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Anatomische Untersuchung
des Nervensystems
Claudia Mahlke

6.1 Gewebeaufbereitung – 126


6.1.1 Präparation, Fixierung und Einbettung – 126
6.1.2 Schneidetechniken – 127

6.2 Übersichtsfärbungen – 127


6.3 Nachweis und Lokalisation von Protein und mRNA im
Nervensystem – 129
6.3.1 Immunhistochemie – 130
6.3.2 Enzymhistochemie – 134
6.3.3 In situ-Hybridisierung – 134

6.4 Nachweis neuronaler Aktivität – 136


6.4.1 Aktivitätsregulierte Gene – 136
6.4.2 Autoradiographie – 138
6.4.3 Reportermäuse – 139
6.4.4 Cat-FISH – 139

6.5 Tracing-Verbindungsstudien – 140

Literatur und World-Wide-Web-Links – 142

G. Hermey et al., Der Experimentator: Neurowissenschaften,


DOI 10.1007/978-3-8274-2369-6_6, © Spektrum Akademischer Verlag Heidelberg 2010
126 Kapitel 6 • Anatomische Untersuchung des Nervensystems

Die Grundbausteine komplexer neuronaler Struk- ser erhalten bleiben und Färbungen der Gewebe
turen bilden Nerven- und Gliazellen. Obwohl das deutlicher werden. Das am weitesten verbreitete
Wissen über diese kleinsten Einheiten des Nerven- Fixierungsmittel ist Formaldehyd. Formaldehyde
systems in den letzten Jahrzehnten exponentiell besitzen die Eigenschaft, dass sie Proteine über so
gewachsen ist, sind wir weit davon entfernt die genannte Methylenbrücken vernetzen. Die Ver-
komplizierten Mechanismen und Funktionen die- netzung ist kein sehr schneller Prozess und die
ser Zellen in ihrer Gesamtheit zu verstehen. Noch Anzahl an Methylenbrücken nimmt über die Zeit
viel weniger wissen wir, wie die vielen Zellen genau zu. Man geht jedoch davon aus, dass die Bindung
verknüpft sind und wie sie zusammenspielen, um von Formaldehyd an Proteine nach ca. 24 h abge-
Informationen zu verarbeiten, zu speichern und schlossen ist. Häufig findet man Formaldehyd im
weiterzugeben. Auch wenn anatomische Untersu- Labor als Polymer, welches als Paraformaldehyd
chungen eine vergleichsweise alte Technik darstel- bekannt ist. Da man für die Fixierung Monomere
len, sind sie immer noch überaus wertvoll, da sie benötigt, muss das polymere Paraformaldehyd-
6 uns über die detallierte Analyse der Struktur Infor- pulver vor der Anwendung gelöst, also in Mono-
mationen über das Zusammenspiel und die Verbin- mere gespalten werden. Die Spaltung findet dabei
dungen der einzelnen Bausteine geben können. Die sehr viel schneller in alkalischem Milieu statt und
konsequente Weiterentwicklung dieser Methoden wird zudem über Erwärmung der Paraformalde-
erlaubt heute eine noch feinere und detailliertere hydlösung auf 60°C beschleunigt. Häufig findet
Untersuchung neuronaler Verschaltungen und man in Protokollen auch die Anweisung, das Ge-
bietet zusammen mit dem histologischen Nach- webe mit Formalin zu fixieren. Formalin ist eine
weis von Proteinen und Gentranskripten direkt im Lösung monomerer Formaldehyde, die durch die
Gewebe ein komplett neues Spektrum der funktio- Zugabe von Methanol daran gehindert werden zu
nellen Analyse komplexer neuronaler Strukturen. polymerisieren und auszufallen. Benötigt man eine
Neben den vielen praktischen Aspekten der ana- stärkere Fixierung kann man auch Glutaraldehyd
tomischen Analyse ist das Gehirn auch ein überaus verwenden, welches pro Molekül zwei Aldehyd-
ästhetisches Organ und man muss schon »stump- gruppen besitzt, die über drei variable Methylen-
fen Sinnes«1 sein, um sich nicht an der Schönheit brücken verbunden sind. Die Glutaraldehydfixie-
zu erfreuen, die sich dem Auge bietet, wenn man rung wird häufig bei elektronenmikroskopischen
Präparate des Gehirns unter dem Mikroskop be- Untersuchungen angewendet oder zum Nachweis
trachten darf. von löslichen Aminosäuren wie Glutamat, GABA
oder Glycin. Oft werden auch Mischungen aus den
verschiedenen Aldehyden eingesetzt. Je nach Ge-
6.1 Gewebeaufbereitung webegröße kann die Fixierung durch Einlegen in
das Fixativ oder Fixierung der Organe über den
6.1.1 Präparation, Fixierung und Blutkreislauf (Perfusion) erfolgen. Bei größeren
Einbettung Organen, wie dem Gehirn, empfiehlt sich die Fi-
xierung über den Blutkreislauf, da ansonsten das
Da Nervengewebe sehr weich und verletzlich ist Fixativ von außen nach innen eindringen muss
und zudem Abbauprozesse nach Gewebeentnah- und es somit zu einer ungleichmäßigen Fixierung
me sehr schnell einsetzen, ist es wichtig, das Ge- des Gewebes, mit stärker fixierten Bereichen an
webe schnell zu präparieren und nach der Präpa- der Oberfläche und weniger stark fixierten Berei-
ration sofort zu fixieren. Durch die Fixation kann chen im Inneren, kommen kann. Die Fixierung
die Zersetzung des Gewebes aufgehalten werden. mit Formaldehyden kann jedoch auch Nachteile
Proteine werden denaturiert und vernetzt und Li- haben. Viele Proteine verlieren durch die Fixierung
pide werden stabilisiert, wodurch Strukturen bes- ihre antigenen Eigenschaften, da die für die Anti-
körperbindung entscheidenden Proteinbereiche
unter Umständen vernetzt oder maskiert wurden.
1 Zitat aus Kükenthal’s Leitfaden für das Zoologische
Praktikum, 19 Auflage, 1984 In diesem Fall kann man versuchen, entweder eine
6.2 • Übersichtsfärbungen
127 6
etwas »leichtere« Fixierung vorzunehmen oder das Regel Schnitte zwischen 5 und 20  µm angefertigt,
Gewebe nach der Fixierung so behandeln, dass in Einzelfällen auch dünner. Mit Hilfe der Paraffin-
die Bindungsstellen wieder frei werden, ein Vor- einbettung kann man sogar noch dünnere Schnitte
gang der als Antigen-Demaskierung bezeichnet anfertigen, hierzu muss das Gewebe entwässert, in
wird und auf den in  7  Kap.  6.3 nochmal im De- Paraffin eingebettet und mit einem Mikrotom ge-
tail eingegangen wird. Neben der Fixierung mit schnitten werden. Für die elektronenmikroskopi-
Formaldehyden kann man eine Alkoholfixierung sche Analyse werden Gewebestücke mit Kunstharz
vornehmen oder das Gewebe »frisch«, also gleich eingebettet, wodurch eine Schnittdicke im Nano-
nach der Präparation schockgefrieren. Alkohole, meterbereich möglich wird. Dabei ist die Schnittdi-
vor allem Ethanol fixieren das Gewebe über den cke nicht immer ausschlaggebend für die Qualität
Entzug von Wasser und maskieren die Antigenbin- einer Präparation. So ist z. B die Strukturerhaltung
dungsstellen dementsprechend weniger. Allerdings von Vibratomschnitten sehr viel besser als die von
schrumpft das Gewebe durch den Wasserentzug Kryoschnitten.
und Alkohole können zudem das Gewebe weniger Neben der Schneidetechnik spielt bei der histo-
gut durchdringen, daher werden sie häufiger für die logischen Analyse des Gehirns die Schnittrichtung
Fixierung von bereits geschnittenem Material ein- eine entscheidende Rolle. Man fertigt Horizontal-
gesetzt. Auch wenn für die meisten Standardme- schnitte an, wenn man bei einer Maus das Gehirn
thoden etablierte Fixierungsprotokolle existieren, von dorsal (oben) nach ventral (unten) schneidet,
muss man für viele neue Methoden erst einmal die Coronalschnitte werden von rostral (vorne) nach
optimale Fixierung ermitteln. Vor allem für den caudal (hinten) geschnitten und sagittal schneidet
immunhistochemischen Nachweis von Proteinen man von lateral nach lateral (.  Abb.  6.1). Welche
über Antikörperbindung muss die Fixierung oft Schneiderichtung man wählt, hängt davon ab wel-
angepasst werden, um ein möglichst gutes Ergeb- che Region des Gehirns untersucht werden soll.
nis zu erzielen. Viele Regionen sind besonders gut in Schnitten
einer bestimmten Schnittrichtung zu identifizie-
ren, so kann man die verschiedenen Regionen des
6.1.2 Schneidetechniken Hippocampus besonders gut in coronalen Schnit-
ten sehen und für Untersuchungen des Hörcortex
Das Gewebe muss für die lichtmikroskopische sind horizontale Schnitte am besten geeignet. Da-
Analyse sehr dünn sein, und es wird daher mit mit man sich in den Hirnschnitten zurechtfindet
Hilfe verschiedener Schneidetechniken in sehr und die einzelnen Strukturen identifizieren kann,
dünne »Scheiben« geschnitten. Formaldehyd-fi- haben fleißige Wissenschaftler so genannte Atlan-
xiertes Gewebe ist sehr fest, fast gummiartig, und ten (Maus, oder Ratte) erstellt, in denen exemp-
kann mit einem Vibratom geschnitten werden. In larisch Hirnschnitte dargestellt und die einzelnen
das Vibratom wird ein sehr scharfes Messer ein- Regionen wie Länder in einem Atlas bezeichnet
gespannt, häufig eine Rasierklinge, wobei sich das sind. Neben den Atlanten in Buchform kann man
Messer vibrierend durch das Gewebe bewegt. Die mittlerweile auch viele Informationen frei zugäng-
Schnitte werden dann in Puffer aufgefangen und lich über das Internet erhalten (Links am Ende des
können »schwimmend« weiterbehandelt werden. Kapitels), allerdings sind die ursprünglichen Atlan-
Vibratomschnitte sind meist 20–40 µm dick, in sel- ten in Buchform meist sehr viel detaillierter.
teneren Fällen auch dünner. Benötigt man dünnere
Schnitte, kommt meist ein Kryostat, auch Gefrier-
mikrotom genannt, zum Einsatz. Schockgefrorenes 6.2 Übersichtsfärbungen
Gewebe kann direkt geschnitten werden; Formal-
dehyd-fixiertes Gewebe muss erst über osmotisch Da man in einem ungefärbten Hirnschnittpräparat
wirksame Substanzen, z.  B Sucrose, entwässert kaum Strukturen oder gar Zellen erkennen kann,
werden, um die Bildung von Eiskristallen zu ver- müssen die Schnitte für die histologische Analyse
hindern. Mit Hilfe des Kryostats werden in der gefärbt werden. Generell können alle für die Histo-
128 Kapitel 6 • Anatomische Untersuchung des Nervensystems

. Abb. 6.1 Schnittrichtungen dorsal

caudal rostral

ventral

sagittal
horizontal
6
coronal

logie etablierten Methoden auch für das Anfärben färbt, wie das Kresylviolett bei der Nissel-Färbung,
von Nervengewebe verwendet werden. Im Fol- alle negativ geladenen (»basophilen«) Struktu-
genden möchten wir nur kurz auf die gängigsten ren blau (DNA; Zellkern; rER usw.). Eosin ist ein
Übersichtsfärbungen in den Neurowissenschaften synthetischer, negativ geladener (saurer) Farbstoff,
eingehen. der alle basischen acidophilen Strukturen, also
Nissl-Färbung: Die durch Franz Nissl (1860– vor allem die Zellplasmaproteine, rot färbt. Nach
1919) etablierte Färbetechnik beruht darauf, dass der Hämatoxilin-Färbung erscheinen die Zellker-
kationische (positiv geladene, basische) Farbstoffe ne zunächst rötlich-braun aufgrund des niedrigen
sich an die im Gewebe vorliegenden anionischen pH-Wertes der Färbelösung. Durch Erhöhung des
(negativ geladenen, saure) Moleküle anlagern. Ani- pH-Wertes (Bläuen) schlägt der Farbton in das ty-
onische Gruppen liegen vor allem in den Phosphat- pische blau-violett um. Gebläut wird durch Spülen
resten vor, die massenhaft in der DNA der Zellker- in Leitungswasser. Anschließend folgt die Cyto-
ne, in der ribosomalen RNA des Nucleolus und im plasma-Färbung in einer alkoholischen oder wäss-
mit Ribosomen besetzten (»rauen«) endoplasma- rigen Lösung von Eosin.
tischen Reticulum (rER; Nissl-Substanz) vorkom- Markscheidenfärbung: Myelinisierte Axone
men. Die Anlagerung ist dabei pH-abhängig. Mit des Gehirns (weiße Substanz) können mit Hilfe
steigenden pH-Wert verstärkt sich die Dissoziation von Markscheidenfärbungen dargestellt werden.
der Phosphatreste und der Farbstoff lagert sich be- Verwendet werden Eisenhämatoxylin (nach Wei-
sonders gut an. Ist der pH-Wert jedoch zu hoch, gert, Olivecrona oder Heidenhain-Wölcke) oder
können auch die Carboxylgruppen dissoziieren eine kombinierte Markscheiden und Zellfärbung
und es kommt zu einer unspezifischen Bindung (nach Klüver-Barrera). Dabei handelt es sich um
der Farbstoffmoleküle im gesamten Gewebe. Bei einen Kombination der Nissl-Färbung mit einer
niedrigem pH entfärbt man den Schnitt, da die Dis- Markscheidenfärbung durch Luxol Fast Blue, wo-
soziation zurückgedrängt wird. Als Farbstoff wird durch die markhaltigen Fasern tiefblau hervortre-
heute häufig das Kresylviolett eingesetzt, welches ten, während die Zellkerne durch einen violetten
zu einer violetten Färbung der Nucleinsäuren führt. Farbton zu erkennen sind.
HE-Färbung: Bei der Hämatoxylin-Eosin- Golgi-Imprägnation: Hierbei handelt es sich
Färbung (abgekürzt HE-Färbung) handelt es sich wohl immer noch um die schönste Darstellung
ebenfalls um eine Übersichtsfärbung neuronaler einzelner Nervenzellen. Die von Camillo Golgi
Strukturen. Hämatoxylin ist ein natürlicher, posi- (1843–1926) etablierte Färbung beruht auf einer
tiv geladener Farbstoff aus dem Blauholzbaum. Er »Versilberung« von Nerven- und Gliazellen und
6.3 • Nachweis und Lokalisation von Protein und mRNA im Nervensystem
129 6
lässt diese schwarz-braun auf gelbem Hintergrund A
erscheinen. Golgi-Zellen werden in ihrer Gesamt-
heit gefärbt, d. h. man kann sowohl Zellkörper als
auch axonale Strukturen, dendritische Fortsätze
und sogar die postsynpatische Dornenfortsät-
ze (spines) mit ihr sichtbar machen. (.  Abb.  6.2)
Allerdings konnte bis heute nicht geklärt werden,
warum sich manche Zellen mit der Golgi-Methode
anfärben lassen andere aber nicht. Das etwas unzu-
verlässige Prinzip der Färbung beruht darauf, dass
kleinere Stücke des Gehirns über mehrere Tage fi-
xiert werden und dann in einem Gemisch aus Ka-
liumbicarbonat und Osmiumsäure mit Silbernitrat
»versilbert« werden. Der berühmte Neurohistologe
B
Santiago Ramón y Cajal (1852–1934) hat mit Hilfe
der Golgi-Färbung und den von ihm eingeführten
Abwandlungen neuronale Strukturen und Verbin-
dungen mit großer Genauigkeit und Akribie be-
schrieben. Für ihre Arbeiten zur Struktur des Ner-
vensystems erhielten Camillo Golgi und Santiago
Ramón y Cajal zusammen 1906 den Nobelpreis für
Medizin.

6.3 Nachweis und Lokalisation von


Protein und mRNA im
Nervensystem
. Abb. 6.2 Golgi-Imprägnation. (A) Cortikale Pyramiden-
Für viele neurowissenschaftliche Fragestellungen zellen (B) Detailaufnahme eines Dendriten mit Dornen-
fortsatz (Pfeil). (Mit freundlicher Genehmigung von M.
ist es wichtig zu wissen, wann und vor allem in Schweizer, Hamburg)
welchen Bereichen des Nervensystems bestimmte
Gene angeschaltet werden. So sind Entwicklungs-
biologen z. B. unter anderem daran interessiert he- das gebildete Protein über die Immunhistochemie
rauszufinden, welche Gene in welchen Stadien der nachweisen.
embryonalen und postnatalen (nach der Geburt) Ist man während seiner Arbeit auf ein neues
Entwicklung exprimiert (angeschaltet) werden. interessantes Gen gestoßen, lohnt es sich, auch die
Neben den verschiedenen Entwicklungsstadien verschiedenen open-source-Datenbanken zu durch-
kann die Genexpression aber auch auf ganz spezi- forsten, in denen die Expressionsprofile sehr vieler
fische Teilbereiche des Nervensystems beschränkt Gene bereits beschrieben sind (Links am Ende des
sein oder Gene werden nur nach ganz spezifischen Kapitels). Auch wenn das gewünschte Gen dort
Aktivierungszuständen abgelesen. So findet man ausführlich beschrieben ist, ist es ratsam eigene
viele aktivitätsregulierte Gene vermehrt im Vorder- Kontrollen durchzuführen, denn letztendlich sollte
hirn und dem für das Lernen wichtigen Hippocam- man vor allem an das glauben, was man selbst nach
pus, wo sie vor allem dann angeschaltet werden, bestem Wissen und Gewissen produziert hat.
wenn die Zellen im Zusammenhang mit Lernvor-
gängen aktiviert werden. Um die Genexpression
histologisch zu untersuchen, kann man entweder
die mRNA über die in situ-Hybridisierung oder
130 Kapitel 6 • Anatomische Untersuchung des Nervensystems

6.3.1 Immunhistochemie das passende Enzymsubstrat dazu, wird dieses in


ein farbliches Produkt umgesetzt, welches an der
Bei der Immunhistochemie handelt es sich um eine Stelle ausfällt, an der der Antikörper gebunden hat
Kombination aus Histochemie und immunologi- (.  Abb.  6.4). Für die Peroxidasereaktion wird als
schen Techniken. Primär werden damit Proteine Substrat am häufigsten Diaminobenzidin (DAB)
in Schnittpräparaten direkt über Antigen-Anti- eingesetzt, welches unter dem katalytischen Ein-
körper-Reaktionen, oder indirekt über antikör- fluss von Wasserstoffperoxid, welches dem Inku-
pergekoppelte Markierungsreaktionen nachgewie- bationsmedium ebenfalls zugesetzt wird, zu einem
sen. Die Immunhistochemie funktioniert in den schwarz-braunen Polymer oxidiert. Dank der Os-
Grundzügen wie der Nachweis von Proteinen über miophilie (Affinität zu Osmiumtetroxid) ist das
die Western-Blot-Analyse (7 Kap. 3.2.2). Allerdings Reaktionsprodukt auch elektronenmikroskopisch
kann man über die Immunhistochemie zusätzliche analysierbar. Für den Nachweis mit Hilfe der alka-
Informationen darüber erhalten, wo die Protei- lischen Phosphatase werden organische Phosphat-
6 ne genau lokalisiert sind. Immunhistochemische verbindungen als Substrat angeboten. Dabei spaltet
Nachweise sind sowohl an frischem, schockgefro- die alkalische Phosphatase Phosphat ab und die
renem Material als auch an perfundiertem Gewebe freigesetzte Verbindung reagiert zu einem farbigen
durchführbar. Bei frischem Gewebe besteht jedoch Endprodukt. Am häufigsten wird hier 5-Brom-4-
die Gefahr, dass Proteine im Gewebe etwas diffun- chlor-3-indoxylphosphat (BCIP) in Verbindung
dieren, wodurch die Information über die eigent- mit Nitroblau-Tetrazoliumchlorid (NBT) verwen-
liche Lokalistation der Proteine verfälscht werden det. Dabei wird BCIP zu 5-Brom-4-chlor-Indoxyl
kann. Darüber hinaus ist die Strukturerhaltung bei und Phosphat hydrolyisert. Das Indoxyl tautomeri-
weitem nicht so schön wie bei Material, welches siert zu einem Keton, welches dimerisiert und da-
perfundiert und am Vibratom geschnitten wurde. durch zum blauen Indigo wird. Bei diesem Vorgang
Für viele Anwendungen kann frisches Gewebe je- werden Protonen frei, die dann NBT reduzieren,
doch auch von Vorteil sein. Die Durchführung ist wodurch das purpurne Diformazan gebildet wird.
z.  B. sehr viel schneller, ein Punkt, der vor allem Die Reduktion des NBT führt zu einer Farbverstär-
für die Diagnostik wichtig ist. Darüber hinaus ist kung, welche in einer insgesamt dunkelvioletten
die Fixierung bei der Verarbeitung von frischem Färbung resultiert (. Abb. 6.3).
Gewebe nicht so stark, wodurch Antikörperbin- Liegt das nachzuweisende Protein jedoch in
dungsstellen weniger stark vernetzt werden (siehe sehr geringen Menge vor, oder sind die benutzten
auch unten). Frisches Gewebe wird beim Schnei- Primärantikörper nicht sensitiv genug, so kann
den direkt auf Objektträger aufgebracht und dort man das Signal verstärken, indem man einen Se-
auch gefärbt, während Vibratomschnitte durch ihre kundärantikörper, auch Brückenantikörper ge-
gute Fixierung frei schwimmend (free-floating) be- nannt, verwendet, der gegen die Spezies gerichtet
handelt werden können und erst später auf Objekt- ist, aus der der Primärantikörper stammt. Da im-
träger aufgezogen werden. mer mehrere Sekundärantikörper an den Primär-
Generell werden bei der Durchführung des antikörper binden, wird das Signal so verstärkt.
immunhistochemischen Nachweises die Schnitt- Möchte man das Signal noch weiter intensivieren,
präparate mit einem gegen das Protein gerichteten so werden die Sekundärantikörper meist mit Biotin
Antikörper, auch 1., oder Primärantikörper ge- (Vitamin H) gekoppelt. Biotin besitzt eine sehr star-
nannt (wichtige Informationen zum Thema Anti- ke Affinität zu Avidin (ein Glykoprotein aus dem
körper finden sich in  7  Kap.  3.1) inkubiert. Dieser Hühnerei), was in vielen biochemischen Verfahren
kann dann entweder direkt über gebundene Flu- ausgenutzt wird. Für die Immunhistochmie sind an
oreszenzmoleküle oder über einen enzymatischen das Avidin wiederum Peroxidasen oder alkalische
Nachweis detektiert werden (direkte Methode). Für Phosphatasen für den enzymatischen Nachweis ge-
den enzymatischen Nachweis werden die Antikör- bunden. Die Tatsache, dass jedes Avidinmolekül
per mit bestimmten Enzymen, meist Peroxidasen 4 Biotinmoleküle binden kann, hat man sich bei
oder alkalische Phosphatasen, gekoppelt. Gibt man der so genannten ABC-Methode (Avidin-Biotin-
6.3 • Nachweis und Lokalisation von Protein und mRNA im Nervensystem
131 6

A H2N NH2 DAB

H 2N NH2
H2O2
Peroxidase
2 H2O
N N
H2N NH2
N N

H2N NH2

H2N NH2
N N

O
B O P O
Cl Cl O Cl O
Br O Br H
Br N
H 3-
+ PO4
H
N Phosphatase N 2H N Br
H H H O Cl
BCIP Indigo
NO2 O2N

N N N N
NO2 O2N
+ +
N N N N
NBT
CH3O OCH3
N NH HN N
N N N N

CH3 O Formazan OCH3

. Abb. 6.3 Substrate für die Immunhistochemie. (A) Diaminobenzidin (DAB) wird durch Peroxidasen und Zugabe von
Wasserstoffperoxid in ein farbliches Produkt umgewandelt. (B) Von BCIP (5-Brom-4-chlor-3-indoxylphosphat) wird durch
alkalische Phophatasen ein Phosphat abgespalten und es entsteht der Farbstoff Indigo. Dabei werden Protonen frei die NBT
(Nitroblau-Tetrazoliumchlorid) reduzieren und es kommt durch die Bildung von Formazan zu einer Farbverstärkung

Peroxidase-Complex), die einen noch sensitive- Untersuchung, in der Substrate für Peroxidasen
ren Nachweis darstellt, zunutze gemacht. Wie der verwendet werden, zu unspezifischen Markie-
Name schon sagt, werden hier größere Komplexe rungen kommen. Dem kann man vorbeugen, in-
aus Avidin-Biotin-Peroxidase-Molekülen gebildet, dem man die Schnitte vor der Inkubation mit der
die dann für eine maximale Verstärkung des Sig- Primärantikörperlösung mit Wasserstoffperoxid
nals sorgen (. Abb. 6.4). (H2O2) inkubiert, wodurch die endogene Peroxida-
Da Peroxidasen auch endogen im Gewebe vor- seaktivität blockiert wird.
kommen, kann es bei der immunhistochemischen
132 Kapitel 6 • Anatomische Untersuchung des Nervensystems

. Abb. 6.4 Immunhistochemie
– direkter und indirekter Nach-
A B
weis. (A) Für den direkten Nach-
weis werden die Primärantikörper
direkt mit Fluoreszenzmolekülen
oder Enzymen gekoppelt. (B) Der
indirekte Nachweis ist sensitiver,
da mehrere Brückenantikörper an
einen Primärantikörper binden
können und so das Signal ver-
stärkt wird. (C) Am sensitivsten ist
die ABC-Methode. Hier werden
Komplexe aus Avidin und Biotin Schnittpräparat
gebildet, an die viele Peroxida- C
sen gekoppelt sind, wodurch Antikörper

6 das Signal noch weiter verstärkt


werden kann
Protein

farbliches Produkt
Enzymsubstrat
Enzym
Fluoreszenzmolekül

Biotin
Avidin

kKontrollen – oder traue keinem Antikörper!


Ein sehr wichtiges Thema in der Immunhisto- den gleichen Antikörper aus einer neuen Charge
chemie sind die Kontrollen. Leider halten viele nochmal. Leider funktioniert dieser meist auch
kommerziell erworbene Antikörper nicht, was sie nicht und man endet dann nach viel Zeitverlust
versprechen, und man tut gut daran, seine Expe- mit einem Gutschein der Firma, mit dem man sich
rimente ausreichend zu kontrollieren. Dabei sollte – juchhu! – einen neuen Antikörper kaufen kann.
man sowohl fehlende als auch unspezifische Signa- Der Grund, warum solche Firmen weiter Umsatz
le ausreichend überprüfen. machen, liegt nach Meinung vieler Wissenschaft-
Zur Kontrolle nicht vorhandener Signale ist es ler nur darin begründet, dass der Zeitaufwand der
am besten, wenn man bei der Durchführung der Antikörperrückgabe viel zu groß ist und man daher
Experimente Gewebe mitlaufen lässt, in dem das lieber gleich einen neuen Antikörper kauft. Eine
gesuchte Protein definitiv vorhanden ist. Zudem Firmenstrategie, die dringend überdacht werden
kann man mit Western-Blot-Analysen überprüfen, sollte!
ob eine Bande im Größenbereich des Zielproteins Hat man jedoch Glück (das kommt durchaus
detektiert werden kann. Obwohl der Hersteller auf auch vor) und kann im Western Blot das Protein
seiner Homepage Blots mit einer solchen Bande auf der richtigen Höhe nachweisen, findet aber
präsentiert, kann man diese in eigenen Experi- trotzdem kein Signal in den Schnittpräparaten, so
menten leider oft nicht nachweisen und man fragt wurden eventuell die Epitope, gegen die der Anti-
sich, wo der Hersteller die gezeigten Blots eigent- körper gerichtet ist, maskiert. Zu einer Maskierung
lich her hat. Die Rückgabe eines Antiköpers ist der Epitope kann es bei der Fixierung kommen.
generell möglich, jedoch meist mit einem größe- Hier wird das Gewebe über die Vernetzung der
ren Zeitaufwand verbunden. Der Experimentator Proteine stabilisiert, wodurch die Bindungsstellen
muss Beweisbilder liefern und viele »gut gemeinte« für den Antikörper unter Umständen mit vernetzt
Tipps des Herstellers über sich ergehen lassen. Ist werden und dann nicht mehr frei zugänglich sind.
das alles nicht erfolgreich, bekommt man zunächst Um Antikörperbindungsstellen wieder frei zu le-
6.3 • Nachweis und Lokalisation von Protein und mRNA im Nervensystem
133 6

. Tab. 6.1 Substrate für die Immunhistochmie

Substrat Enzym Farbe des Endproduktes

DAB (3,3-Diaminobenzidin) Peroxidase braun; mit Nickelverstär-


kung schwarz
AEC (3-Amino-9-Ethylcarbazol) Peroxidase rosenrot
CN (4-Chlor-1-Naphthol) Peroxidase blau
TMB (Tetramethylbenzidin) Peroxidase blau
Neufuchsin Alkalische Phosphatase rosarot
Naphthol-AS-MX-Phosphat Alkalische Phosphatase rot
BCIP (5-Brom-4-chlor-3-indoxylphosphat) mit NBT Alkalische Phosphatase dunkel-violett
(Nitroblau-Tetrazoliumchlorid

gen, kann man versuchen, die Schnitte stärker Um die Spezifität seines neu erworbenen Antikör-
durchlässig zu machen. Dieser Vorgang wird als pers zu testen, kann der Experimentator auch hier
Antigen-Retrieval, oder Antigen-Demaskierung eine Western-Blot-Analyse machen. Findet man
bezeichnet. Hierbei werden Kombinationen aus neben der gewünschten Bande noch zusätzliche
enzymatischem Verdau und Hitzebehandlung mit Banden im Blot, dann ist das ein starker Hinweis
Dampfhitze oder Mikrowellenöfen in so genannten darauf, dass der Antikörper auch noch an andere
Retrieval-Lösungen, meist Citratpuffer, oder TRIS- Proteine bindet. Um die Spezifität zu testen, kann
HCL (TRIS-EDTA), durchgeführt. Enzymatisch man den Primärantikörper auch mit großen Men-
kann das Gewebe mit Trypsin, Pepsin oder Pro- gen des zu detektierenden Proteins vorinkubieren.
teinase K behandelt werden. Möchte man das Ge- Es sollten dann keine Signale mehr im Schnitt zu
webe nur etwas permeabilisieren, also für die Anti- detektieren sein. Die beste Negativkontrolle ist je-
köper leichter durchgängig machen, kann man die doch auch hier Material von einem Organismus,
Schnitte mit Detergenzien wie Triton oder Tween der das gewünschte Protein nicht bildet, z. B. einer
behandeln. Detergenzien besitzen Eigenschaften, Knockout-Maus. Unspezifische Bindungen der an-
die den Lipiden der Membranen ähnlich sind und deren Komponenten kann man kontrollieren, in-
sie können die feste Membranstruktur etwas auf- dem man einige Schnitte nicht mit der Primäranti-
lösen, indem sie sich in die Membranen einlagern. körperlösung inkubiert. Findet man auch in diesen
Allerdings kann es auch vorkommen, dass der An- Schnitten ein Signal, dann kann man diese auf un-
tikörper nur an denaturierte Proteine, wie sie im spezifische Bindungen der weiteren Komponenten
Western Blot vorliegen, bindet und nicht an die zurückführen.
nativen Proteine im Schnittpräparat. Die Herstel- Generell hängen unspezifische Bindungen und
ler geben in ihren Produktdatenblättern meist auch nicht vorhandene Signale natürlich auch stark von
Information darüber, ob die Antikörper auch für der Konzentration des eingesetzten Antikörpers
die Histochemie getestet wurden, und der Experi- und der anderen Komponenten ab. Auch wenn die
mentator sollte zumindest keinen kaufen, der nicht Immunhistochemie ein vergleichsweise einfaches
»nachweislich« histologisch getestet wurde. Verfahren zum Nachweis von Proteinen in Schnitt-
Neben einer fehlenden Markierung können im- präparaten ist, kann man bei Etablierung eines neu-
munhistochemische Untersuchungen auch zu un- en Antikörpers einige Zeit mit der Optimierung des
spezifischen Signalen führen. Diese können durch Protokolls verbringen. Dabei spielen vor allem die
eine unspezifische Bindung der Primärantikörper, Stärke der Fixierung und die Konzentrationen der
aber auch der Sekundärantikörper oder der weite- eingesetzten Lösungen eine entscheidende Rolle.
ren eingesetzten Komponenten verursacht werden.
134 Kapitel 6 • Anatomische Untersuchung des Nervensystems

6.3.2 Enzymhistochemie wird das Gewebe permeabilisiert, um so das Ein-


dringen der Sonde ins Gewebe zu begünstigen.
Neben unspezifischen Markierungen, die man ver- Für die Hybridisierung selbst muss eine optima-
meiden möchte, kann die endogene Enzymaktivität le Hybridisierungstemperatur bestimmt werden,
jedoch auch genutzt werden, um bestimmte Enzy- welche stark vom G-C-Gehalt der Sonde bzw. der
me nachzuweisen. Hierzu werden die Schnitte mit mRNA abhängt. Zudem findet die Hybridisierung
einer Substanz inkubiert, die als Substrat für das der Sonde in einem extra dafür entwickelten Hy-
jeweilige Enzym fungiert. Ein farbliches Nebenpro- bridisierungspuffer statt. Dieser beinhaltet viele
dukt weist dann auf die Präsenz des Enzyms hin. Komponenten, die eine Bindung der Sonde an die
Auf diese Weise häufig nachgewiesene Enzyme mRNA begünstigt wie z. B. eine definierte Salzkon-
sind die Acetylcholinesterase, die Cytochromoxi- zentration und wasserbindende Substanzen, wie
dase und die NADPH-Diaphorase/Stickoxidsyn- Dextransulfat und Denhardts, welches wiederum
thethase. Der Nachweis eines bestimmten Enzyms aus Ficoll, Polyvinylpyrrolidon und BSA (Rinder-
6 kann helfen, bestimmte Zellen zu charakterisieren serumalbumin) besteht. Nach der Hybridisierung
(Acetylcholinesterase, NADPH-Diaphorase/Sti- werden die Schnitte mit Salzpuffern in sinkender
ckoxidsyntethase) oder spezifische Strukturen im Konzentration gewaschen (stringentes Waschen),
Gewebe selektiv darzustellen (Cytochromoxidase). wodurch unspezifisch gebundene Nucleinsäure-
moleküle abgelöst werden. Je nachdem, wie die
Sonde markiert wurde, kann sie über unterschied-
6.3.3 In situ-Hybridisierung liche Methoden detektiert werden (siehe unten).

(Es lohnt sich, für das bessere Verständnis dieses Ab- kDie Sonde
schnitts auch 7 Kap. 2 zu Rate zu ziehen) Für die Herstellung und Markierung der Sonde gibt
Möchte man nicht das Protein, sondern die es verschiedene Verfahren. Entweder man verwen-
mRNA in neuronalem Gewebe nachweisen, kommt det synthetisierte Oligonucleotide, an die bereits
die in situ-Hybridisierung zum Einsatz. Hier wer- Fluoreszenzmoleküle gekoppelt sind (solche kann
den die Gewebepropen (in situ) mit zur mRNA man kommerziell erwerben), Produkte einer PCR-
komplementären Nucleinsäuresträngen (Sonden) Reaktion, oder in vitro transkribierte Nucleinsäu-
inkubiert und es kommt zur Verschmelzung (Hy- reketten in die modifizierte Nucleotide zur Detek-
bridisierung) der mRNA und der Sonde. Die Nuc- tion bei der Synthese mit eingebaut werden. Die
leinsäuresonden sind so modifiziert, dass sie nach Sondenherstellung über die in vitro-Transkription
der Hybridisierung mit Hilfe verschiedener Detek- ist das Mittel der Wahl, wenn man eine bestimm-
tionsmethoden nachgewiesen werden können und te mRNA häufiger detektieren möchte, denn man
so die gewünschte mRNA sichtbar gemacht wird. kann, sobald man die cDNA des Zielgens in den
Grundsätzlich unterscheidet man zwischen einer Transkriptionsvektor kloniert hat, diesen immer
radioaktiven und einer nicht-radioaktiven in situ- wieder verwenden und somit schnell und relativ
Hybridisierung. kostengünstig immer wieder neue Sonden herstel-
In situ-Hybridisierungsexperimente werden len. Die cDNA kann man entweder aus Gewebe ge-
meist an Schnittpräparaten von frischem, gefrore- winnen, indem man die gesamte mRNA aus einer
nem Gewebe durchgeführt. Prinzipiell funktioniert Gewebepräparation über die Verwendung einer
sie aber auch an perfundiertem Gewebe. Für die Reversen Transkriptase in cDNA umschreibt und
Hybridisierung der Sonden müssen die Schnitte dann die gewünschte cDNA über eine PCR Reak-
vorbereitet werden. Zunächst werden sie fixiert, tion vervielfältigt, oder man besitzt bereits einen
dann werden die positiven Ladungen der Proteine Vektor, aus dem man die cDNA über einen Restrik-
im Schnittpräparat, über das Anhängen von Ace- tionsverdau ausschneiden kann und in den Tran-
tylresten (Acetylierung) abgeschirmt, da diese zu skriptionsvektor hinein kloniert. Darüber hinaus
unspezifischen Bindungen der negativ geladenen kann man, wie auch schon in 7 Kap. 2 beschrieben,
Nucleinsäuresonden führen können. Im Anschluss
6.3 • Nachweis und Lokalisation von Protein und mRNA im Nervensystem
135 6
für viele Gene die cDNA auch kommerziell erwer- entweder mit Fluoreszenzmolekülen (FISH- fluore-
ben. scent in situ hybridization) oder mit Enzymen wie
Bei der Sondenherstellung über die in vitro- der oben beschriebenen alkalischen Phosphatase
Transkription werden durch die Zugabe von RNA gekoppelt sind. Ein sehr sensitiver und hochaufge-
Polymerasen und Nucleotiden die gewünschten löster Nachweis kann über das von Perkin Elmer
RNA-Stränge in vitro synthetisiert. Dabei entsteht erhältliche TSA (tyramid signal amplification)-Sy-
je nach Transkriptionsrichtung entweder eine Sen- stem erreicht werden. Hier werden die gegen DIG
se- oder Antisense-Sonde. Die Antisense-Sonde gerichteten Antikörper mit einer Peroxidase ge-
bindet an die mRNA, die Sense-Sonde wird gerne koppelt. Die Peroxidase oxidiert die Tyramide, die
als Kontrolle für unspezifische Bindungen verwen- so aktiviert werden und kovalent an die im Schnitt
det. Damit man sowohl Sense- als auch Antisense- vorliegenden Proteine binden. An die Tyramide
Sonden von einem Transkriptionsvektor syntheti- sind wiederum Fluorenszenzmoleküle gekoppelt,
sieren kann, muss der Vektor entweder auf der 5′ die dann mit Hilfe eines Fluoreszenzmikroskops
oder auf der 3′ Seite der cDNA geschnitten wer- nachgewiesen werden können. Die Auflösung ist
den, und es muss 2 Startpunkte für 2 unterschied- mit diesem System so gut, dass man gerade tran-
liche Polymerasen geben, einen am 5′ und einen skribierte mRNA im Nucleus von mRNA, die be-
am 3′Ende (.  Abb.  6.6). Je nach Nachweis werden reits aus dem Zellkern hinaus geschleust wurde, un-
in die Sonde entweder radioaktiv markierte Nuce- terscheiden kann. Dies hat zur Etablierung der so
lotide (meist mit 35S markierte UTPs) oder Digo- genannten cat-FISH (fluorescent in situ hybridiza-
xiginin-markierte UTPs eingebaut. Der Nachweis tion with cellular and temporal resolution)-Methode
der radioaktiven Sonde findet über das Auflegen geführt, mit der man eine räumlich und zeitlich
eines Röntgenfilms auf die Schnitte statt. Dieser aufgelöste Aktivierung neuronaler Netze nachwei-
wird nach einer optimalen (muss man ermitteln) sen kann (7 Kap. 6.4.4 ).
Expositionszeit entwickelt. Bereiche, in denen die Neben der Detektion der mRNA im Schnittge-
Sonde gebunden hat, erscheinen auf den Filmen webe kann man die Fluoreszenz-in situ-Hybridisie-
geschwärzt. Die radioaktive in situ-Hybridisierung rung (FISH) auch einsetzten, um die Lokalistation
ist relativ schnell durchführbar und liefert eine sehr von mRNAs in primären neuronalen Zellen nach-
schöne Übersicht über die Bereiche, in denen eine zuweisen, oder über eine DNA-DNA-Hybridisie-
bestimmt mRNA vorliegt. Zudem ist das radioak- rung spezifische Genabschnitte auf Chomosomen
tive Signal proportional zur Transkriptmenge und sichtbar zu machen.
über die Verwendung von Standards definierter Um Zellen, die bestimmte Gene exprimieren,
mRNA-Mengen kann eine quantitative Aussage ge- näher zu bestimmen, können auch verschiedene
macht werden. Allerdings bietet sie in der norma- Nachweismethoden kombiniert werden. Man kann
len Anwendung keine zelluläre Auflösung. Möchte z. B. über Fluoreszenzdoppelfärbungen sowohl das
man eine bessere Auflösung erreichen, kann man Zielprotein als auch zellcharakteristische andere
die radioaktiv markierten Schnitte in eine Filme- Proteine nachweisen. Man kann die Fluoreszenz-
mulsionslösung eintauchen (dippen) und es müs- in situ-Hybridisierung mit einem immunhistoche-
sen dann die Schnitte selbst entwickelt werden. mischen Nachweis kombinieren oder die Lokalisa-
Über dieses Verfahren kann man eine zelluläre tion der nachgewiesenen Proteine im Schnitt über
Auflösung über gebildete Silberpartikel, die direkt eine Übersichtsfärbung, wie der Nissl-Färbung,
auf dem Schnitt sichtbar werden, erreichen. Möchte näher charakterisieren. Generell gilt dabei, dass
man oder darf man nicht radioaktiv arbeiten, oder je mehr unterschiedliche Verfahren kombiniert
möchte man eine noch bessere zelluläre Auflösung werden sollen, desto mehr Parameter müssen op-
erreichen, kann man Digoxiginin (DIG) markierte timiert werden, und desto länger kann die Etablie-
UTPs verwenden und diese über ein immunhisto- rung einer solchen Methode dauern.
chemisches Verfahren (siehe oben) mit Hilfe von
Antikörpern nachweisen, die gegen DIG gerichtet
sind. Hier kommen Antikörper zum Einsatz, die
136 Kapitel 6 • Anatomische Untersuchung des Nervensystems

kArbeiten mit RNA!! A


Bei der Durchführung der in situ-Hybridisierung
muss man darauf achten, dass die überall vorkom-
menden RNasen weder die Sonden noch die im
Präparat zu detektierende mRNA abbauen. Daher
sollte nur sehr sauberes Wasser verwendet werden,
alle zu benutzenden Glaswaren sollten vorher ste-
rilisiert werden und auch alle Arbeitsflächen sollten
RNase frei sein. Da der Experimentator selbst auch
einen Quelle für RNasen sein kann, sollten Sie stets
mit Handschuhen arbeiten.

B
6 6.4 Nachweis neuronaler Aktivität

In 7 Kap. 10 können wir lernen, wie man neuronale


Aktivität bei Menschen mit verschiedenen nicht-
invasiven Imaging-Verfahren messen kann. In die-
sem Kapitel möchten wir kurz darauf eingehen, wie
komplexe neuronale Aktivierungsmuster im Tier-
modell entweder über den Nachweis bestimmter
Markerproteine im Gewebe oder über die Verwen-
dung radioaktiv markierter Glukose untersucht
werden kann.
. Abb. 6.5 Immunhistochemie und in situ-Hybridisierung
im Vergleich. Gezeigt sind coronale Schnitte des Gyrus
Dentatus des Hippocampus , in denen das Arg3.1 Protein und
6.4.1 Aktivitätsregulierte Gene die Arg3.1 mRNA nach synaptischer Aktivität nachgewiesen
wurden. (A) Mit Hilfe der Immunhistochemie kann man das
Es ist bekannt, dass verschiedene Proteine immer Protein mit zellulärer Auflösung nachweisen. (B) Bei der
nach Aktivierung einer Nervenzelle gebildet wer- radioaktiven in situ-Hybridisierung kann die mRNA in be-
stimmten Hirnregionen nachgewiesen werden. Das Signal ist
den. Das c-fos Gen gehört zu dieser Gruppe und
diffus und erreicht keine zelluläre Auflösung. Die radioaktive
wurde bereits in vielen Studien benutzt, um die Ak- in situ-Hybridisierung bietet jedoch einen guten Überblick
tivierung vieler Neurone eines neuronalen Netzes über die Genexpression im gesamten Gehirn und die Intensi-
sichtbar zu machen, die z.  B. nach verschiedenen tät des Signals ist proportional zur Transkriptmenge
sensorischen Stimulationen oder in verschiedenen
Lernsituationen aktiviert werden. C-fos ist ein zel- te stereologische Verfahren, die eine dreidimensio-
luläres Protoonkogen der Gruppe der immediate- nale Interpretation der planaren Schnitte erlauben
early genes, welches direkt nach neuronaler Akti- und über die die Zahl der aktivierten Neurone in
vierung gebildet wird und als Transkriptionsfaktor den verwendeten Schnittpräparaten verlässlich
die Expression weiterer Gene reguliert. Der im- bestimmt werden können. Neben dem c-fos Pro-
munhistochemische Nachweis von c-fos ist sehr tein, das generell eher als Marker neuronaler Ak-
gut etabliert und daher sehr einfach durchführbar. tivität angesehen wird, kann man auch Marker
Das c-fos Protein verbleibt im Zellkern und man für plastische Veränderungen verwenden, die mit
kann den Zellkern der aktivierten Neurone sehr gut neuronalen Lernprozessen, aber auch mit neurolo-
visualisieren (. Abb. 6.7). Um ein verlässliches Bild gischen Erkrankungen in Zusammenhang stehen.
der gesamten Population aktivierter Neurone einer Als gutes Markerprotein für plastische Verände-
bestimmten Hirnregion oder gar des ganzen Ge- rungen hat sich mittlerweile das aktivitätsregulierte
hirns zu erhalten, benötigt man jedoch spezialisier- Protein Arg 3.1 (auch Arc genannt) etabliert. Auch
6.4 • Nachweis neuronaler Aktivität
137 6

A cDNA

NotI SalI

Sp6 Polymerase T7 Polymerase

NotI SalI

Restriktion

T7 Sp6

cDNA cDNA
NotI SalI SalI NotI

Antisense-Sonde Sense-Sonde
Sense

B Antisense
NotI SalI

5’ 3’
Sp6 5’ 3’ T7

NotI
RNA-Ploymerasen synthetisieren
in 5’-3’ Richtung

Antisense-Sonde T7
3’ 5’
Sense
5’ 3’
Antisense
3’ 5’

. Abb. 6.6 Herstellung einer mRNA-Sonde für die in situ-Hybridisierung mit Hilfe der in vitro-Transkription. (A) Für die Her-
stellung von Sense- und Antisense-Sonden muss der Expressionsvektor auf der 5′ und der 3′ Seite der klonierten cDNA mit
Hilfe von Restriktionsenzymen geschnitten werden (hier SalI und NotI). Zudem finden sich auf beiden Seiten der cDNA Start-
punkte für zwei unterschiedliche RNA-Polymerasen (hier SP6 und T7). (B) Die Antisense-Sonde bindet an die komplementäre
Sense-mRNA und wird durch Ablesen des Sense-Stranges der cDNA gebildet
138 Kapitel 6 • Anatomische Untersuchung des Nervensystems

A B

. Abb. 6.7 Nachweis neuronaler Aktivität über das c-fos-Protein und radioaktiv markierte Glukose. (A) C-fos ist ein zellulä-
rer Marker für neuronale Aktivierung. Das c-fos Protein kann mit Hilfe der Immunhistochemie im Zellkern aktivierter Neurone
nachgewiesen werden. Es können somit einzelne aktivierte Zellen sichtbar gemacht werden. (B) Bei der Autoradiographie
wird radioaktiv markierte Glucose nachgewiesen, die von aktiven Nervenzellen aufgenommen wurde und vermehrt an akti-
vierten Synapsen akkumuliert. Es können aktivierte Hirnareale ohne zelluläre Auflösung nachgewiesen werden

wenn Markerproteine viele Informationen über die Methode auch die 2-Deoxyglucose-Methode
den Aktivitätszustand und die ablaufenden Verän- (2-DG), weil dabei radioaktiv markierte Gluco-
derungen des Nervensystems liefern können, sollte se von aktiven Nervenzellen aufgenommen wird,
man auch die Limitierung solcher Nachweise im aber wegen der fehlenden Hydroxylgruppe nicht
Hinterkopf haben. So weiß man z. B. nicht mit Si- weiter verstoffwechselt werden kann und sich
cherheit, ob die Markerproteine tatsächlich in allen deshalb in aktivierten Nervenzellen und dort vor
aktivierten Neuronen angeschaltet werden oder ob allem an aktivierten Synapsen anhäuft. Im Gegen-
alle aktivierten Neurone tatsächlich das Makerpro- satz zu den PET-Untersuchungen, bei denen die
tein exprimieren. Zudem ist die zelluläre Funktion Radionucleotide und damit die Aktivierung über
der beiden genannten Markerproteine noch lange einen PET-Scanner sichtbar gemacht werden kön-
nicht in allen Details geklärt. nen, müssen die Gehirne für die Autoradiographie
entnommen und mit Hilfe des Gefriermikrotoms
geschnitten werden (Schnittdicke 20–40 µm). Auf
6.4.2 Autoradiographie die Schnitte werden Röntgenfilme gelegt und man
wertet wie bei den radioaktiven in situ-Hybridisie-
Bei der Autoradiographie handelt es sich um rungsexperimenten anschließend die Schwärzung
eine Darstellung der neuronalen Aktivität, die der Filme aus (. Abb.  6.7). Um quantitative Da-
der Positronenemissionstomographie (PET; si- ten zu erhalten, muss man bei der 2-DG-Methode
ehe  7  Kap.  10), die als funktionelles bildgebendes 14C-Standards definierter Konzentration mit expo-

Verfahren an Menschen angewendet wird, sehr nieren, um hinterher den Grad der Schwärzung in
ähnlich ist. Genau wie bei PET-Untersuchungen, Radioaktivität umrechnen zu können. Die 2-DG-
die radioaktiv markierte 18F-Desoxyglucose als Methode ist eine vergleichsweise alte (70er Jahre)
nachzuweisende Radionucleotide benutzen, wird und einfach durchzuführende Methode, mit der
hier mit 14C markierte Glucose injiziert. Man nennt neuronale Aktivierungsmuster untersucht werden
6.4 • Nachweis neuronaler Aktivität
139 6
können. Allerdings benötigt man ein Isotopenla- bestimmte Reportergene unter der Kontrolle akti-
bor, in dem man radioaktiv arbeiten darf und man vitätsregulierter Promotoren, wie z.  B. dem c-fos
muss aufgrund der sehr langen Halbwertszeit von oder dem Arg 3.1 Promotor, bilden können. Als Re-
14C (5  730 Jahr) aufpassen, dass man sehr sauber porter wird hier meist GFP (green fluorescent pro-
arbeitet und weder sich noch andere gefährdet. tein) eingesetzt, welches durch seine fluoreszenten
14C besitzt zwar eine sehr geringe Strahlung und Eigenschaften im Schnittpräparat ohne weitere hi-
kommt auch natürlich in der Atmosphäre vor stologische Methoden mit Hilfe der Fluoreszenz-
(Grundlage für die Altersbestimmung über die mikroskopie nachgewiesen werden kann. Neben
Radiokarbonmethode), allerdings macht gerade der fluoreszenzmikroskopischen Auswertung der
diese sehr geringe Strahlung einen Nachweis über Schnittpräparate werden diese Mäuse auch be-
die normalen im Labor verwendeten Geigerzähler nutzt, um in vivo, also im lebenden Organismus,
schwierig, und man kann daher Kontaminationen die Aktivierung von Neuronenpopulationen über
schlechter detektieren. Darüber hinaus kann die einen längeren Zeitraum mit Hilfe der konfokalen
Auswertung der radioaktiven Filme sehr Zeit in- Mikroskopie zu untersuchen. Da es sich bei den
tensiv werden und es empfiehlt sich, jemand mit GFP-Reportermäusen meist um transgene Tiere
Programmierkenntnissen zu Rate zu ziehen, um handelt und man nicht genau weiß, in welchem
die Analyse soweit wie möglich zu automatisieren. Teil des Genoms die Fremd-DNA integriert wird
In den letzten Jahren wurden zunehmend auch (7 Kap. 8.3), muss man, bevor man diese Mäuse für
PET- und MRI-Untersuchungen (7 Kap. 10) an Na- Imaging-Experimente verwendet, auf jeden Fall
gern durchgeführt. Solche Untersuchungen haben prüfen, ob das Reportergen in normalen physiolo-
gegenüber der Autoradiographie den Vorteil, dass gischen Mengen und nur nach neuronaler Aktivie-
man an einem Tier mehrere Untersuchungen ma- rung gebildet wird.
chen kann, z.  B vor und nach einer Behandlung,
wodurch eine optimale interne Kontrolle gewähr-
leistet wird. Da es in Deutschland immer noch 6.4.4 Cat-FISH
sehr wenige von diesen Geräten gibt, die für Na-
ger verwendet werden können, und diese Unter- Die Cat-FISH (fluorescent in situ-hybridization with
suchungen vergleichsweise teuer sind, werden sie cellular and temporal resolution)-Methode wurde
wohl in naher Zukunft nicht als Standardverfahren etabliert, um eine räumlich und zeitlich aufgelöste
zur Untersuchung neuronaler Aktivität im Tiermo- Aktivierung neuronaler Netze mit Hilfe der Fluo-
dell verwendet werden. Darüber hinaus besteht ein reszenz-in-situ-Hybridisierung und der Analyse
Nachteil dieser Methoden darin, dass man Mäusen über die konfokale Mikroskopie nachzuweisen.
und Ratten nicht sagen kann, dass sie für eine be- John Guzowski und Kollegen haben diese Metho-
stimmte Zeit absolut stillhalten sollen, damit der de initial verwendet, um nach Verhaltensexperi-
Scan gelingt, sondern sie in den meisten Fällen für menten Gruppen von Neuronen nachzuweisen, die
die Untersuchungen narkotisieren muss, wodurch durch die Erkundung unterschiedlicher räumlicher
die neuronalen Aktivitätsmuster stark beeinträch- Umgebungen aktiviert wurden (Guzowski, 1999).
tigt werden können. Zudem ist die Auflösung bei Grundlegend dabei war das Wissen, dass die nu-
den Scanverfahren (mm) wesentlich geringer als cleäre mRNA eines durch neuronale Aktivität an-
bei der Anwendung der 2-DG-Methode (µm). geschalteten Gens (hier Arg 3.1) bereits nach 5 Mi-
nuten nachweisbar ist, während die mRNA im Cy-
toplasma erst nach 30 Minuten detektiert werden
6.4.3 Reportermäuse kann. Setzt man nun eine Ratte oder eine Maus für
5 Minuten in eine bestimmte Umgebung und lässt
Die Möglichkeit, Mäuse gentechnisch zu verändern sie nach einer Pause von 30 Minuten eine ande-
und so neue Gene in das Mausgenom einzufüh- re Umgebung 5 Minuten lang erforschen, so kann
ren (7  Kap.  8) hat unter anderem zur Etablierung man hinterher die gesamte Population an Neu-
von so genannten Reportermäusen geführt, die ronen detektieren, die durch die Exploration der
140 Kapitel 6 • Anatomische Untersuchung des Nervensystems

. Abb. 6.8 Cat-Fish (fluorescent


A 5 min Exploration 5 min Exploration
in situ-hybridization with cellular
and temporal resolution). Mit Hilfe
von cat-FISH kann man aktivierte
Neuronenpopulationen mit 30 min
zeitlicher Auflösung untersuchen
(A) Mäuse oder Ratten werden
im Abstand von 30 Minuten mit
zwei verschiedenen räumlichen
Umgebungen konfrontiert. (B)
Schematische Darstellung der
neuronalen Signale. Nach 5
Minuten liegt die mRNA nur im B
Zellkern vor, nach 30 Minuten
nur im Cytoplasma. Wurde ein

6 Neuron durch die Exploration in


beiden Umgebungen aktiviert, so
kann man sowohl ein nucleäres
als auch ein cytoplasmatisches cytoplasmatisch cytoplasmatisch intranucleär
Signal nachweisen (C) Beispielbil- und intranucleär
der für ein ein cytoplasmatisches
und ein nucleäres Signal

unterschiedlichen Umgebungen aktiviert wurde. von Neuronenpopulationen untersuchen kann.


Alle Neurone, die durch Umgebung 1 aktiviert wur- Da die neuronale Informationsverarbeitung je-
den, zeigen ein cytoplasmatisches Signal, während doch nicht nur durch die Eigenschaften einzelner
alle Neurone, die durch Umgebung 2 angeschaltet Neurone bestimmt wird, sondern auch durch die
wurden, ein nucleäres Signal zeigen. Neuronenpo- Verbindungen, die Nervenzellen innerhalb eines
pulationen, die durch beide Umgebungen aktiviert neuronalen Netzes miteinander haben, ist es un-
wurden, zeigen sowohl ein cytoplasmatisches, als abdingbar, die Verbindungen zwischen Nervenzel-
auch ein nucleäres Signal (. Abb. 6.8). Für die Aus- len zu untersuchen, um die Funktion des Nerven-
wertung der Schnittpräparate müssen hochaufge- systems besser zu verstehen. Woher Nervenzellen
löste, konfokale Bilder aufgenommen werden, und ihre Informationen bekommen und wohin sie diese
die quantitative Auswertung dieser Bilder kann weiterreichen, kann mit Hilfe von Tracing-Studien
leider ohne Probleme mehrere Diplomarbeiten in untersucht werden. Für Tracing-Experimente wer-
Anspruch nehmen. den Substanzen entweder direkt in die Zelle inji-
ziert oder in der Nähe der Zellen appliziert, von
wo sie über aktive Prozesse von den Nervenzellen
6.5 Tracing-Verbindungsstudien aufgenommen werden. In der Zelle angelangt, wer-
den die Tracing-Substanzen entweder retrograd in
Bisher wurden in diesem Kapitel Methoden be- Richtung Zellkörper oder anterograd in Richtung
sprochen, mit denen man die Morphologie und der Axonterminalien transportiert (.  Abb.  6.9).
die Lokalisation von Neuronentypen, das Gen/ Manche Substanzen können auch in beide Rich-
Protein-Expressionsprofil oder die Aktivierung tungen transportiert werden und markieren da-
6.5 • Tracing-Verbindungsstudien
141 6
A werden durch das Herstellen der Gewebeschnitte
weitreichende Projektionen meist unterbrochen.
Oft werden Tracing und Elektrophysiologie auch
kombiniert. Man kann z. B. nach der elektrophysi-
anterograd ologischen Messung einer Zelle eine Substanz über
die Messelektrode injizieren und die untersuchte
Zelle über die Zellmorphologie und ihre Verbin-
retrograd dungen zu anderen Zellen im Anschluss näher
charakterisieren. Die für die Tracing-Studien ver-
wendeten Substanzen haben entweder fluoreszente
Eigenschaften und können in Schnittpräparaten di-
B rekt nachgewiesen werden, oder sie sind an Peroxi-
dasen gekoppelt und werden über einen Enzymre-
aktion nachgewiesen (7  Kap.  6.3.1 ). Eine Übersicht
über einige häufiger verwendete Tracer-Substanzen
findet sich in (. Tab. 6.2).
Da man meist nicht nur die nächsten Nachbarn
eines Neurons identifizieren, sondern gegebenen-
falls auch die Verbindungen über mehrere Schalt-
stellen und ganzer neuronaler Netze untersuchen
möchte, benötigt man Tracer, die von einer Zel-
le an die nächste weitergeben werden und somit
. Abb. 6.9 Nachweis neuronaler Verbindungen über
Tracing-Methoden. (A) Für den Nachweis neuronaler Ver- den synaptischen Spalt überwinden können. Hier
bindungen werden Tracing-Substanzen entweder in die kommen entweder tritzierte, also mit Tritzium ge-
Zelle injiziert oder in der Nähe der Zelle appliziert. Die koppelte Aminosäuren zum Einsatz, die dann mit
Substanzen werden von der Zelle aktiv aufgenommen und Hilfe der Autoradiographie nachgewiesen werden,
entweder anterograd in Richtung Axonterminalien oder
oder Pflanzenlektine, die für den enzymatischen
retrograd Richtung Zellkörper transportiert. (B) Einige Tra-
cing-Substanzen können den synaptischen Spalt überwin- Nachweis an Peroxidasen gekoppelt sind. Darüber
den und werden über mehrere neuronale Schaltstellen über hinaus wurden in den letzten Jahren virale Systeme
weite Bereiche im Gehirn transportiert. Hier werden durch etabliert, die dazu in der Lage sind, in einer Zelle
den anterograden Transport die afferenten und durch den infektiöse Partikel zu bilden, welche dann wiede-
retrograden Transport die efferenten Projektionen markiert
rum Nachbarzellen befallen können. Meist werden
Herpes- oder Rabiesviren verwendet, die je nach
durch die gesamte Zelle vom Dendritenbaum bis Spezies in anterograder oder retrograder Richtung
zum axonalen Endknöpfchen. Meist werden die wandern. Über die virale Infektion kommt es zur
Substanzen in vivo in das Gehirn von lebenden Expression von fluoreszierenden Proteinen und
Tieren injiziert. Nach einigen Tagen kann das Ge- man kann so verbundene Neuronenpopulationen
webe dann entnommen und die Tracer nachgewie- in Schnittpräparaten schnell identifizieren. Da es
sen werden. Neben in vivo-Injektionen kann man allerdings auch passieren kann, dass benachbarte
auch dickere Gewebeschnitte, wie sie z.  B für die nicht-synaptisch verbundene Zellen infiziert wer-
Elektrophysiologie verwendet werden (7  Kap.  5), den, versucht man über verschiedene gentech-
anfertigen, um die neuronalen Verknüpfungen zu nische Manipulationen das virale Tracing soweit
untersuchen. Da die physiologischen Prozesse in zu verbessern, dass es nur in wirklich verbundenen
einem Slice nicht so lange aufrechterhalten werden Zellen zu Expression der fluoreszenten Proteine
können und der Transport der applizierten Sub- kommt. Neben dem unspezifischen Befall benach-
stanzen einige Zeit in Anspruch nimmt, können barter Nervenzellen kann auch die virale Infek-
mit solchen Präparaten jedoch keine sehr weitrei- tion selbst ein Problem darstellen, denn es kann
chenden Projektionen untersucht werden. Zudem zum Absterben der Nervenzellen und zur Infekti-
142 Kapitel 6 • Anatomische Untersuchung des Nervensystems

. Tab. 6.2 Übersicht über häufig verwendete Tracer-


wickelte GRASP-Technologie (GFP reconstitution
Substanzen across synpatic partners), die der Bimolekularen
Fluoreszenz-Komplementation (BIFC; 7 Kap. 3.4.7 )
Tracer Richtung zur Untersuchung der Proteininteraktion sehr äh-
Biocytin retrograd und anterograd
nelt. Bei GRASP nutzt man zwei Teilfragmente des
grünfluoreszierenden GFP's, welche in zwei mitein-
Lucifer Yellow retrograd und anterograd
ander verbundene Zellen transfiziert werden. Über
DiI, DiO retrograd und anterograd
verschiedene genetische Modifikationen kann man
Biotinylierte Dextrana- retrograd und anterograd
erreichen, dass die Teilproteine an die Synapsen
mine (BDA)
transportiert werden und dort in den synaptischen
Meerrettichperoxidase retrograd und anterograd
Spalt ragen. Da der synaptische Spalt nur 100 nm
Weizenkeim-Agglutinin retrograd und antero-
breit ist, kommen die beiden Teilfragmente in un-
(WGA) grad;
mittelbare Nähe und können so gemeinsam das
6 Phaseolus vulgaris- leu-
transsynaptisch
anterograd
fluoreszierende Protein bilden und die synaptische
coagglutinin (PHA-L) Verbindung zwischen zwei Neuronen visualisieren.
Fluoreszente Mikro- retrograd Auch wenn dieses System bisher nur für C. elegans
partikel etabliert ist, hat es großes Potenzial, und es ist nur
Fluoro-Gold retrograd einen Frage der Zeit, bis dieses Verfahren auch er-
Diamidino Yellow retrograd folgreich für Verbindungsstudien am Säugergehirn
Fast blue retrograd
eingesetzt werden kann.
Cholera Toxin, Unterein- retrograd
heit B (CTB)
Tetanus Toxin, Fragment transsynaptisch
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http://www.hms.harvard.edu/research/brain/
http://www.brainnav.com/home

on des zu untersuchenden Organismus kommen.


Stereology:
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verbessert werden, dass sie weniger pathogen sind, J Chem Neuroanat 20, 115–126.
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bunden sind. Ein vielversprechender Ansatz, der Osten P (2009) Fluorescent Arc/Arg 3.1 indicator mice:
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