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++ CAMPÊLO, A.B. 1976. Caracterização e especificidade de Rhizobium spp de leguminosas

florestais. Tese de Mestrado da UFRRJ, Seropédica, 122p.
LOCAL - UFRRJ, Seropédica, Rio de Janeiro.

OBJETVS – Estudar as bactérias dos nódulos de leguminosas florestais nativas ou exóticas, com as
seguintes finalidades: (1) Investigar a forma do nódulo e da simbiose; (2) Estudar a flora
tropical, cujas características de nodulação são pouco conhecidas; (3) Observar as
características culturais e morfológicas do rizóbio; (4) Estabelecer a posição das leguminosas
florestais, dentro dos principais grupos de inoculação cruzada, de acordo com a especificidade
hospedeira, mostrando afinidades entre as subfamílias.

HOSPEDEIRS – Foram 43 espécies florestais nodulíferas. Clitoria racemosa.

INTRODZ

 Desde os tempos mais remotos, leguminosas são usadas para melhorar a fertilidade dos solos e a
maior parte do suprimento de N em sistemas naturais pode ser atribuída a FBN.

Bonnier & Brakel, 1970  Grandes quantidades de nitrogênio são retiradas do solo por ano pela
lixiviação e erosão, e um dos objetivos das práticas de plantios de leguminosas noduladas é
manter o equilíbrio entre o suprimento e a demanda de N no solo, permitindo sua utilização
intensiva sem risco de degradação ou de retorno ao estado natural.

Jacobson et al., 1948  Nas regiões tropicais sob pastagens as perdas de nitrogênio são estimadas
em 78 a 570 kg/ha/ano.

 Pela simbiose planta rizóbio, as leguminosas desempenham um importante papel na economia de

nitrogênio nos solos tropicais (erosão, devastação das matas).

 Os resultados da simbiose são um dos maiores exemplos de cooperação mútua na natureza. O N

molecular do ar é combinado com outros elementos químicos e formam compostos nitrogenados, os
quais a planta assimila para o seu crescimento.

 As leguminosas compreendem 13.000 espécies. As essências florestais pertencentes a esta

família são inúmeras e podem substituir satisfatoriamente o eucalipto, pois muitas espécies são de
crescimento rápido.

 O uso de leguminosas florestais inoculadas tem seu uso negligenciado. Não há interesse da parte
dos serviços de reflorestamento que dão ênfase ao cultivo de eucalipto e de outras espécies não
leguminosas. No entanto, o papel das leguminosas noduladas para trabalhos de reflorestamento na
recuperação de solos erodidos poderá vir a ser maior do que se possa imaginar.
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 Resultados positivos obtidos com o uso da inoculação com estirpes de estirpes de rizóbios
selecionadas e técnicas apropriadas às condições ecológicas, trarão uma influência favorável à
evolução destes trabalhos nos trópicos, resolvendo um grave problema que é a manutenção da
fertilidade dos solos.

 No que se refere à economia de N nos solos tropicais, utilizando espécies florestais noduladas,
nada se sabe. As pesquisas sobre nodulação, normalmente incluem leguminosas cultivadas e
raramente silvestres de interesse agrícola.

 Numa visão geral do revestimento florístico brasileiro, avalia-se que cerca de 40 % do território é
coberto por florestas equatoriais, que representam o maior maciço florestal do mundo.

Ducke & Black, 1953  Na Amazônia, a família de plantas mais bem representada em número de
espécies e indivíduos são as leguminosas..

 No panorama florestal Brasileiro há gradualmente o exaurimento das matas. As florestas tropicais

têm como principal função manter o equilíbrio climático de grandes áreas, e são a principal fonte de
tanino, corantes, saponinas, etc.

 No planalto brasileiro há um surto de renovação florestal. Pequenos plantios de algumas espécies

como araribá (Centrolobium tomentosum) e Jacarandá preto da Bahia (Dalbergia nigra). Algumas
espécies de acácias são muito importantes para a recuperação de solos erodidos e fixação de N2.

 Acacia molissima é uma das essências mais promissoras para reflorestamento e atualmente grandes
áreas estão sendo plantadas com esta espécie para produção de cortiça tanante.

REVISÃO

Gibson, 1974  A fixação biológica de nitrogênio por leguminosas noduladas é a interação de

inúmeros processos biológicos: fisiológicos (por sua interação com o metabolismo da planta),
químicos (pelas reações que ocorrem nos nódulos), anatômicos (pelas estruturas peculiares
que os nódulos apresentam), bacteriológicos (pelo comportamento do microrganismo),
edafológicos (por tratar-se de um fenômeno próprio do solo).

Postgate, 1974  A fixação biológica de nitrogênio contribui com cerca de 10-8-10-9 toneladas ano
de nitrogênio fixado na superfície terrestre. As leguminosas florestais têm importante papel
nesta relação.

Murad et al., 1968  No cerrado há condições amplas para folhosas de crescimento rápido. As
leguminosas mais encontradas nestas regiões são dos gêneros Bowdichia, Machaerium,
Dalbergia, Stryphnodendron, Dimorphandra e Enterolobium, as quais são de grande
importância para o balanço de N nestes solos.

 Dados de pesquisa que já existem, abrem perspectivas encorajadoras para maior competição dessa
fonte de nitrogênio (biológica) com a dos fertilizantes nitrogenados.
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Rocha et al., 1970  O potencial que existe para muitas leguminosas tropicais é enorme (ex. leucena),
apesar de seu emprego achar-se limitado a seleção de ecótipos.

ORIGEM DA SIMBIOSE

Norris, 1956  A relação entre grupos de leguminosas e seus rizóbios pode ser interpretada como
uma associação evolucionária, desde os hospedeiros mais primitivos (Caesalpinioideae e
Mimosoideae) passando pelas tribos mais primitivas das Faboideae, até as espécies mais
especializadas, noduladas por rizóbios de crescimento rápido e produtoras de ácido.

Vincent, 1974  As leguminosas parecem ser, basicamente, uma família de plantas tropicais.

Gundersen, 1950  As leguminosas primitivas eram árvores a arbustos que surgiram nas regiões
tropicais e subtropicais no período Cretáceo Superior, e daí se dispersaram para as regiões
temperadas. Os climas naquele período eram distribuídos na terra, da mesma maneira que
essas formas primitivas, mas com a revolução do Paleoceno, os climas tropicais tornaram-se
mais restritos e a vegetação tropical também se retraiu.

 A evolução teria se dado então, através de uma adaptação às condições temperadas, sendo a forma
original que ainda hoje é conservada por uma grande maioria de espécies tropicais, uma grande árvore
de folhas macias e sempre verdes, típicas de um ambiente sempre úmido.

Norris, 1958  A sequência de evolução das leguminosas seria então grandes árvores lenhosas 
arbustos e cipós lenhosos  ervas perenes  ervas anuais. Desta maneira, as ervas anuais
leguminosas das regiões temperadas seriam espécies altamente evoluídas. As subfamílias
Mimosoídeae e Caesalpinioideae tem se adaptado pouco as mudanças e são quase
completamente restritas aos tropicais e subtropicais, enquanto as Faboideae suportaram bem
as modificações, desenvolvendo um grande número de gêneros e espécies que invadiram as
zonas temperadas, embora a maioria das tribos Faboideae ainda mostre suas afinidades com
os trópicos.

Norris, 1967  A tribo Dalbergieae é ainda totalmente tropical, enquanto as tribos Trifolieae, Viceae
e Loteae são inteiramente de clima temperado, sendo ainda mais tolerantes a condições de
solos pobres.

 Outros autores como Parker (1968), Senn (1938) e Axelrod (1958) apresentam argumentos que as
leguminosas teriam sua origem em regiões sub-úmidas tropicais, subtropicais ou mesmo temperadas.

Senn, 1958  Comentou que considerar as Mimosoideae como primitivas, por serem os seus gêneros
predominantemente lenhosos é uma questão aberta a sérias discussões.

Norris, 1967  As leguminosas primitivas devem ter sido simbioticamente promíscuas.

Parker, 1968  As bactérias ancestrais dos nódulos eram provavelmente livres e capazes de fixar
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nitrogênio no solo.

 A demonstração recente de que Rhizobium do grupo promíscuo pode fixar nitrogênio em meio de
cultura, vem comprovar esta hipótese (Pagan et al., 1975; Dilworth & McComb, 1975).

Nutman, 1965  A composição botânica dos seis principais grupos de inoculação cruzada com as
tribos hospedeiras arranjadas filogeneticamente, mostrou que a taxonomia das hospedeiras e
os grupos de inoculação cruzada têm uma relação muito ampla.

Norris, 1958  Atualmente, um grau mais elevado de promiscuidade de inoculação predomina entre
as espécies tropicais, associadas ao tipo “cowpea” de rizóbio de crescimento lento, o qual seria
a forma típica e ancestral do organismo e dos quais todas as outras formas se derivaram. A
perda progressiva de promiscuidade, ou seja, o desenvolvimento da especificidade da bactéria,
tem ocorrido em muitos gêneros. No decorrer da evolução a família Leguminosae
desenvolveu uma especialização fisiológica, tornando-se seletiva em seus requerimentos.

Parker, 1968  Criticando a idéia de evolução defendida por Norris, segundo o qual, a bactéria do
nódulo evoluiu de um protótipo simbionte (ou seja que as linhas genéticas das 3 subfamílias
tiveram sua origem no mesmo período), concluiu que, ou as bactérias de crescimento rápido
são idênticas as de crescimento lento, mais primitivas, ou alternativamente, surgiram
associações simbióticas (leguminosas x bactérias) separadas em diferentes locais e tempos e
assim, dois ou mais gêneros de bactérias seriam envolvidos.

Norris, 1968  O grupo de inoculação Pisum - Trifolium, com uma faixa simbiótica muito estreita é
considerado como uma “condição degenerativa avançada” de especialização simbiótica.

OCORRÊNCIA DE NÓDULOS

 O fato de uma espécie não apresentar nódulos num dado momento, não deve ser uma conclusão
definitiva de que a espécie não nodula.

Beadle, 1964  É preciso que se façam várias coletas em vários locais para se confirmar se o solo
tem condições favoráveis ou não para a nodulação.

Norris, 1969  Fez observações sobre o status de nodulação de espécies da Amazônia, em mudas,
plantas novas e adultas, coletadas em geral em solos arenosos e muito ácidos (pH de 4,5 a
6,0), ou em solos argilosos. Nos resultados, 33 % das Caesalpinioideae nodularam e mais de
70 % das Mimosoídeae e Faboídeae estavam com nódulos. A nodulação variava com o solo
pois algumas espécies coletadas em solos argilosos não apresentavam nódulos, embora o
apresentassem em solos arenosos.

Allen & Allen, 1961  Em uma pesquisa mundial, verificaram que 90 % das Mimosoideae estavam
noduladas nos gêneros Albizia, Entada, Enterolobium, Pithecellobium, Leucaena, Piptadenia
e Parkia. Nos gêneros Calliandra, Inga, Mimosa e Prosopis, há espécies noduladas e outras
não. Das Caesalpinioideae (115 espécies examinadas), apenas 23 % eram noduladas. Nas
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Faboideae (1024 examinadas) a ocorrência de nódulos era de 93 %.

De Souza, 1966  Em Trinidad, observou que dentre 81 espécies estudadas, 63 estavam noduladas
sendo 40 pertencentes à subfamília Papilionoídeae, 17 Mimosoídeae e 6 Caesalpinioideae.

Beadle, 1964  Em zonas áridas e semi-áridas da Austrália, 68 espécies pertencentes a subfamília

Mimosoideae e Faboideae apresentaram nódulos, enquanto nenhuma Caesalpinioideae
nodulou.

Rothschild, 1970  Na flora Argentina observaram nodulação em 37 gêneros, 32 com espécies

noduladas. Dos 5 gêneros que não apresentaram nódulos, 4 eram Caesalpinioideae e 1
Mimosoídeae (Desmanthus).

Corby, 1974  A observação da ocorrência de nódulos entre 538 espécies de leguminosas da Rodésia
revelou que 489 nodulavam, sendo que 307 eram espécies herbáceas e 182 espécies eram
árvores. Noduladas: 29 % das Caesalpinioideae, 90 % das Mimosoídeae e 99 % das
Faboídeae. Das espécies que aparentemente não nodulavam, 96 % eram lenhosas.

Barrios & Gonzalez, 1971  Na Venezuela, 14 % das leguminosas nativas não apresentaram
nódulos.

Grobbelaar & Clark, 1972  As espécies africanas pertencentes à subfamília Caesalpinioideae não
apresentaram nódulos.

Allen & Allen, 1961  Na caatinga do Brasil, as espécies Caesalpinia bracteosa e Bauhinia forficata,
são conhecidas como não noduladas, enquanto espécies de Mimosa, Pithecellobium,
Piptadenia, Parkia (*) e Prosopis apresentam nódulos (e fixam nitrogênio com rizóbio
específico – Campelo & Campelo, 1972).

 Na região do cerrado, as principais espécies de Fabaceae nodulam, exceto Bowdichia (De Souza,
1966; Allen & Allen, 1947).

 Por muito tempo acreditou-se que a formação de nódulos era uma propriedade comum a todas as
leguminosas, no entanto, a pesquisa realizada por Allen & Allen, 1961, mostrou que 88% das espécies
conhecidas (apenas 10-12 % do total) são noduladas, sendo que a grande maioria pertence a
subfamília Faboideae.

Allen & Baldwin, 1954  Os gêneros Cassia, Bauhinia e Caesalpinia (Caesalpinioideae), são tidos
como não nodulados.

 O que se sabe atualmente sobre nodulação de florestas tropicais são apenas observações isoladas
e o “status” de nodulação pode variar com certo número de fatores ambientais adversos.

Bonnier, 1957  Em floresta equatorial observou a presença de muito poucos nódulos. Nas regiões
tropicais, a nodulação das leguminosas é um fenômeno cíclico.
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Norris, 1969  No Amazonas, espécies de Acacia e Mimosa, consideradas por Tutin (1958) como
noduladas, foram encontradas sem nódulos.

FORMA DO NÓDULO

Kidby & Goodchild, 1966  A forma dos nódulos é determinada inicialmente pelo hospedeiro, mas
pode ser modificada pela eficiência da inoculação.

Rothschild, 1963  Observou que a forma dos nódulos é constante em cada hospedeiro e depende
do meristema respectivo.

Allen & Allen, 1936  Geralmente nódulos novos geralmente são esféricos e brancos, enquanto
formas adultas apresentam lóbulos e são de cor preta ou marrom escuro. Em leguminosas
lenhosas os nódulos diferem pouco de leguminosas herbáceas.

Rothschild, 1963  A forma do nódulo tem relação com tribo que pertence a espécie botânica,
dependendo desta forma, da estirpe invasora.

Trinick, 1965  Nódulos formados em Acacia farnesiana por rizóbio isolado de leucena, são
semelhantes aos de leucena (ambas Mimosoideae), enquanto nódulos formados por Vigna
sinensis pela mesma estirpe, são esféricos, semelhantes aos nódulos formados por Rhizobium
de crescimento lento e nódulos formados em Mimosa invisa são típicos desta espécie.

Corby, 1971  Observações em plantas adultas, verificou que em Glycine a forma era globosa e
oblonga; em trefósia, alongado; em crotalária, coralóide e em Acacia alongado com lóbulos
distribuídos em forma de dedos.

Rothschild, 1963  A estrutura anatômica dos nódulos de espécies forrageiras tem sido estudadas
por vários autores.

Allen & Allen, 1940  Estudaram a estrutura anatômica de nódulos em leguminosas de grãos.
Amendoim tem nódulos endógenos.

 Em leguminosas lenhosas tropicais nada praticamente foi feito neste sentido.

Harris et al., 1949  Em Sesbania grandiflora que nodula bem sob condições naturais, foi feito um
estudo morfológico e anatômico afim de se observar a estrutura dos nódulos, cuja origem se
dá nas células corticais da raiz, sendo portanto, nódulos exógenos, que é o tipo mais comum.

COLORAÇÃO DE RAÍZES E FALTA DE NODULAÇÃO

 Raízes coloridas são mais frequentemente associadas às espécies não noduladas e por isso são mais
encontrada entre Caesalpinioideae, embora Faboideae e Mimosoideae também as apresentem.
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 A cor normal de raiz nodulada é de tonalidade branca, mas varia do amarelo pálido ao amarelo
ouro, do róseo ao vermelho mais escuro, sendo o marrom claro a cor mais comumente encontrada em
todas as tribos examinadas.

Corby, 1971  Há raízes coloridas com nódulos e raízes sem coloração que se apresentam noduladas,
embora haja uma tendência acentuada para as raízes não noduladas apresentarem-se coloridas.

RAZÕES PARA A FALTA DE SIMBIOSE

Conklin, 1936  A natureza bioquímica e biológica da simbiose é muito complexa, e a capacidade

de formar nódulos pode ser uma característica fisiológica, não encontrada sob certas
condições.

 A falta de nódulos principalmente em Caesalpinioideae pode ser considerada sob dois aspectos.

Nutman, 1946  Incapacidade de nodular: os desvios genéticos no hospedeiro ou na bactéria, podem

conduzir à perda total ou parcial da capacidade de nodular das espécies.

Vincent 1967  Há espécies de trevo vermelho resistente à inoculação com todas as estirpes, de
rizóbio testadas e essa resistência é devida a um simples gen recessivo com um componente
citoplasmático.

 As estirpes variam muito em sua capacidade de nodular. Com relação à planta são apontados como
causas principais responsáveis pela incapacidade de nodular, além de fatores genéticos:

Pochon & Barjac, 1958  A secreção de substâncias tóxicas pelas raízes interfere na capacidade de
nodulação.

Allen & Baldwin, 1954  A estrutura do pêlo radicular parece ter papel importante no funcionamento
da simbiose.

Dart, 1974  Sugeriu que, talvez, a resistência à infecção das raízes estivesse associada com presença
de taninos ou de polifenóis nas raízes das espécies, os quais provocariam a ausência de
nódulos.

 No entanto, parece que a maior limitação biológica diz respeito aos graus de incompatibilidade
entre os dois simbiontes.

RAZÕES QUE PROVOCAM A FALTA DE NÓDULOS

Bonnier & Brakel, 1969  A falta de nódulos nas florestas tropicais é atribuída à contínua reciclagem
de nitrogênio.

Beadle,1964  A ausência de rizóbio adequado no solo é apontada como uma das causas
responsáveis pela falta de nódulos.
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Graham & Hubbel, 1974  Fatores ambientais (pH, temperatura), afetam as bactérias e as espécies
que normalmente nodulam.

Vincent, 1967  Referiu-se a antagonismos entre o rizóbio e outros microrganismos do solo, capazes
de inibir a infecção.

Vincent, 1970  A perda da capacidade de nodular é relativamente comum e pode ocorrer sem
qualquer mudança de características culturais das estirpes.

INOCULAÇÃO CRUZADA

 Em 1879 foram feitos os primeiros estudos sobre isolamento de bactérias dos nódulos de
leguminosas. Frank deu o nome de R. leguminosarum às bactérias isoladas de ervilha e feijão.

 Durante algum tempo pensou-se que as bactérias dos nódulos pertenciam a uma única espécie
(Hellriegel, 1886; Hellriegel & Wilfarth, 1888), que observaram a ocorrência de nódulos, após a
inoculação de algumas leguminosas com estrato de solos não esterilizados, nos quais havia
leguminosas viçosas e bem noduladas.

 Em 1888, Beijerink observou a formação de nodosidades em Vicia faba L., por meio de inoculação
artificial, isolando a bactéria e denominando-a de Bacillus radicicola.

 Em 1900, Hiltner observou que a bactéria de Trifolium pratense não nodulava Medicago sativa L.
Alguns anos mais tarde, Bergeys, 1934, admitiu a existência de 6 espécies de rizóbios.

ESPECIFICIDADE HOSPEDEIRA

Allen, 1949  Certas bactérias alcança estágios avançados de desenvolvimento e tornam-se

específicas para determinada espécie, podendo ser benéficas para a essa espécie, mais
ineficiente em outras. As razões das preferências de uma bactéria por determinada espécie são
desconhecidas.

Graham & Hybbel, 1974  Embora a maior parte das leguminosas tropicais formem nódulos quando
inoculadas com rizóbios da chamada “miscelânea cowpea”, são diferentes as freqüências em
eficiência (importante na medida em que se desenvolvam novas variedades e espécies para
uso comercial nos trópicos).

Norris, 1967  Temos um grupo de inoculação cruzada quando um grupamento intimamente

relacionado de espécies de leguminosas evoluiu a um estágio de perda de promiscuidade.

Fred et al., 1932  Citou 16 grupos de inoculação cruzada, e os oito maiores incluiriam: alfafa,
ervilha, lupinos, cowpea, trevo, feijão, soja e lotus; mais oito grupos menores.

Waksman, 1932  Estabeleceu doze grupos de inoculação cruzada. Cassia e Acacia pertenciam ao
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grupo cowpea e Phaseolus vulgaris era outro grupo.

Carrol, 1934  Estabeleceu 20 grupos de inoculação cruzada, incluindo Aeschynomene, Erythrina,

Acacia e Mimosa, todos no grupo cowpea.

Wilson, 1939  Devido a impossibilidade de se estabelecerem os limites bem definidos entre as

relações rizóbio e certo grupo de plantas, afirmou que sob o ponto de vista científico o conceito
de inoculação cruzada não tem validade, embora tenha finalidades práticas. Assim, o
estabelecimento destes grupos seria mais um obstáculo do que um auxílio no estudo das
relações planta-bactéria.

Allen & Allen, 1947  Consideram que a relação planta-bactéria é o único fator disponível para
identificação de bactérias nos nódulos.

Allen & Baldwin, 1954  Atualizaram os 16 grupos de Fred et al., 1932 e os elevaram para 24.

Burton, 1952  Observou que em geral as espécies do grupo cowpea não necessitam de inoculação,
no entanto, nem sempre fica assegurado o benefício da simbiose.

Robinson, 1969  Sugeriram que geralmente leguminosas nodulam mais rápido e com mais
eficiência quando inoculadas com culturas homólogas.

Nutman, 1956  O grupo Trifolium de inoculação cruzada é muito restrito compreendendo apenas
espécies deste gênero.

Ishizawa, 1972  Nem sempre leguminosas do mesmo gênero são colocadas no mesmo grupo de
inoculação, como é o caso do gênero Mimosa.

Nutman, 1965  Fez uma subdivisão dentro do grupo cowpea, depois de observar que as estirpes
eficientes em Lotus uliginosus tendiam a serem ineficientes em Lotus corniculatus e vice
versa.

Trinick, 1963  Entre as leguminosas forrageiras e de adubação verde formou 4 grupos de inoculação
cruzada, sendo a Leucena colocada em um grupo à parte, pois só nodulou com rizóbio
homólogo, mostrando ser específica quando testada com estirpes pertencentes aos principais
grupos de inoculação. Para conseguir um crescimento vigoroso a leucena precisa de
inoculação com rizóbio específico.

Habish & Khairi, 1968  Testaram 21 estirpes de rizóbio de leguminosas do Sudão e admitiram que
Acacia sp tem seu grupo próprio de inoculação.

´Trinick, 1965  Estirpes isoladas de espécies dos gêneros Leucena e Mimosa nodularam uma
espécie do gênero Medicago.

 Informações sobre nodulação e grupos de inoculação em leguminosas florestais a não ser a

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leucena, são escassas. Praticamente nada se sabe sobre o assunto. Muitas espécies florestais não
se enquadram dentro dos mais conhecidos grupos de inoculação devido a sua especificidade.

Conklin, 1936  Ressaltando a importância das características fisiológicas, como complementação

dos métodos culturais para distinguir os microrganismos de diferentes hospedeiros dentro de
um mesmo grupo de inoculação, dividiu as espécies estudadas em dois grupos de inoculação
cruzada: a) cowpea-soja (Grupo 1) e ervilha (Grupo 2).

 Cassia é do Grupo 1, por produzir nódulos em cowpea. Bushnell e Sarles, estabeleceram 8 grupos,
adicionando ao grupo cowpea de inoculação uma espécie do gênero Cassia pelas características
culturais e morfológicas da estirpe isolada desta espécie, semelhantes a outras do grupo. Em leite
litmus, a estirpe apresentou reação muito alcalina e sem zona de soro, característica do rizóbio do
gênero cowpea.

Trinick, 1968  Leguminosas que antes eram consideradas como noduladas por rizóbio de
crescimento lento, nodularam algumas vezes eficientemente com rizóbio de crescimento
rápido.

Pankhurst, 1970  Admitiu dois grupos de inoculação dentro de um só gênero (Lotus), onde há
estirpes que produz ácido e outras que não produzem, no mesmo gênero.

 Sabe-se que algumas leguminosas são mais promíscuas do que outras, nodulando com estirpes
isoladas de plantas pertencentes a vários grupos de inoculação cruzada.

Graham & Parker, 1964  Comentaram que é extremamente rara a inoculação cruzada entre rizóbio
de trevo, ervilha e feijão e hospedeiros do grupo de crescimento lento, e que estirpes isoladas
de cowpea, soja e lupinus não nodulam hospedeiros do grupo da ervilha e do trevo.

Allen & Allen, 1939  Geralmente estirpes isoladas de plantas promíscuas não nodulam
reciprocamente outras plantas daquele grupo de inoculação.

 Como as espécies tropicais atuais conservam seus caracteres ancestrais é possível investigar o tipo
primitivo de nodulação e as formas originárias dos nódulos, hoje conhecidos.

MECANISMO DE INFECÇÃO

Humphrey & Vincent, 1959  Visualizaram os mecanismos de infecção da seguinte maneira: a

bactéria excreta substâncias solúveis em água, provavelmente polissacarídeos altamente
específicos, as quais seriam capazes de induzir a produção de poligalacturonase pelas raízes
da planta hospedeira.

Vincent, 1967  O princípio ativo atravessaria a parede celular, alcançaria o protoplasma e reagiria
com alguns componentes da célula.

Ljunggren, 1961  Sugeriu que tais substâncias extracelulares poderiam conter também
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ácidodesoxirribonucléico.

 A produção de poligalacturonase que antecede a invasão do pelo radicular, desempenha papel

importante na iniciação do cordão de infecção.

Solheim e Raa, 1971  Não encontraram diferenças na atividade pectolítica entre mudas inoculadas
e não inoculadas de Trifolium repens e de Medicago sativa.

Lillich & Elkan, 1968  Observaram que na simbiose de soja e Rhizobium japonicum a
poligalacturonase não é envolvida no processo de infecção.

CARACTERÍSTICAS CULTURAIS E MORFOLÓGICAS DO RHIZOBIUM

 Examinando grupos de inoculação, geralmente as bactérias têm características morfológicas e

culturais semelhantes.

Graham 1964  Observou diferenças no uso de carboidratos por diferentes estirpes de rizóbio.

Drets & Arias, 1972  Encontraram diferenças enzimáticas entre estirpes de rizóbios, classificadas
de acordo com a velocidade de crescimento em rápidas e lentas.

 As de crescimento rápido, possuem enzimas correspondentes ao ciclo da hexose monofosfato,

enquanto as de crescimento lento apresentam ausência de atividade de NADP-6 fosfogluconato
desidrogenase (6 PGS).

Graham, 1964  Observou que existem afinidades entre estirpes do grupo de crescimento rápido e
grandes diferenças entre esse grupo e as de crescimento lento.

Drets et al., 1974  Mostraram que existem grandes diferenças no crescimento e uso de sacarose por
estirpes de rizóbios. Rizóbio de crescimento rápido tem presença de invertase que metaboliza
sacarose; lento não tem, tornando-se assim inadequado o uso da sacarose para crescimento de
rizóbio deste tipo. A velocidade de crescimento dependeria assim de uma falha metabólica.

 Esta caracterização metabólica é importante do ponto de vista prático, uma vez que fornece um
método simples na identificação de espécies de rizóbios.

Norris, 1969  Algumas leguminosas tropicais (sabiá, leucena), tem rizóbio de crescimento rápido
semelhante a leguminosas se clima temperado na utilização de carboidratos e são muito
específicas. Certas estirpes de Mimosa alcalinizam o meio e outras o acidificam.

 Estirpes de Cassia produziram reação alcalina dentro de duas semanas, num meio em que foram
usados vários carboidratos (açucares, álcoois e ácidos orgânicos), sendo o melhor crescimento obtido
com arabinose, glicose e frutose, variando o pH de 7,0 e 7,4.

Conckin, 1936  Um crescimento ligeiramente mais abundante foi observado em algumas estirpes,
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quando o carboidrato era esterilizado por filtração.

Vincent, 1970  Comentou que rizóbio é uma bactéria heterotrófica que usa grande faixa de
carboidratos, e de requerer, de acordo com a estirpe, para um melhor crescimento, um ou mais
aminoácidos e ou vitaminas.

Vincent, 1974  Muito rizóbio de crescimento lento, cresce melhor em galactose ou arabinose,
mas manitol é a fonte de carbono mais usada em meio de cultura. As de crescimento rápido
usam uma faixa mais larga de compostos de carbono do que as de crescimento lento.

Norris, 1965  Sugeriu que as leguminosas que nodulam melhor em condições ácidas estão
associadas à rizóbio de crescimento lento, que não produzem ácido em meio de cultura. As
leguminosas adaptadas a pH neutro são associadas a rizóbios de crescimento rápido, os quais
necessariamente produzem ácido.

 Apesar da existência de numerosas hipóteses em torno do crescimento rápido ou lento e da

produção de ácido ou álcali pelo rizóbio de leguminosas temperadas ou tropicais, respectivamente,
há pouca informação existente a respeito das causas fisiológicas dessas características.

Norris, 1965  Estabelece uma divisão entre estirpes que acidificam o meio e estirpes que
alcalinizam, usando manitol no meio de cultura. Como fonte energética esse açúcar mostrou-
se melhor que a sacarose para ambos os grupos.

ATIVIDADE ESPECÍFICA DA NIGROGENASE

 A nitrogenase é a enzima responsável pela fixação que reduz N2 para NH3, mas também C2H2 para
C2H4, dando relação teórica de 1 mol de N2 para 3 moles de C2H4 produz. Tem alta precisão.

TAXONOMIA

Burkart, 1952  O rizóbio apresenta um polimorfismo que tem caráter de fases sucessivas em seu
ciclo vital podendo apresentar-se de 3 formas: pequenos bastonetes flagelados, micrococus e
bastonetes sem flagelos que são iguais a bacteróides. Quanto a flagelação, a maioria das
estirpes tem poucos flagelos, sendo encontrados 2 tipos. Estirpes de crescimento rápido que
têm pelos perítriquios com vários flagelos dispersos (comprimento de 1,3-1,6 micra); as de
crescimento lento são monotríquios (soja), flagelos com comprimento de 1,9-2,2 micra.

Bergey, 1934  Agrupou os rizóbios em dois grupos de acordo com comportamento em leite litmus
e flagelação: 1) Os que tornam o meio alcalino, e neste grupo estão os que formam zona de
soro e são peritríquios, e os que não formam zona de soro e são células monotríquias. 2) Os
que tornam o meio ácido, formam uma zona de soro e as células são peritríquias.

 A taxonomia de rizóbio tem sido objeto de muitos trabalhos. O conceito de considerá-los

pertencentes a uma única espécie predominou durante muito tempo.
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Frank, 1879  Estabeleceu a separação de um gênero especial Rhizobium leguminosarum.

 Atualmente são conhecidos 6 diferentes grupos de inoculação cada qual com seu rizóbio
específico:

Rhizobium trifolii Dangeard, para o grupo dos trevos.

Rhizobium meliloti Dangeard, para a alfafa.
Rhizobium leguminosarum Frank, para a ervilha.
Rhizobium lupini Eckharolt, para lupinus.
Rhizobium japonicum Buchanam, para soja.
Rhizobium phaseoli Dangeard, para o feijão

 Também um grupo com alto grau de promiscuidade denominado de grupo cowpea. No entanto,
existe muita controvérsia sobre essa classificação.

Norris, 1969.  A posição taxonômica da planta dentro da família é uma consideração inicial que
deve ser estabelecida em estudos desse tipo.

Corby, 1971  Depois de ter observado mais de 400 espécies de leguminosas da Rodésia, encontrou
uma relação entre a forma do nódulo maduro e a classificação tribal da hospedeira, havendo
portanto uma forma característica para cada tribo.

MT & MËTDS

 Descreve a procedência do material, das sementes e dos solos. Os experimentos foram em casa de
vegetação da EMBRAPA-RJ. Observações de flagelação na UFRJ.

 Observada a capacidade de nodulação de 43 espécies florestais. As observações de nodulação foi

o experimento inicial. Em casa de vegetação, vasos com 10 kg de areia lavada. Blocos ao acaso com
3 repetições. A germinação foi feita em sementeira.

 Foram testadas 24 estirpes de rizóbios. A determinação das espécies foi feita usando as seguintes
publicações: Braga, 1953; Campelo, 1970; Engler, 1964; Bentham, 1876; Barroso, 1946 e Jackson &
Hooker, 1946.

 Foi feito o pré-tratamento das sementes, usando H2SO4 concentrado, variando o tempo conforme
a resistência do tegumento durante 10-15 minutos. Usou-se água corrente até lavagem completa do
ácido.

 Para esterilizar, HgCl2 (1: 1000), 2-3 minutos em água estéril, lavagens 5 vezes. Após esses
tratamentos as sementes foram plantadas nas sementeiras.

 Tanto vasos quanto sementeiras foram adubados com solução 3,5% KH2PO4, 5 mL por kg de
areia, e com uma solução com elementos menores (1 mL por kg de areia).
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 Solução de elementos menores:

MgSO4.7H2O: 150,000 g;
CuSO4.5H2O: 15,800 g
ZnSO4.7H2O: 8,908 g
H3BO3: 1,000 g
Na2MOO4.2H2O: 0,500 g
FeSO4.7H2O: 20,000 g

 A esta solução foram adicionadas 20,000 g de ácido cítrico, completando-se o volume para 1.000
mL com água destilada. A solução foi esterilizada em autoclave por 30 minutos a 1,5 atm.

 As sementeiras foram caixas de madeira com areia lavada, esterilizadas em autoclave por 1 hora a
1,5 atm. Com 8 dias de nascidas, as plantinhas foram transplantadas para vasos, uma por vaso, e
receberam o inoculante.

 O inoculante foi o meio de cultura 79 (Fred & Waksman, 1928), semi-líquido, distribuídas em
erlenmeyers (30 mL em cada) e repicadas as estirpes de rizóbio. Incubado em estufa a 30ºC até a
cultura atingir um bom desenvolvimento (6-8 dias).

 Testada quanto à pureza ao microscópio e riscada em placas. Comprovada a pureza, 5 mL de cada

cultura por vaso.

 Composição do meio: Aguar (bacto-agar, difco) = 2 g; manitol, 10 g; K2HPO4 = 0,1 g; KH2PO4 =

0,4 g; MgSO4.7H2O = 0,2 g; NaCl = 0,1 g; extrato de levedura = 10% = 100 mL; azul de bromotimol
solução 0,5 alcoólica = 5 mL e água destilada, q.s.p. 1.000 mL.

 Esterilizado em autoclave por 20 minutos até 1,5 atm (120ºC).

 As estirpes foram divididas em 2 grupos (duas estirpes de cada espécie). No primeiro: angico,
sabiá, vinhático liso e mulungu; No segundo: catinga de barrão, sombreiro, jacarandá, cássia, leucena,
ébano, algaroba e pitecelóbio.

 Cada espécie florestal foi inoculada com 5 g de solo do local de procedência da semente ou com
as estirpes de rizóbio dos 2 grupos citados.

 Vasos do grupo I – 40 ml de cultura (5 ml de cada estirpe).

 Vasos do grupo II – 80 ml de cultura.

 Colheita e observações. 65 dias após transplantio. Foi feita a observação de nodulação, número,
cor e forma do nódulo. Para forma, considerou-se apenas o nódulo maduro. Simultaneamente foram
feitas observações em 17 espécies de leguminosas colhidas no campo na área da UFRRJ, em plantas
adultas e jovens para constatar o status de nodulação em seu habitat natural.

 Em plantas jovens, as observações foram arrancando-se o sistema radicular completo. Em plantas

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adultas, o solo era escavado com enxadão, junto às raízes principais e secundárias mais jovens, até
a profundidade de 0,50m, onde eram cortadas e examinadas no próprio local.

 Foi considerada jovem a planta com altura de até 1 m, aproximadamente. Inoculação cruzada: teve
a finalidade de estabelecer grupos de inoculação aos quais pertencem as diversas espécies florestais.
11 espécies forma testadas em casa de vegetação.

 No segundo experimento 11 espécies florestais mais 1 forrageira (Stylosanthes), com 19 estirpes

de rizóbio e 3 repetições. Blocos com 36 latas (latas de cerveja de 250 mL), com areia de praia lavada
e esterilizada em autoclave por uma hora a 1,5 atm.

 Sementeiras e latas. Sementeiras foi o experimento 1 e adubação das latas igual também.
Transplante e inoculação. Após 8 dias de germinadas, transplantadas para latas. Inoculação 1 mL por
lata de cada cultura. Inoculante em meio 79. Estirpes foram testadas quanto a pureza.

 Colheita e análise. Aos 65 dias após o transplante. Nas não noduladas observada a cor das raízes.
Nas noduladas: ARA, cor, número, peso do nódulo seco e cor das raízes. Para medir ARA, raízes com
nódulos foram cortadas (retirando-se antes o excesso de areia). Introduzidas em frascos com 120 mL
e fechados com tampa de borracha perfurável com agulha hipodérmica.

 Parte do ar contido nos frascos foi substituído por acetileno (retirado de um cilindro, aspirando-se
12 mL de ar (10%) e injetando-se 12 mL de acetileno com a seringa. Nos frascos havia 10 % de C2H2.
Incubação em temperatura ambiente por 1 hora.

 Foi aspirado 0,5 mL da mistura gasosa nele contida. As agulhas foram introduzidas em rolhas de
borracha fixadas num suporte onde permaneciam até o momento da ingestão no cromatógrafo. Feitas
observações do número, cor e forma. Nódulos foram levados à estufa a 65ºC para secagem e posterior
pesagem.

 Ensaios de laboratório. Fontes de carbono para crescimento de rizóbio. Usando o meio 79, sólido,
com azul de bromotimol, pH 6,8 e 15 g de agar por L. Foram testadas 54 estirpes de rizóbio em:
galactose, dextrose, arabinose, maltose, manitol, xilose, açúcar cristal e succinato sódio (pH 7,3).

 Soluções a 10 % de galactose, dextrose, arabinose, maltose, manitol, xilose, succinato de sódio e

açúcar cristal foram preparadas e esterilizadas em filtros Seitz. Após esterilização foram adicionados
ao meio básico 1 % da solução com o auxílio de pipeta estéril. O meio foi homogeneizado com uma
delicada agitação do tubo.

 Todas as estirpes foram repicadas em tubos testemunhas (meio 79 sem fonte de carbono) e
observadas aos 6, 10, 14 e 20 dias após a incubação. Culturas tinham a mesma idade, desenvolvidas
em manitol e testadas quanto a pureza.

 As estirpes BR-23 e F310 são típicas de crescimento rápido e lento, respectivamente. Br-23 de
Stylosanthes tem crescimento lento e F310 de Phaseolus vulgaris, tem crescimento rápido.
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 Para observações do pH foi preparada para comparação uma escala de meio líquido com azul
de bromotimol como indicador, em tubos de ensaios. Como referência o pH 6,8. A escala foi ajustada
com ácido acético ou solução a 0,1% de NaOH, até se conseguir uma escada de pH que variava de
5,8 a 7,8, a qual era medida em potenciômetro.

 Avaliação do crescimento, aos 20 dias após a repicagem: abundante, bom, regular, ruim, sem
crescimento. Aspecto e tempo de aparecimento das colônias. Avaliado em meio 79 + manitol, riscadas
com alça de platina. Pureza foi em observações microscópicas.

 Crescimento rápido é quando o aparecimento da colônia se dava entre 24 e 72 horas depois de

repicadas. Depois desse tempo o crescimento é lento. 48 horas após o desenvolvimento das colônias,
foi avaliada a formação de muco, observando-se a cor das colônias e medindo o tamanho das mesmas.

 Comportamento das estirpes em leite litmus. O preparo do leito foi de acordo com o manual da
Difco (1953).

100 g de leite em pó desnatado

0,75 g de bacto-litmus
Água destilada q.s.p. 1.000 mL

 Distribuído 5 mL para cada tubo de ensaio, em 108 tubos. Autoclave a 110ºC, 15 minutos.
Repicados e incubados a 30ºC. Observadas mudanças de pH e formação de zona de soro, por 35 dias.

 Característica flagelar. Objetivo: identificar o tipo de flagelo do rizóbio de crescimento lento e de

crescimento rápido. A atividade da cultura foi observada em microscópio óptico. 10 mL da cultura
bem desenvolvida foram transferidos para tubos de centrífuga, esterilizados e em seguida levados à
centrifugação a 4.000 rpm por 30 minutos.

 Terminada a centrifugação, o líquido sobrenadante foi retirado com pipeta estéril e desprezado.
Adicionou-se 1 mL de soro fisiológico, agitando-se levemente o tubo da centrífuga, em seguida a
cultura foi transferida para tubo de vidro graduado + 3 gotas de glutaraldeido a 25% (usado como
fixador). Até se fazer a coloração negativa os tubos foram conservados em geladeira.

 Técnica de coloração negativa. Com pipeta Pasteur, sobre a grelha do microscópio eletrônico: uma
gota da cultura por 1 minuto até a sedimentação. Com a mesma pipeta, retirou-se o líquido em excesso
e o sedimento foi secado com o auxílio de papel de filtro.

 Com pipeta Pasteur, uma gota de cortante por 1 minuto em seguida fotografias. Corante:
bacitracina (10 u/mL) PTA (Àcido fosfotungstático) a 2 % e pH 7. A grelha foi preparada com uma
camada fina de carbono para imprimir maior rigidez a mesma.

RESULTS

 Clitoria racemosa. Coletada no Km 14, RJ, tribo Phaseoleae. Cor da raiz, branca a amarela.
Inoculação com solo, cor rosa. Forma esférica, número de plantas 10. Grupo 1. Não nodulou com
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rizóbio de angico, sabiá, mulungu e vinhático liso. Grupo 2. Cor rosa, forma esférica, número de
plantas igual a 5. No grupo 2 estava sombreiro, jacarandá, leucaena, ébano, algaroba, lonchocarpo,
cássia e pitecelóbio.