estas
células (Li et al 2010).

En los últimos años se han estudiado intensamente esta familia de proteínas

argonautas, PIWIL1/HIWI uno de los miembros de esta familia se ha encontrado
expresado en varios tipos de tumores: carcinoma hepatocelular, colon, seminomas,
adenocarcinoma gástrico y de páncreas entre otros. En gliomas existe un único reporte
donde se relaciona la expresión de HIWI a elevada proliferación y pobre sobrevida total.
Recientes reportes demuestran que HIWI tiene un rol oncogénico directo y estaría
asociado a la hipermetilacion del ADN, favoreciendo el estado carcinogénico (Siddiqi et al
2012). PIWIL2/HILI también se ha encontrado expresado en varios tipos de cáncer:
mama, meduloblastoma, rabdomiosarcoma y probablemente promueve la oncogénesis
inhibiendo la apoptosis y promocionando la proliferación a través de la vía de señalización
Stat3/Bcl-XL (Lee et al. 2006). Sin embargo, los mecanismos precisos que involucran
tanto a HIWI como HILI en la tumorogénesis y su comportamiento biológico deben ser
mejor estudiados.

En base a estos antecedentes nuestro objetivo es analizar la expresión de 3

miembros de la familia argonauta: eIF2C, HIWI, HILI en 3 líneas celulares derivadas de
gliomas humanos: Gli36, U87 y DBTRG.05MG y en muestras tumorales del SNC (gliomas
grado II a IV y oligodendrogliomas) (n=45 de nuestro banco de tumores). El fin es analizar
los posibles roles de estas proteínas en la progresión tumoral y en la resistencia a drogas
(particularmente a la TMZ). Luego pretendemos correlacionar esta información con la
expresión de proteínas de golpe de calor (Hsps: heat shock proteins) Hsp27 y Hsp70.
Las Hsps conforman un grupo de proteínas altamente conservadas que se expresan
constitutivamente en la mayoría de las células. Intervienen en procesos metabólicos
esenciales como la síntesis, plegamiento, ensamblaje y transporte de otras proteínas,
participando también de la eliminación de proteínas desnaturalizadas. Los niveles
elevados de Hsps en células malignas juega un rol clave en la protección contra la
apoptosis espontánea asociada por malignidad y también contra la apoptosis generada
por mecanismos terapéuticos, esto podría indicar un rol clave de estas proteínas en la
carcinogénesis, progresión tumoral y resistencia al tratamiento (Ciocca et al 2005,
Calderwood SK, et al. 2006, Fujita et al. 2011). En un trabajo reciente, hemos encontrado
que la Hsp27 puede funcionar como un marcador subrrogante de la pérdida de
heterocigocidad en el brazo corto del cromosoma 1 (1pLOH) en oligodendrogliomas
(Castro et al. Cell Stress and Chaperones, en prensa), este último (1pLOH) es un
comprobado marcador pronóstico y predictivo en tumores oligodendrogliales (Smith et al.
2000; Jha et al. 2011).

Actualmente no existen estudios que analicen posibles interacciones entre las

proteínas argonautas y las Hsps. Las proteínas argonautas y su posible relación con
determinadas Hsps podrían ser utilizadas como marcadores moleculares potenciales para
diagnóstico patológico, evaluación pronóstica e incluso para nuevos blancos terapéuticos
en los gliomas.

Actividades y metodología

Las tareas a desarrollar durante este trabajo se dividen en la realización de

experimentos in vitro, y los conocimientos generados serán aplicados en el estudio de
muestras tumorales.

Líneas celulares
Se estudiarán tres líneas celulares humanas derivadas de gliomas: Gli36, U87 y
DBTRG.05MG
• Expresión de eIF2C, HIWI, HILI, Hsp27 y Hsp70: La detección de las proteínas
se realizará mediante inmunocitoquímica y Western blot (Fanelli et al 2008) en las
tres líneas celulares y en el modelo celular resistente a TMZ.
 • Inducción de un modelo celular resistente a TMZ: En primer término se determina
la IC50 de las líneas celulares parentales Gli36, U87 mediante un ensayo de
citotoxicidad utilizando la técnica de reducción del colorante MTT. Luego ambas
son expuestas a una concentración de 100 µm de TMZ por 2 semanas. Los clones
resistentes son aislados y repetidamente expuestos a su IC50 durante varios meses
(3-6). La resistencia a TMZ es comprobada mediante el ensayo MTS y
comparando los IC50 parentales con los de los clones resistentes.
• Ensayo de proliferación: se analizará mediante el ensayo colorimétrico MTS y el
estudio de la expresión del marcador de proliferación Ki-67.
• Ensayo de migración: se analizará mediante el ensayo de herida. La capacidad de
migración celular se determinará por el movimiento de las células hacia la lesión
creada. De ser posible, se evaluará mediante un sistema de filtros de matrigel
(Becton Dickinson Labware, Bedford, MA, USA).
• Capacidad de formación de colonias: se realizará un ensayo clonogénico.
• Muerte celular: será evaluada mediante la técnica del TUNEL modificada (Cuello-
Carrión et al 1999).
• Interacciones entre Hsp27 y proteínas argonautas: Se realizará transfección
transitoria en el modelo celular resistente con el objetivo de disminuir la expresión
de Hsp27 y evaluar así, los niveles de expresión de eIF2C, HIWI, HILI mediante
técnicas de Western Blot (WB), inmunocitoquímica (ICQ). Para la transfección
utilizaremos un vector shHsp27-pSIREN-RetroQ y pSIREN-RetroQ empty vector
(Mock transfection-control) que han sido gentilmente donados a nuestro laboratorio
por el Dr. MY Sherman (Boston University Medical School, Boston, MA). La técnica
de transfección ha sido estandarizada en nuestro laboratorio.
Muestras tumorales

• Expresión de eIF2C, HIWI, HILI: La detección de las proteínas se efectuará en

muestras tumorales del SNC (gliomas grado II a IV) (n=45), mediante la técnica
inmunohistoquímica. El laboratorio donde se plantea llevar a cabo el estudio
cuenta con un banco de tumores codificado y con aprobación de un Comité de
Ética (enviado oportunamente al CONICET y a la Agencia).
Factibilidad

El lugar de trabajo es el Laboratorio de Oncología, dependiente del Instituto de

Medicina y Biología Experimental de Cuyo, Unidad ejecutora del CONICET ubicada en el
Centro Científico y Tecnológico (CCT) de Mendoza. Este laboratorio e instituto cuentan
con todas las facilidades para llevar a cabo la investigación propuesta, además contamos
con las tres líneas celulares en nuestro grupo de trabajo y existe una sala de cultivo
celular en óptimas condiciones de uso.

El origen de los recursos financieros proviene de un PIP (2428) otorgado al Dr.

Daniel R. Ciocca y a la Dra. Mariel A. Fanelli, de un PICT 1047 Préstamo BID y de un
recientemente otorgado PIP (11220110100836) 2012-2014.
 Los equipos más importantes a ser utilizados son: estufas para cultivo de células,
lector de placas, microscopio, lupas binoculares, estufas con control automático de
temperatura, baños termostáticos, equipos para electroforesis y western blot, pHmetros,
freezer, heladeras, LAS-400 Fujifilm Life Science USA (analizador de imágenes) campana
extractora, etc.

Referencias Bibliográficas.

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Bouskine A, et al. (2010). Int J Androl, 33(1):54-63.

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