125 6

Anatomische Untersuchung
des Nervensystems
Claudia Mahlke

6.1 Gewebeaufbereitung – 126

6.1.1 Präparation, Fixierung und Einbettung – 126
6.1.2 Schneidetechniken – 127

6.2 Übersichtsfärbungen – 127

6.3 Nachweis und Lokalisation von Protein und mRNA im
Nervensystem – 129
6.3.1 Immunhistochemie – 130
6.3.2 Enzymhistochemie – 134
6.3.3 In situ-Hybridisierung – 134

6.4 Nachweis neuronaler Aktivität – 136

6.4.1 Aktivitätsregulierte Gene – 136
6.4.2 Autoradiographie – 138
6.4.3 Reportermäuse – 139
6.4.4 Cat-FISH – 139

6.5 Tracing-Verbindungsstudien – 140

Literatur und World-Wide-Web-Links – 142

G. Hermey et al., Der Experimentator: Neurowissenschaften,

DOI 10.1007/978-3-8274-2369-6_6, © Spektrum Akademischer Verlag Heidelberg 2010
 126 Kapitel 6 • Anatomische Untersuchung des Nervensystems
Die Grundbausteine komplexer neuronaler Struk-
turen bilden Nerven- und Gliazellen. Obwohl das
Wissen über diese kleinsten Einheiten des Nerven-
systems in den letzten Jahrzehnten exponentiell
gewachsen ist, sind wir weit davon entfernt die
komplizierten Mechanismen und Funktionen die-
ser Zellen in ihrer Gesamtheit zu verstehen. Noch
viel weniger wissen wir, wie die vielen Zellen genau
verknüpft sind und wie sie zusammenspielen, um
Informationen zu verarbeiten, zu speichern und
weiterzugeben. Auch wenn anatomische Untersu-
chungen eine vergleichsweise alte Technik darstel-
len, sind sie immer noch überaus wertvoll, da sie
6 uns über die detallierte Analyse der Struktur Infor-
mationen über das Zusammenspiel und die Verbin-
dungen der einzelnen Bausteine geben können. Die
konsequente Weiterentwicklung dieser Methoden
erlaubt heute eine noch feinere und detailliertere
Untersuchung neuronaler Verschaltungen und
bietet zusammen mit dem histologischen Nach-
weis von Proteinen und Gentranskripten direkt im
Gewebe ein komplett neues Spektrum der funktio-
nellen Analyse komplexer neuronaler Strukturen.
Neben den vielen praktischen Aspekten der ana-
tomischen Analyse ist das Gehirn auch ein überaus
ästhetisches Organ und man muss schon »stump-
fen Sinnes«1 sein, um sich nicht an der Schönheit
zu erfreuen, die sich dem Auge bietet, wenn man
Präparate des Gehirns unter dem Mikroskop be-
trachten darf.
6.1 Gewebeaufbereitung
6.1.1 Präparation, Fixierung und
Einbettung
Da Nervengewebe sehr weich und verletzlich ist
und zudem Abbauprozesse nach Gewebeentnah-
me sehr schnell einsetzen, ist es wichtig, das Ge-
webe schnell zu präparieren und nach der Präpa-
ration sofort zu fixieren. Durch die Fixation kann
die Zersetzung des Gewebes aufgehalten werden.
Proteine werden denaturiert und vernetzt und Li-
pide werden stabilisiert, wodurch Strukturen bes-
1 Zitat aus Kükenthal’s Leitfaden für das Zoologische
Praktikum, 19 Auflage, 1984
ser erhalten bleiben und Färbungen der Gewebe
deutlicher werden. Das am weitesten verbreitete
Fixierungsmittel ist Formaldehyd. Formaldehyde
besitzen die Eigenschaft, dass sie Proteine über so
genannte Methylenbrücken vernetzen. Die Ver-
netzung ist kein sehr schneller Prozess und die
Anzahl an Methylenbrücken nimmt über die Zeit
zu. Man geht jedoch davon aus, dass die Bindung
von Formaldehyd an Proteine nach ca. 24 h abge-
schlossen ist. Häufig findet man Formaldehyd im
Labor als Polymer, welches als Paraformaldehyd
bekannt ist. Da man für die Fixierung Monomere
benötigt, muss das polymere Paraformaldehyd-
pulver vor der Anwendung gelöst, also in Mono-
mere gespalten werden. Die Spaltung findet dabei
sehr viel schneller in alkalischem Milieu statt und
wird zudem über Erwärmung der Paraformalde-
hydlösung auf 60°C beschleunigt. Häufig findet
man in Protokollen auch die Anweisung, das Ge-
webe mit Formalin zu fixieren. Formalin ist eine
Lösung monomerer Formaldehyde, die durch die
Zugabe von Methanol daran gehindert werden zu
polymerisieren und auszufallen. Benötigt man eine
stärkere Fixierung kann man auch Glutaraldehyd
verwenden, welches pro Molekül zwei Aldehyd-
gruppen besitzt, die über drei variable Methylen-
brücken verbunden sind. Die Glutaraldehydfixie-
rung wird häufig bei elektronenmikroskopischen
Untersuchungen angewendet oder zum Nachweis
von löslichen Aminosäuren wie Glutamat, GABA
oder Glycin. Oft werden auch Mischungen aus den
verschiedenen Aldehyden eingesetzt. Je nach Ge-
webegröße kann die Fixierung durch Einlegen in
das Fixativ oder Fixierung der Organe über den
Blutkreislauf (Perfusion) erfolgen. Bei größeren
Organen, wie dem Gehirn, empfiehlt sich die Fi-
xierung über den Blutkreislauf, da ansonsten das
Fixativ von außen nach innen eindringen muss
und es somit zu einer ungleichmäßigen Fixierung
des Gewebes, mit stärker fixierten Bereichen an
der Oberfläche und weniger stark fixierten Berei-
chen im Inneren, kommen kann. Die Fixierung
mit Formaldehyden kann jedoch auch Nachteile
haben. Viele Proteine verlieren durch die Fixierung
ihre antigenen Eigenschaften, da die für die Anti-
körperbindung entscheidenden Proteinbereiche
unter Umständen vernetzt oder maskiert wurden.
In diesem Fall kann man versuchen, entweder eine
6.2 • Übersichtsfärbungen
etwas »leichtere« Fixierung vorzunehmen oder das
Gewebe nach der Fixierung so behandeln, dass
die Bindungsstellen wieder frei werden, ein Vor-
gang der als Antigen-Demaskierung bezeichnet
wird und auf den in  7  Kap.  6.3 nochmal im De-
tail eingegangen wird. Neben der Fixierung mit
Formaldehyden kann man eine Alkoholfixierung
vornehmen oder das Gewebe »frisch«, also gleich
nach der Präparation schockgefrieren. Alkohole,
vor allem Ethanol fixieren das Gewebe über den
Entzug von Wasser und maskieren die Antigenbin-
dungsstellen dementsprechend weniger. Allerdings
schrumpft das Gewebe durch den Wasserentzug
und Alkohole können zudem das Gewebe weniger
gut durchdringen, daher werden sie häufiger für die
Fixierung von bereits geschnittenem Material ein-
gesetzt. Auch wenn für die meisten Standardme-
thoden etablierte Fixierungsprotokolle existieren,
muss man für viele neue Methoden erst einmal die
optimale Fixierung ermitteln. Vor allem für den
immunhistochemischen Nachweis von Proteinen
über Antikörperbindung muss die Fixierung oft
angepasst werden, um ein möglichst gutes Ergeb-
nis zu erzielen.
6.1.2 Schneidetechniken
Das Gewebe muss für die lichtmikroskopische
Analyse sehr dünn sein, und es wird daher mit
Hilfe verschiedener Schneidetechniken in sehr
dünne »Scheiben« geschnitten. Formaldehyd-fi-
xiertes Gewebe ist sehr fest, fast gummiartig, und
kann mit einem Vibratom geschnitten werden. In
das Vibratom wird ein sehr scharfes Messer ein-
gespannt, häufig eine Rasierklinge, wobei sich das
Messer vibrierend durch das Gewebe bewegt. Die
Schnitte werden dann in Puffer aufgefangen und
können »schwimmend« weiterbehandelt werden.
Vibratomschnitte sind meist 20–40 µm dick, in sel-
teneren Fällen auch dünner. Benötigt man dünnere
Schnitte, kommt meist ein Kryostat, auch Gefrier-
mikrotom genannt, zum Einsatz. Schockgefrorenes
Gewebe kann direkt geschnitten werden; Formal-
dehyd-fixiertes Gewebe muss erst über osmotisch
wirksame Substanzen, z.  B Sucrose, entwässert
werden, um die Bildung von Eiskristallen zu ver-
hindern. Mit Hilfe des Kryostats werden in der
127 6
Regel Schnitte zwischen 5 und 20  µm angefertigt,
in Einzelfällen auch dünner. Mit Hilfe der Paraffin-
einbettung kann man sogar noch dünnere Schnitte
anfertigen, hierzu muss das Gewebe entwässert, in
Paraffin eingebettet und mit einem Mikrotom ge-
schnitten werden. Für die elektronenmikroskopi-
sche Analyse werden Gewebestücke mit Kunstharz
eingebettet, wodurch eine Schnittdicke im Nano-
meterbereich möglich wird. Dabei ist die Schnittdi-
cke nicht immer ausschlaggebend für die Qualität
einer Präparation. So ist z. B die Strukturerhaltung
von Vibratomschnitten sehr viel besser als die von
Kryoschnitten.
Neben der Schneidetechnik spielt bei der histo-
logischen Analyse des Gehirns die Schnittrichtung
eine entscheidende Rolle. Man fertigt Horizontal-
schnitte an, wenn man bei einer Maus das Gehirn
von dorsal (oben) nach ventral (unten) schneidet,
Coronalschnitte werden von rostral (vorne) nach
caudal (hinten) geschnitten und sagittal schneidet
man von lateral nach lateral (.  Abb.  6.1). Welche
Schneiderichtung man wählt, hängt davon ab wel-
che Region des Gehirns untersucht werden soll.
Viele Regionen sind besonders gut in Schnitten
einer bestimmten Schnittrichtung zu identifizie-
ren, so kann man die verschiedenen Regionen des
Hippocampus besonders gut in coronalen Schnit-
ten sehen und für Untersuchungen des Hörcortex
sind horizontale Schnitte am besten geeignet. Da-
mit man sich in den Hirnschnitten zurechtfindet
und die einzelnen Strukturen identifizieren kann,
haben fleißige Wissenschaftler so genannte Atlan-
ten (Maus, oder Ratte) erstellt, in denen exemp-
larisch Hirnschnitte dargestellt und die einzelnen
Regionen wie Länder in einem Atlas bezeichnet
sind. Neben den Atlanten in Buchform kann man
mittlerweile auch viele Informationen frei zugäng-
lich über das Internet erhalten (Links am Ende des
Kapitels), allerdings sind die ursprünglichen Atlan-
ten in Buchform meist sehr viel detaillierter.
6.2 Übersichtsfärbungen
Da man in einem ungefärbten Hirnschnittpräparat
kaum Strukturen oder gar Zellen erkennen kann,
müssen die Schnitte für die histologische Analyse
gefärbt werden. Generell können alle für die Histo-
 128 Kapitel 6 • Anatomische Untersuchung des Nervensystems
. Abb. 6.1 Schnittrichtungen
caudal
horizontal
6
logie etablierten Methoden auch für das Anfärben
von Nervengewebe verwendet werden. Im Fol-
genden möchten wir nur kurz auf die gängigsten
Übersichtsfärbungen in den Neurowissenschaften
eingehen.
Nissl-Färbung: Die durch Franz Nissl (1860–
1919) etablierte Färbetechnik beruht darauf, dass
kationische (positiv geladene, basische) Farbstoffe
sich an die im Gewebe vorliegenden anionischen
(negativ geladenen, saure) Moleküle anlagern. Ani-
onische Gruppen liegen vor allem in den Phosphat-
resten vor, die massenhaft in der DNA der Zellker-
ne, in der ribosomalen RNA des Nucleolus und im
mit Ribosomen besetzten (»rauen«) endoplasma-
tischen Reticulum (rER; Nissl-Substanz) vorkom-
men. Die Anlagerung ist dabei pH-abhängig. Mit
steigenden pH-Wert verstärkt sich die Dissoziation
der Phosphatreste und der Farbstoff lagert sich be-
sonders gut an. Ist der pH-Wert jedoch zu hoch,
können auch die Carboxylgruppen dissoziieren
und es kommt zu einer unspezifischen Bindung
der Farbstoffmoleküle im gesamten Gewebe. Bei
niedrigem pH entfärbt man den Schnitt, da die Dis-
soziation zurückgedrängt wird. Als Farbstoff wird
heute häufig das Kresylviolett eingesetzt, welches
zu einer violetten Färbung der Nucleinsäuren führt.
HE-Färbung: Bei der Hämatoxylin-Eosin-
Färbung (abgekürzt HE-Färbung) handelt es sich
ebenfalls um eine Übersichtsfärbung neuronaler
Strukturen. Hämatoxylin ist ein natürlicher, posi-
tiv geladener Farbstoff aus dem Blauholzbaum. Er
dorsal
rostral
ventral
sagittal
coronal
färbt, wie das Kresylviolett bei der Nissel-Färbung,
alle negativ geladenen (»basophilen«) Struktu-
ren blau (DNA; Zellkern; rER usw.). Eosin ist ein
synthetischer, negativ geladener (saurer) Farbstoff,
der alle basischen acidophilen Strukturen, also
vor allem die Zellplasmaproteine, rot färbt. Nach
der Hämatoxilin-Färbung erscheinen die Zellker-
ne zunächst rötlich-braun aufgrund des niedrigen
pH-Wertes der Färbelösung. Durch Erhöhung des
pH-Wertes (Bläuen) schlägt der Farbton in das ty-
pische blau-violett um. Gebläut wird durch Spülen
in Leitungswasser. Anschließend folgt die Cyto-
plasma-Färbung in einer alkoholischen oder wäss-
rigen Lösung von Eosin.
Markscheidenfärbung: Myelinisierte Axone
des Gehirns (weiße Substanz) können mit Hilfe
von Markscheidenfärbungen dargestellt werden.
Verwendet werden Eisenhämatoxylin (nach Wei-
gert, Olivecrona oder Heidenhain-Wölcke) oder
eine kombinierte Markscheiden und Zellfärbung
(nach Klüver-Barrera). Dabei handelt es sich um
einen Kombination der Nissl-Färbung mit einer
Markscheidenfärbung durch Luxol Fast Blue, wo-
durch die markhaltigen Fasern tiefblau hervortre-
ten, während die Zellkerne durch einen violetten
Farbton zu erkennen sind.
Golgi-Imprägnation: Hierbei handelt es sich
wohl immer noch um die schönste Darstellung
einzelner Nervenzellen. Die von Camillo Golgi
(1843–1926) etablierte Färbung beruht auf einer
»Versilberung« von Nerven- und Gliazellen und
6.3 • Nachweis und Lokalisation von Protein und mRNA im Nervensystem
129 6
lässt diese schwarz-braun auf gelbem Hintergrund A
erscheinen. Golgi-Zellen werden in ihrer Gesamt-
heit gefärbt, d. h. man kann sowohl Zellkörper als
auch axonale Strukturen, dendritische Fortsätze
und sogar die postsynpatische Dornenfortsät-
ze (spines) mit ihr sichtbar machen. (.  Abb.  6.2)
Allerdings konnte bis heute nicht geklärt werden,
warum sich manche Zellen mit der Golgi-Methode
anfärben lassen andere aber nicht. Das etwas unzu-
verlässige Prinzip der Färbung beruht darauf, dass
kleinere Stücke des Gehirns über mehrere Tage fi-
xiert werden und dann in einem Gemisch aus Ka-
liumbicarbonat und Osmiumsäure mit Silbernitrat
»versilbert« werden. Der berühmte Neurohistologe
B
Santiago Ramón y Cajal (1852–1934) hat mit Hilfe
der Golgi-Färbung und den von ihm eingeführten
Abwandlungen neuronale Strukturen und Verbin-
dungen mit großer Genauigkeit und Akribie be-
schrieben. Für ihre Arbeiten zur Struktur des Ner-
vensystems erhielten Camillo Golgi und Santiago
Ramón y Cajal zusammen 1906 den Nobelpreis für
Medizin.

6.3 Nachweis und Lokalisation von

Protein und mRNA im
Nervensystem
Für viele neurowissenschaftliche Fragestellungen
ist es wichtig zu wissen, wann und vor allem in
welchen Bereichen des Nervensystems bestimmte
Gene angeschaltet werden. So sind Entwicklungs-
biologen z. B. unter anderem daran interessiert he-
rauszufinden, welche Gene in welchen Stadien der
embryonalen und postnatalen (nach der Geburt)
Entwicklung exprimiert (angeschaltet) werden.
Neben den verschiedenen Entwicklungsstadien
kann die Genexpression aber auch auf ganz spezi-
fische Teilbereiche des Nervensystems beschränkt
sein oder Gene werden nur nach ganz spezifischen
Aktivierungszuständen abgelesen. So findet man
viele aktivitätsregulierte Gene vermehrt im Vorder-
hirn und dem für das Lernen wichtigen Hippocam-
pus, wo sie vor allem dann angeschaltet werden,
wenn die Zellen im Zusammenhang mit Lernvor-
gängen aktiviert werden. Um die Genexpression
histologisch zu untersuchen, kann man entweder
die mRNA über die in situ-Hybridisierung oder
. Abb. 6.2 Golgi-Imprägnation. (A) Cortikale Pyramiden-
zellen (B) Detailaufnahme eines Dendriten mit Dornen-
fortsatz (Pfeil). (Mit freundlicher Genehmigung von M.
Schweizer, Hamburg)
das gebildete Protein über die Immunhistochemie
nachweisen.
Ist man während seiner Arbeit auf ein neues
interessantes Gen gestoßen, lohnt es sich, auch die
verschiedenen open-source-Datenbanken zu durch-
forsten, in denen die Expressionsprofile sehr vieler
Gene bereits beschrieben sind (Links am Ende des
Kapitels). Auch wenn das gewünschte Gen dort
ausführlich beschrieben ist, ist es ratsam eigene
Kontrollen durchzuführen, denn letztendlich sollte
man vor allem an das glauben, was man selbst nach
bestem Wissen und Gewissen produziert hat.
 130 Kapitel 6 • Anatomische Untersuchung des Nervensystems
6.3.1 Immunhistochemie
Bei der Immunhistochemie handelt es sich um eine
Kombination aus Histochemie und immunologi-
schen Techniken. Primär werden damit Proteine
in Schnittpräparaten direkt über Antigen-Anti-
körper-Reaktionen, oder indirekt über antikör-
pergekoppelte Markierungsreaktionen nachgewie-
sen. Die Immunhistochemie funktioniert in den
Grundzügen wie der Nachweis von Proteinen über
die Western-Blot-Analyse (7 Kap. 3.2.2). Allerdings
kann man über die Immunhistochemie zusätzliche
Informationen darüber erhalten, wo die Protei-
6 ne genau lokalisiert sind. Immunhistochemische
Nachweise sind sowohl an frischem, schockgefro-
renem Material als auch an perfundiertem Gewebe
durchführbar. Bei frischem Gewebe besteht jedoch
die Gefahr, dass Proteine im Gewebe etwas diffun-
dieren, wodurch die Information über die eigent-
liche Lokalistation der Proteine verfälscht werden
kann. Darüber hinaus ist die Strukturerhaltung bei
weitem nicht so schön wie bei Material, welches
perfundiert und am Vibratom geschnitten wurde.
Für viele Anwendungen kann frisches Gewebe je-
doch auch von Vorteil sein. Die Durchführung ist
z.  B. sehr viel schneller, ein Punkt, der vor allem
für die Diagnostik wichtig ist. Darüber hinaus ist
die Fixierung bei der Verarbeitung von frischem
Gewebe nicht so stark, wodurch Antikörperbin-
dungsstellen weniger stark vernetzt werden (siehe
auch unten). Frisches Gewebe wird beim Schnei-
den direkt auf Objektträger aufgebracht und dort
auch gefärbt, während Vibratomschnitte durch ihre
gute Fixierung frei schwimmend (free-floating) be-
handelt werden können und erst später auf Objekt-
träger aufgezogen werden.
Generell werden bei der Durchführung des
immunhistochemischen Nachweises die Schnitt-
präparate mit einem gegen das Protein gerichteten
Antikörper, auch 1., oder Primärantikörper ge-
nannt (wichtige Informationen zum Thema Anti-
körper finden sich in  7  Kap.  3.1) inkubiert. Dieser
kann dann entweder direkt über gebundene Flu-
oreszenzmoleküle oder über einen enzymatischen
Nachweis detektiert werden (direkte Methode). Für
den enzymatischen Nachweis werden die Antikör-
per mit bestimmten Enzymen, meist Peroxidasen
oder alkalische Phosphatasen, gekoppelt. Gibt man
das passende Enzymsubstrat dazu, wird dieses in
ein farbliches Produkt umgesetzt, welches an der
Stelle ausfällt, an der der Antikörper gebunden hat
(.  Abb.  6.4). Für die Peroxidasereaktion wird als
Substrat am häufigsten Diaminobenzidin (DAB)
eingesetzt, welches unter dem katalytischen Ein-
fluss von Wasserstoffperoxid, welches dem Inku-
bationsmedium ebenfalls zugesetzt wird, zu einem
schwarz-braunen Polymer oxidiert. Dank der Os-
miophilie (Affinität zu Osmiumtetroxid) ist das
Reaktionsprodukt auch elektronenmikroskopisch
analysierbar. Für den Nachweis mit Hilfe der alka-
lischen Phosphatase werden organische Phosphat-
verbindungen als Substrat angeboten. Dabei spaltet
die alkalische Phosphatase Phosphat ab und die
freigesetzte Verbindung reagiert zu einem farbigen
Endprodukt. Am häufigsten wird hier 5-Brom-4-
chlor-3-indoxylphosphat (BCIP) in Verbindung
mit Nitroblau-Tetrazoliumchlorid (NBT) verwen-
det. Dabei wird BCIP zu 5-Brom-4-chlor-Indoxyl
und Phosphat hydrolyisert. Das Indoxyl tautomeri-
siert zu einem Keton, welches dimerisiert und da-
durch zum blauen Indigo wird. Bei diesem Vorgang
werden Protonen frei, die dann NBT reduzieren,
wodurch das purpurne Diformazan gebildet wird.
Die Reduktion des NBT führt zu einer Farbverstär-
kung, welche in einer insgesamt dunkelvioletten
Färbung resultiert (. Abb. 6.3).
Liegt das nachzuweisende Protein jedoch in
sehr geringen Menge vor, oder sind die benutzten
Primärantikörper nicht sensitiv genug, so kann
man das Signal verstärken, indem man einen Se-
kundärantikörper, auch Brückenantikörper ge-
nannt, verwendet, der gegen die Spezies gerichtet
ist, aus der der Primärantikörper stammt. Da im-
mer mehrere Sekundärantikörper an den Primär-
antikörper binden, wird das Signal so verstärkt.
Möchte man das Signal noch weiter intensivieren,
so werden die Sekundärantikörper meist mit Biotin
(Vitamin H) gekoppelt. Biotin besitzt eine sehr star-
ke Affinität zu Avidin (ein Glykoprotein aus dem
Hühnerei), was in vielen biochemischen Verfahren
ausgenutzt wird. Für die Immunhistochmie sind an
das Avidin wiederum Peroxidasen oder alkalische
Phosphatasen für den enzymatischen Nachweis ge-
bunden. Die Tatsache, dass jedes Avidinmolekül
4 Biotinmoleküle binden kann, hat man sich bei
der so genannten ABC-Methode (Avidin-Biotin-
6.3 • Nachweis und Lokalisation von Protein und mRNA im Nervensystem
131 6

A H2N NH2 DAB

H 2N NH2
H2O2
Peroxidase
2 H2O
N N
H2N NH2
N N

H2N NH2

H2N NH2
N N

O
B O P O
Cl Cl O Cl O
Br O Br H
Br N
H 3-
+ PO4
H
N Phosphatase N 2H N Br
H H H O Cl
BCIP Indigo
NO2 O2N

N N N N
NO2 O2N
+ +
N N N N
NBT
CH3O OCH3
N NH HN N
N N N N

CH3 O Formazan OCH3

. Abb. 6.3 Substrate für die Immunhistochemie. (A) Diaminobenzidin (DAB) wird durch Peroxidasen und Zugabe von
Wasserstoffperoxid in ein farbliches Produkt umgewandelt. (B) Von BCIP (5-Brom-4-chlor-3-indoxylphosphat) wird durch
alkalische Phophatasen ein Phosphat abgespalten und es entsteht der Farbstoff Indigo. Dabei werden Protonen frei die NBT
(Nitroblau-Tetrazoliumchlorid) reduzieren und es kommt durch die Bildung von Formazan zu einer Farbverstärkung

Peroxidase-Complex), die einen noch sensitive-
ren Nachweis darstellt, zunutze gemacht. Wie der
Name schon sagt, werden hier größere Komplexe
aus Avidin-Biotin-Peroxidase-Molekülen gebildet,
die dann für eine maximale Verstärkung des Sig-
nals sorgen (. Abb. 6.4).
Da Peroxidasen auch endogen im Gewebe vor-
kommen, kann es bei der immunhistochemischen
Untersuchung, in der Substrate für Peroxidasen
verwendet werden, zu unspezifischen Markie-
rungen kommen. Dem kann man vorbeugen, in-
dem man die Schnitte vor der Inkubation mit der
Primärantikörperlösung mit Wasserstoffperoxid
(H2O2) inkubiert, wodurch die endogene Peroxida-
seaktivität blockiert wird.
 132 Kapitel 6 • Anatomische Untersuchung des Nervensystems
. Abb. 6.4 Immunhistochemie
– direkter und indirekter Nach-
A B
weis. (A) Für den direkten Nach-
weis werden die Primärantikörper
direkt mit Fluoreszenzmolekülen
oder Enzymen gekoppelt. (B) Der
indirekte Nachweis ist sensitiver,
da mehrere Brückenantikörper an
einen Primärantikörper binden
können und so das Signal ver-
stärkt wird. (C) Am sensitivsten ist
die ABC-Methode. Hier werden
Komplexe aus Avidin und Biotin
gebildet, an die viele Peroxida- C
sen gekoppelt sind, wodurch
6 das Signal noch weiter verstärkt
werden kann
kKontrollen – oder traue keinem Antikörper!
Ein sehr wichtiges Thema in der Immunhisto-
chemie sind die Kontrollen. Leider halten viele
kommerziell erworbene Antikörper nicht, was sie
versprechen, und man tut gut daran, seine Expe-
rimente ausreichend zu kontrollieren. Dabei sollte
man sowohl fehlende als auch unspezifische Signa-
le ausreichend überprüfen.
Zur Kontrolle nicht vorhandener Signale ist es
am besten, wenn man bei der Durchführung der
Experimente Gewebe mitlaufen lässt, in dem das
gesuchte Protein definitiv vorhanden ist. Zudem
kann man mit Western-Blot-Analysen überprüfen,
ob eine Bande im Größenbereich des Zielproteins
detektiert werden kann. Obwohl der Hersteller auf
seiner Homepage Blots mit einer solchen Bande
präsentiert, kann man diese in eigenen Experi-
menten leider oft nicht nachweisen und man fragt
sich, wo der Hersteller die gezeigten Blots eigent-
lich her hat. Die Rückgabe eines Antiköpers ist
generell möglich, jedoch meist mit einem größe-
ren Zeitaufwand verbunden. Der Experimentator
muss Beweisbilder liefern und viele »gut gemeinte«
Tipps des Herstellers über sich ergehen lassen. Ist
das alles nicht erfolgreich, bekommt man zunächst
Schnittpräparat
Antikörper
Protein
farbliches Produkt
Enzymsubstrat
Enzym
Fluoreszenzmolekül
Biotin
Avidin
den gleichen Antikörper aus einer neuen Charge
nochmal. Leider funktioniert dieser meist auch
nicht und man endet dann nach viel Zeitverlust
mit einem Gutschein der Firma, mit dem man sich
– juchhu! – einen neuen Antikörper kaufen kann.
Der Grund, warum solche Firmen weiter Umsatz
machen, liegt nach Meinung vieler Wissenschaft-
ler nur darin begründet, dass der Zeitaufwand der
Antikörperrückgabe viel zu groß ist und man daher
lieber gleich einen neuen Antikörper kauft. Eine
Firmenstrategie, die dringend überdacht werden
sollte!
Hat man jedoch Glück (das kommt durchaus
auch vor) und kann im Western Blot das Protein
auf der richtigen Höhe nachweisen, findet aber
trotzdem kein Signal in den Schnittpräparaten, so
wurden eventuell die Epitope, gegen die der Anti-
körper gerichtet ist, maskiert. Zu einer Maskierung
der Epitope kann es bei der Fixierung kommen.
Hier wird das Gewebe über die Vernetzung der
Proteine stabilisiert, wodurch die Bindungsstellen
für den Antikörper unter Umständen mit vernetzt
werden und dann nicht mehr frei zugänglich sind.
Um Antikörperbindungsstellen wieder frei zu le-
6.3 • Nachweis und Lokalisation von Protein und mRNA im Nervensystem
. Tab. 6.1 Substrate für die Immunhistochmie
Substrat
DAB (3,3-Diaminobenzidin)
AEC (3-Amino-9-Ethylcarbazol)
CN (4-Chlor-1-Naphthol)
TMB (Tetramethylbenzidin)
Neufuchsin
Naphthol-AS-MX-Phosphat
BCIP (5-Brom-4-chlor-3-indoxylphosphat) mit NBT
(Nitroblau-Tetrazoliumchlorid
gen, kann man versuchen, die Schnitte stärker
durchlässig zu machen. Dieser Vorgang wird als
Antigen-Retrieval, oder Antigen-Demaskierung
bezeichnet. Hierbei werden Kombinationen aus
enzymatischem Verdau und Hitzebehandlung mit
Dampfhitze oder Mikrowellenöfen in so genannten
Retrieval-Lösungen, meist Citratpuffer, oder TRIS-
HCL (TRIS-EDTA), durchgeführt. Enzymatisch
kann das Gewebe mit Trypsin, Pepsin oder Pro-
teinase K behandelt werden. Möchte man das Ge-
webe nur etwas permeabilisieren, also für die Anti-
köper leichter durchgängig machen, kann man die
Schnitte mit Detergenzien wie Triton oder Tween
behandeln. Detergenzien besitzen Eigenschaften,
die den Lipiden der Membranen ähnlich sind und
sie können die feste Membranstruktur etwas auf-
lösen, indem sie sich in die Membranen einlagern.
Allerdings kann es auch vorkommen, dass der An-
tikörper nur an denaturierte Proteine, wie sie im
Western Blot vorliegen, bindet und nicht an die
nativen Proteine im Schnittpräparat. Die Herstel-
ler geben in ihren Produktdatenblättern meist auch
Information darüber, ob die Antikörper auch für
die Histochemie getestet wurden, und der Experi-
mentator sollte zumindest keinen kaufen, der nicht
»nachweislich« histologisch getestet wurde.
Neben einer fehlenden Markierung können im-
munhistochemische Untersuchungen auch zu un-
spezifischen Signalen führen. Diese können durch
eine unspezifische Bindung der Primärantikörper,
aber auch der Sekundärantikörper oder der weite-
ren eingesetzten Komponenten verursacht werden.
133 6
Enzym Farbe des Endproduktes
Peroxidase braun; mit Nickelverstär-
kung schwarz
Peroxidase rosenrot
Peroxidase blau
Peroxidase blau
Alkalische Phosphatase rosarot
Alkalische Phosphatase rot
Alkalische Phosphatase dunkel-violett
Um die Spezifität seines neu erworbenen Antikör-
pers zu testen, kann der Experimentator auch hier
eine Western-Blot-Analyse machen. Findet man
neben der gewünschten Bande noch zusätzliche
Banden im Blot, dann ist das ein starker Hinweis
darauf, dass der Antikörper auch noch an andere
Proteine bindet. Um die Spezifität zu testen, kann
man den Primärantikörper auch mit großen Men-
gen des zu detektierenden Proteins vorinkubieren.
Es sollten dann keine Signale mehr im Schnitt zu
detektieren sein. Die beste Negativkontrolle ist je-
doch auch hier Material von einem Organismus,
der das gewünschte Protein nicht bildet, z. B. einer
Knockout-Maus. Unspezifische Bindungen der an-
deren Komponenten kann man kontrollieren, in-
dem man einige Schnitte nicht mit der Primäranti-
körperlösung inkubiert. Findet man auch in diesen
Schnitten ein Signal, dann kann man diese auf un-
spezifische Bindungen der weiteren Komponenten
zurückführen.
Generell hängen unspezifische Bindungen und
nicht vorhandene Signale natürlich auch stark von
der Konzentration des eingesetzten Antikörpers
und der anderen Komponenten ab. Auch wenn die
Immunhistochemie ein vergleichsweise einfaches
Verfahren zum Nachweis von Proteinen in Schnitt-
präparaten ist, kann man bei Etablierung eines neu-
en Antikörpers einige Zeit mit der Optimierung des
Protokolls verbringen. Dabei spielen vor allem die
Stärke der Fixierung und die Konzentrationen der
eingesetzten Lösungen eine entscheidende Rolle.
 134 Kapitel 6 • Anatomische Untersuchung des Nervensystems
6.3.2 Enzymhistochemie
Neben unspezifischen Markierungen, die man ver-
meiden möchte, kann die endogene Enzymaktivität
jedoch auch genutzt werden, um bestimmte Enzy-
me nachzuweisen. Hierzu werden die Schnitte mit
einer Substanz inkubiert, die als Substrat für das
jeweilige Enzym fungiert. Ein farbliches Nebenpro-
dukt weist dann auf die Präsenz des Enzyms hin.
Auf diese Weise häufig nachgewiesene Enzyme
sind die Acetylcholinesterase, die Cytochromoxi-
dase und die NADPH-Diaphorase/Stickoxidsyn-
thethase. Der Nachweis eines bestimmten Enzyms
6 kann helfen, bestimmte Zellen zu charakterisieren
(Acetylcholinesterase, NADPH-Diaphorase/Sti-
ckoxidsyntethase) oder spezifische Strukturen im
Gewebe selektiv darzustellen (Cytochromoxidase).
6.3.3 In situ-Hybridisierung
(Es lohnt sich, für das bessere Verständnis dieses Ab-
schnitts auch 7 Kap. 2 zu Rate zu ziehen)
Möchte man nicht das Protein, sondern die
mRNA in neuronalem Gewebe nachweisen, kommt
die in situ-Hybridisierung zum Einsatz. Hier wer-
den die Gewebepropen (in situ) mit zur mRNA
komplementären Nucleinsäuresträngen (Sonden)
inkubiert und es kommt zur Verschmelzung (Hy-
bridisierung) der mRNA und der Sonde. Die Nuc-
leinsäuresonden sind so modifiziert, dass sie nach
der Hybridisierung mit Hilfe verschiedener Detek-
tionsmethoden nachgewiesen werden können und
so die gewünschte mRNA sichtbar gemacht wird.
Grundsätzlich unterscheidet man zwischen einer
radioaktiven und einer nicht-radioaktiven in situ-
Hybridisierung.
In situ-Hybridisierungsexperimente werden
meist an Schnittpräparaten von frischem, gefrore-
nem Gewebe durchgeführt. Prinzipiell funktioniert
sie aber auch an perfundiertem Gewebe. Für die
Hybridisierung der Sonden müssen die Schnitte
vorbereitet werden. Zunächst werden sie fixiert,
dann werden die positiven Ladungen der Proteine
im Schnittpräparat, über das Anhängen von Ace-
tylresten (Acetylierung) abgeschirmt, da diese zu
unspezifischen Bindungen der negativ geladenen
Nucleinsäuresonden führen können. Im Anschluss
wird das Gewebe permeabilisiert, um so das Ein-
dringen der Sonde ins Gewebe zu begünstigen.
Für die Hybridisierung selbst muss eine optima-
le Hybridisierungstemperatur bestimmt werden,
welche stark vom G-C-Gehalt der Sonde bzw. der
mRNA abhängt. Zudem findet die Hybridisierung
der Sonde in einem extra dafür entwickelten Hy-
bridisierungspuffer statt. Dieser beinhaltet viele
Komponenten, die eine Bindung der Sonde an die
mRNA begünstigt wie z. B. eine definierte Salzkon-
zentration und wasserbindende Substanzen, wie
Dextransulfat und Denhardts, welches wiederum
aus Ficoll, Polyvinylpyrrolidon und BSA (Rinder-
serumalbumin) besteht. Nach der Hybridisierung
werden die Schnitte mit Salzpuffern in sinkender
Konzentration gewaschen (stringentes Waschen),
wodurch unspezifisch gebundene Nucleinsäure-
moleküle abgelöst werden. Je nachdem, wie die
Sonde markiert wurde, kann sie über unterschied-
liche Methoden detektiert werden (siehe unten).
kDie Sonde
Für die Herstellung und Markierung der Sonde gibt
es verschiedene Verfahren. Entweder man verwen-
det synthetisierte Oligonucleotide, an die bereits
Fluoreszenzmoleküle gekoppelt sind (solche kann
man kommerziell erwerben), Produkte einer PCR-
Reaktion, oder in vitro transkribierte Nucleinsäu-
reketten in die modifizierte Nucleotide zur Detek-
tion bei der Synthese mit eingebaut werden. Die
Sondenherstellung über die in vitro-Transkription
ist das Mittel der Wahl, wenn man eine bestimm-
te mRNA häufiger detektieren möchte, denn man
kann, sobald man die cDNA des Zielgens in den
Transkriptionsvektor kloniert hat, diesen immer
wieder verwenden und somit schnell und relativ
kostengünstig immer wieder neue Sonden herstel-
len. Die cDNA kann man entweder aus Gewebe ge-
winnen, indem man die gesamte mRNA aus einer
Gewebepräparation über die Verwendung einer
Reversen Transkriptase in cDNA umschreibt und
dann die gewünschte cDNA über eine PCR Reak-
tion vervielfältigt, oder man besitzt bereits einen
Vektor, aus dem man die cDNA über einen Restrik-
tionsverdau ausschneiden kann und in den Tran-
skriptionsvektor hinein kloniert. Darüber hinaus
kann man, wie auch schon in 7 Kap. 2 beschrieben,
6.3 • Nachweis und Lokalisation von Protein und mRNA im Nervensystem
für viele Gene die cDNA auch kommerziell erwer-
ben.
Bei der Sondenherstellung über die in vitro-
Transkription werden durch die Zugabe von RNA
Polymerasen und Nucleotiden die gewünschten
RNA-Stränge in vitro synthetisiert. Dabei entsteht
je nach Transkriptionsrichtung entweder eine Sen-
se- oder Antisense-Sonde. Die Antisense-Sonde
bindet an die mRNA, die Sense-Sonde wird gerne
als Kontrolle für unspezifische Bindungen verwen-
det. Damit man sowohl Sense- als auch Antisense-
Sonden von einem Transkriptionsvektor syntheti-
sieren kann, muss der Vektor entweder auf der 5′
oder auf der 3′ Seite der cDNA geschnitten wer-
den, und es muss 2 Startpunkte für 2 unterschied-
liche Polymerasen geben, einen am 5′ und einen
am 3′Ende (.  Abb.  6.6). Je nach Nachweis werden
in die Sonde entweder radioaktiv markierte Nuce-
lotide (meist mit 35S markierte UTPs) oder Digo-
xiginin-markierte UTPs eingebaut. Der Nachweis
der radioaktiven Sonde findet über das Auflegen
eines Röntgenfilms auf die Schnitte statt. Dieser
wird nach einer optimalen (muss man ermitteln)
Expositionszeit entwickelt. Bereiche, in denen die
Sonde gebunden hat, erscheinen auf den Filmen
geschwärzt. Die radioaktive in situ-Hybridisierung
ist relativ schnell durchführbar und liefert eine sehr
schöne Übersicht über die Bereiche, in denen eine
bestimmt mRNA vorliegt. Zudem ist das radioak-
tive Signal proportional zur Transkriptmenge und
über die Verwendung von Standards definierter
mRNA-Mengen kann eine quantitative Aussage ge-
macht werden. Allerdings bietet sie in der norma-
len Anwendung keine zelluläre Auflösung. Möchte
man eine bessere Auflösung erreichen, kann man
die radioaktiv markierten Schnitte in eine Filme-
mulsionslösung eintauchen (dippen) und es müs-
sen dann die Schnitte selbst entwickelt werden.
Über dieses Verfahren kann man eine zelluläre
Auflösung über gebildete Silberpartikel, die direkt
auf dem Schnitt sichtbar werden, erreichen. Möchte
man oder darf man nicht radioaktiv arbeiten, oder
möchte man eine noch bessere zelluläre Auflösung
erreichen, kann man Digoxiginin (DIG) markierte
UTPs verwenden und diese über ein immunhisto-
chemisches Verfahren (siehe oben) mit Hilfe von
Antikörpern nachweisen, die gegen DIG gerichtet
sind. Hier kommen Antikörper zum Einsatz, die
135 6
entweder mit Fluoreszenzmolekülen (FISH- fluore-
scent in situ hybridization) oder mit Enzymen wie
der oben beschriebenen alkalischen Phosphatase
gekoppelt sind. Ein sehr sensitiver und hochaufge-
löster Nachweis kann über das von Perkin Elmer
erhältliche TSA (tyramid signal amplification)-Sy-
stem erreicht werden. Hier werden die gegen DIG
gerichteten Antikörper mit einer Peroxidase ge-
koppelt. Die Peroxidase oxidiert die Tyramide, die
so aktiviert werden und kovalent an die im Schnitt
vorliegenden Proteine binden. An die Tyramide
sind wiederum Fluorenszenzmoleküle gekoppelt,
die dann mit Hilfe eines Fluoreszenzmikroskops
nachgewiesen werden können. Die Auflösung ist
mit diesem System so gut, dass man gerade tran-
skribierte mRNA im Nucleus von mRNA, die be-
reits aus dem Zellkern hinaus geschleust wurde, un-
terscheiden kann. Dies hat zur Etablierung der so
genannten cat-FISH (fluorescent in situ hybridiza-
tion with cellular and temporal resolution)-Methode
geführt, mit der man eine räumlich und zeitlich
aufgelöste Aktivierung neuronaler Netze nachwei-
sen kann (7 Kap. 6.4.4 ).
Neben der Detektion der mRNA im Schnittge-
webe kann man die Fluoreszenz-in situ-Hybridisie-
rung (FISH) auch einsetzten, um die Lokalistation
von mRNAs in primären neuronalen Zellen nach-
zuweisen, oder über eine DNA-DNA-Hybridisie-
rung spezifische Genabschnitte auf Chomosomen
sichtbar zu machen.
Um Zellen, die bestimmte Gene exprimieren,
näher zu bestimmen, können auch verschiedene
Nachweismethoden kombiniert werden. Man kann
z. B. über Fluoreszenzdoppelfärbungen sowohl das
Zielprotein als auch zellcharakteristische andere
Proteine nachweisen. Man kann die Fluoreszenz-
in situ-Hybridisierung mit einem immunhistoche-
mischen Nachweis kombinieren oder die Lokalisa-
tion der nachgewiesenen Proteine im Schnitt über
eine Übersichtsfärbung, wie der Nissl-Färbung,
näher charakterisieren. Generell gilt dabei, dass
je mehr unterschiedliche Verfahren kombiniert
werden sollen, desto mehr Parameter müssen op-
timiert werden, und desto länger kann die Etablie-
rung einer solchen Methode dauern.
 136 Kapitel 6 • Anatomische Untersuchung des Nervensystems

kArbeiten mit RNA!! A

Bei der Durchführung der in situ-Hybridisierung
muss man darauf achten, dass die überall vorkom-
menden RNasen weder die Sonden noch die im
Präparat zu detektierende mRNA abbauen. Daher
sollte nur sehr sauberes Wasser verwendet werden,
alle zu benutzenden Glaswaren sollten vorher ste-
rilisiert werden und auch alle Arbeitsflächen sollten
RNase frei sein. Da der Experimentator selbst auch
einen Quelle für RNasen sein kann, sollten Sie stets
mit Handschuhen arbeiten.

B
6 6.4 Nachweis neuronaler Aktivität

In 7 Kap. 10 können wir lernen, wie man neuronale

Aktivität bei Menschen mit verschiedenen nicht-
invasiven Imaging-Verfahren messen kann. In die-
sem Kapitel möchten wir kurz darauf eingehen, wie
komplexe neuronale Aktivierungsmuster im Tier-
modell entweder über den Nachweis bestimmter
Markerproteine im Gewebe oder über die Verwen-
dung radioaktiv markierter Glukose untersucht
werden kann.
6.4.1 Aktivitätsregulierte Gene
Es ist bekannt, dass verschiedene Proteine immer
nach Aktivierung einer Nervenzelle gebildet wer-
den. Das c-fos Gen gehört zu dieser Gruppe und
wurde bereits in vielen Studien benutzt, um die Ak-
tivierung vieler Neurone eines neuronalen Netzes
sichtbar zu machen, die z.  B. nach verschiedenen
sensorischen Stimulationen oder in verschiedenen
Lernsituationen aktiviert werden. C-fos ist ein zel-
luläres Protoonkogen der Gruppe der immediate-
early genes, welches direkt nach neuronaler Akti-
vierung gebildet wird und als Transkriptionsfaktor
die Expression weiterer Gene reguliert. Der im-
munhistochemische Nachweis von c-fos ist sehr
gut etabliert und daher sehr einfach durchführbar.
Das c-fos Protein verbleibt im Zellkern und man
kann den Zellkern der aktivierten Neurone sehr gut
visualisieren (. Abb. 6.7). Um ein verlässliches Bild
der gesamten Population aktivierter Neurone einer
bestimmten Hirnregion oder gar des ganzen Ge-
hirns zu erhalten, benötigt man jedoch spezialisier-
. Abb. 6.5 Immunhistochemie und in situ-Hybridisierung
im Vergleich. Gezeigt sind coronale Schnitte des Gyrus
Dentatus des Hippocampus , in denen das Arg3.1 Protein und
die Arg3.1 mRNA nach synaptischer Aktivität nachgewiesen
wurden. (A) Mit Hilfe der Immunhistochemie kann man das
Protein mit zellulärer Auflösung nachweisen. (B) Bei der
radioaktiven in situ-Hybridisierung kann die mRNA in be-
stimmten Hirnregionen nachgewiesen werden. Das Signal ist
diffus und erreicht keine zelluläre Auflösung. Die radioaktive
in situ-Hybridisierung bietet jedoch einen guten Überblick
über die Genexpression im gesamten Gehirn und die Intensi-
tät des Signals ist proportional zur Transkriptmenge
te stereologische Verfahren, die eine dreidimensio-
nale Interpretation der planaren Schnitte erlauben
und über die die Zahl der aktivierten Neurone in
den verwendeten Schnittpräparaten verlässlich
bestimmt werden können. Neben dem c-fos Pro-
tein, das generell eher als Marker neuronaler Ak-
tivität angesehen wird, kann man auch Marker
für plastische Veränderungen verwenden, die mit
neuronalen Lernprozessen, aber auch mit neurolo-
gischen Erkrankungen in Zusammenhang stehen.
Als gutes Markerprotein für plastische Verände-
rungen hat sich mittlerweile das aktivitätsregulierte
Protein Arg 3.1 (auch Arc genannt) etabliert. Auch
6.4 • Nachweis neuronaler Aktivität
137 6

A cDNA

NotI SalI

Sp6 Polymerase T7 Polymerase

NotI SalI

Restriktion

T7 Sp6

cDNA cDNA
NotI SalI SalI NotI

Antisense-Sonde Sense-Sonde
Sense

B Antisense
NotI SalI

5’ 3’
Sp6 5’ 3’ T7

NotI
RNA-Ploymerasen synthetisieren
in 5’-3’ Richtung

Antisense-Sonde T7
3’ 5’
Sense
5’ 3’
Antisense
3’ 5’

. Abb. 6.6 Herstellung einer mRNA-Sonde für die in situ-Hybridisierung mit Hilfe der in vitro-Transkription. (A) Für die Her-
stellung von Sense- und Antisense-Sonden muss der Expressionsvektor auf der 5′ und der 3′ Seite der klonierten cDNA mit
Hilfe von Restriktionsenzymen geschnitten werden (hier SalI und NotI). Zudem finden sich auf beiden Seiten der cDNA Start-
punkte für zwei unterschiedliche RNA-Polymerasen (hier SP6 und T7). (B) Die Antisense-Sonde bindet an die komplementäre
Sense-mRNA und wird durch Ablesen des Sense-Stranges der cDNA gebildet
 138 Kapitel 6 • Anatomische Untersuchung des Nervensystems

A B

. Abb. 6.7 Nachweis neuronaler Aktivität über das c-fos-Protein und radioaktiv markierte Glukose. (A) C-fos ist ein zellulä-
rer Marker für neuronale Aktivierung. Das c-fos Protein kann mit Hilfe der Immunhistochemie im Zellkern aktivierter Neurone
nachgewiesen werden. Es können somit einzelne aktivierte Zellen sichtbar gemacht werden. (B) Bei der Autoradiographie
wird radioaktiv markierte Glucose nachgewiesen, die von aktiven Nervenzellen aufgenommen wurde und vermehrt an akti-
vierten Synapsen akkumuliert. Es können aktivierte Hirnareale ohne zelluläre Auflösung nachgewiesen werden

wenn Markerproteine viele Informationen über
den Aktivitätszustand und die ablaufenden Verän-
derungen des Nervensystems liefern können, sollte
man auch die Limitierung solcher Nachweise im
Hinterkopf haben. So weiß man z. B. nicht mit Si-
cherheit, ob die Markerproteine tatsächlich in allen
aktivierten Neuronen angeschaltet werden oder ob
alle aktivierten Neurone tatsächlich das Makerpro-
tein exprimieren. Zudem ist die zelluläre Funktion
der beiden genannten Markerproteine noch lange
nicht in allen Details geklärt.
6.4.2 Autoradiographie
Bei der Autoradiographie handelt es sich um
eine Darstellung der neuronalen Aktivität, die
der Positronenemissionstomographie (PET; si-
ehe  7  Kap.  10), die als funktionelles bildgebendes
die Methode auch die 2-Deoxyglucose-Methode
(2-DG), weil dabei radioaktiv markierte Gluco-
se von aktiven Nervenzellen aufgenommen wird,
aber wegen der fehlenden Hydroxylgruppe nicht
weiter verstoffwechselt werden kann und sich
deshalb in aktivierten Nervenzellen und dort vor
allem an aktivierten Synapsen anhäuft. Im Gegen-
satz zu den PET-Untersuchungen, bei denen die
Radionucleotide und damit die Aktivierung über
einen PET-Scanner sichtbar gemacht werden kön-
nen, müssen die Gehirne für die Autoradiographie
entnommen und mit Hilfe des Gefriermikrotoms
geschnitten werden (Schnittdicke 20–40 µm). Auf
die Schnitte werden Röntgenfilme gelegt und man
wertet wie bei den radioaktiven in situ-Hybridisie-
rungsexperimenten anschließend die Schwärzung
der Filme aus (. Abb.  6.7). Um quantitative Da-
ten zu erhalten, muss man bei der 2-DG-Methode
14C-Standards definierter Konzentration mit expo-

Verfahren an Menschen angewendet wird, sehr
ähnlich ist. Genau wie bei PET-Untersuchungen,
die radioaktiv markierte 18F-Desoxyglucose als
nachzuweisende Radionucleotide benutzen, wird
hier mit 14C markierte Glucose injiziert. Man nennt
nieren, um hinterher den Grad der Schwärzung in
Radioaktivität umrechnen zu können. Die 2-DG-
Methode ist eine vergleichsweise alte (70er Jahre)
und einfach durchzuführende Methode, mit der
neuronale Aktivierungsmuster untersucht werden
6.4 • Nachweis neuronaler Aktivität
können. Allerdings benötigt man ein Isotopenla-
bor, in dem man radioaktiv arbeiten darf und man
muss aufgrund der sehr langen Halbwertszeit von
14C (5  730 Jahr) aufpassen, dass man sehr sauber
arbeitet und weder sich noch andere gefährdet.
14C besitzt zwar eine sehr geringe Strahlung und
kommt auch natürlich in der Atmosphäre vor
(Grundlage für die Altersbestimmung über die
Radiokarbonmethode), allerdings macht gerade
diese sehr geringe Strahlung einen Nachweis über
die normalen im Labor verwendeten Geigerzähler
schwierig, und man kann daher Kontaminationen
schlechter detektieren. Darüber hinaus kann die
Auswertung der radioaktiven Filme sehr Zeit in-
tensiv werden und es empfiehlt sich, jemand mit
Programmierkenntnissen zu Rate zu ziehen, um
die Analyse soweit wie möglich zu automatisieren.
In den letzten Jahren wurden zunehmend auch
PET- und MRI-Untersuchungen (7 Kap. 10) an Na-
gern durchgeführt. Solche Untersuchungen haben
gegenüber der Autoradiographie den Vorteil, dass
man an einem Tier mehrere Untersuchungen ma-
chen kann, z.  B vor und nach einer Behandlung,
wodurch eine optimale interne Kontrolle gewähr-
leistet wird. Da es in Deutschland immer noch
sehr wenige von diesen Geräten gibt, die für Na-
ger verwendet werden können, und diese Unter-
suchungen vergleichsweise teuer sind, werden sie
wohl in naher Zukunft nicht als Standardverfahren
zur Untersuchung neuronaler Aktivität im Tiermo-
dell verwendet werden. Darüber hinaus besteht ein
Nachteil dieser Methoden darin, dass man Mäusen
und Ratten nicht sagen kann, dass sie für eine be-
stimmte Zeit absolut stillhalten sollen, damit der
Scan gelingt, sondern sie in den meisten Fällen für
die Untersuchungen narkotisieren muss, wodurch
die neuronalen Aktivitätsmuster stark beeinträch-
tigt werden können. Zudem ist die Auflösung bei
den Scanverfahren (mm) wesentlich geringer als
bei der Anwendung der 2-DG-Methode (µm).
6.4.3 Reportermäuse
Die Möglichkeit, Mäuse gentechnisch zu verändern
und so neue Gene in das Mausgenom einzufüh-
ren (7  Kap.  8) hat unter anderem zur Etablierung
von so genannten Reportermäusen geführt, die
139 6
bestimmte Reportergene unter der Kontrolle akti-
vitätsregulierter Promotoren, wie z.  B. dem c-fos
oder dem Arg 3.1 Promotor, bilden können. Als Re-
porter wird hier meist GFP (green fluorescent pro-
tein) eingesetzt, welches durch seine fluoreszenten
Eigenschaften im Schnittpräparat ohne weitere hi-
stologische Methoden mit Hilfe der Fluoreszenz-
mikroskopie nachgewiesen werden kann. Neben
der fluoreszenzmikroskopischen Auswertung der
Schnittpräparate werden diese Mäuse auch be-
nutzt, um in vivo, also im lebenden Organismus,
die Aktivierung von Neuronenpopulationen über
einen längeren Zeitraum mit Hilfe der konfokalen
Mikroskopie zu untersuchen. Da es sich bei den
GFP-Reportermäusen meist um transgene Tiere
handelt und man nicht genau weiß, in welchem
Teil des Genoms die Fremd-DNA integriert wird
(7 Kap. 8.3), muss man, bevor man diese Mäuse für
Imaging-Experimente verwendet, auf jeden Fall
prüfen, ob das Reportergen in normalen physiolo-
gischen Mengen und nur nach neuronaler Aktivie-
rung gebildet wird.
6.4.4 Cat-FISH
Die Cat-FISH (fluorescent in situ-hybridization with
cellular and temporal resolution)-Methode wurde
etabliert, um eine räumlich und zeitlich aufgelöste
Aktivierung neuronaler Netze mit Hilfe der Fluo-
reszenz-in-situ-Hybridisierung und der Analyse
über die konfokale Mikroskopie nachzuweisen.
John Guzowski und Kollegen haben diese Metho-
de initial verwendet, um nach Verhaltensexperi-
menten Gruppen von Neuronen nachzuweisen, die
durch die Erkundung unterschiedlicher räumlicher
Umgebungen aktiviert wurden (Guzowski, 1999).
Grundlegend dabei war das Wissen, dass die nu-
cleäre mRNA eines durch neuronale Aktivität an-
geschalteten Gens (hier Arg 3.1) bereits nach 5 Mi-
nuten nachweisbar ist, während die mRNA im Cy-
toplasma erst nach 30 Minuten detektiert werden
kann. Setzt man nun eine Ratte oder eine Maus für
5 Minuten in eine bestimmte Umgebung und lässt
sie nach einer Pause von 30 Minuten eine ande-
re Umgebung 5 Minuten lang erforschen, so kann
man hinterher die gesamte Population an Neu-
ronen detektieren, die durch die Exploration der
 140 Kapitel 6 • Anatomische Untersuchung des Nervensystems

. Abb. 6.8 Cat-Fish (fluorescent

A 5 min Exploration 5 min Exploration
in situ-hybridization with cellular
and temporal resolution). Mit Hilfe
von cat-FISH kann man aktivierte
Neuronenpopulationen mit 30 min
zeitlicher Auflösung untersuchen
(A) Mäuse oder Ratten werden
im Abstand von 30 Minuten mit
zwei verschiedenen räumlichen
Umgebungen konfrontiert. (B)
Schematische Darstellung der
neuronalen Signale. Nach 5
Minuten liegt die mRNA nur im B
Zellkern vor, nach 30 Minuten
nur im Cytoplasma. Wurde ein

6 Neuron durch die Exploration in

beiden Umgebungen aktiviert, so
kann man sowohl ein nucleäres
als auch ein cytoplasmatisches cytoplasmatisch cytoplasmatisch intranucleär
Signal nachweisen (C) Beispielbil- und intranucleär
der für ein ein cytoplasmatisches
und ein nucleäres Signal

unterschiedlichen Umgebungen aktiviert wurde. von Neuronenpopulationen untersuchen kann.

Alle Neurone, die durch Umgebung 1 aktiviert wur-
den, zeigen ein cytoplasmatisches Signal, während
alle Neurone, die durch Umgebung 2 angeschaltet
wurden, ein nucleäres Signal zeigen. Neuronenpo-
pulationen, die durch beide Umgebungen aktiviert
wurden, zeigen sowohl ein cytoplasmatisches, als
auch ein nucleäres Signal (. Abb. 6.8). Für die Aus-
wertung der Schnittpräparate müssen hochaufge-
löste, konfokale Bilder aufgenommen werden, und
die quantitative Auswertung dieser Bilder kann
leider ohne Probleme mehrere Diplomarbeiten in
Anspruch nehmen.
6.5 Tracing-Verbindungsstudien
Bisher wurden in diesem Kapitel Methoden be-
sprochen, mit denen man die Morphologie und
die Lokalisation von Neuronentypen, das Gen/
Protein-Expressionsprofil oder die Aktivierung
Da die neuronale Informationsverarbeitung je-
doch nicht nur durch die Eigenschaften einzelner
Neurone bestimmt wird, sondern auch durch die
Verbindungen, die Nervenzellen innerhalb eines
neuronalen Netzes miteinander haben, ist es un-
abdingbar, die Verbindungen zwischen Nervenzel-
len zu untersuchen, um die Funktion des Nerven-
systems besser zu verstehen. Woher Nervenzellen
ihre Informationen bekommen und wohin sie diese
weiterreichen, kann mit Hilfe von Tracing-Studien
untersucht werden. Für Tracing-Experimente wer-
den Substanzen entweder direkt in die Zelle inji-
ziert oder in der Nähe der Zellen appliziert, von
wo sie über aktive Prozesse von den Nervenzellen
aufgenommen werden. In der Zelle angelangt, wer-
den die Tracing-Substanzen entweder retrograd in
Richtung Zellkörper oder anterograd in Richtung
der Axonterminalien transportiert (.  Abb.  6.9).
Manche Substanzen können auch in beide Rich-
tungen transportiert werden und markieren da-
6.5 • Tracing-Verbindungsstudien
A werden durch das Herstellen der Gewebeschnitte
anterograd
retrograd
B rekt nachgewiesen werden, oder sie sind an Peroxi-
. Abb. 6.9 Nachweis neuronaler Verbindungen über
Tracing-Methoden. (A) Für den Nachweis neuronaler Ver-
bindungen werden Tracing-Substanzen entweder in die
Zelle injiziert oder in der Nähe der Zelle appliziert. Die
Substanzen werden von der Zelle aktiv aufgenommen und
entweder anterograd in Richtung Axonterminalien oder
retrograd Richtung Zellkörper transportiert. (B) Einige Tra-
cing-Substanzen können den synaptischen Spalt überwin-
den und werden über mehrere neuronale Schaltstellen über
weite Bereiche im Gehirn transportiert. Hier werden durch
den anterograden Transport die afferenten und durch den
retrograden Transport die efferenten Projektionen markiert
durch die gesamte Zelle vom Dendritenbaum bis
zum axonalen Endknöpfchen. Meist werden die
Substanzen in vivo in das Gehirn von lebenden
Tieren injiziert. Nach einigen Tagen kann das Ge-
webe dann entnommen und die Tracer nachgewie-
sen werden. Neben in vivo-Injektionen kann man
auch dickere Gewebeschnitte, wie sie z.  B für die
Elektrophysiologie verwendet werden (7  Kap.  5),
anfertigen, um die neuronalen Verknüpfungen zu
untersuchen. Da die physiologischen Prozesse in
einem Slice nicht so lange aufrechterhalten werden
können und der Transport der applizierten Sub-
stanzen einige Zeit in Anspruch nimmt, können
mit solchen Präparaten jedoch keine sehr weitrei-
chenden Projektionen untersucht werden. Zudem
141 6
weitreichende Projektionen meist unterbrochen.
Oft werden Tracing und Elektrophysiologie auch
kombiniert. Man kann z. B. nach der elektrophysi-
ologischen Messung einer Zelle eine Substanz über
die Messelektrode injizieren und die untersuchte
Zelle über die Zellmorphologie und ihre Verbin-
dungen zu anderen Zellen im Anschluss näher
charakterisieren. Die für die Tracing-Studien ver-
wendeten Substanzen haben entweder fluoreszente
Eigenschaften und können in Schnittpräparaten di-
dasen gekoppelt und werden über einen Enzymre-
aktion nachgewiesen (7  Kap.  6.3.1 ). Eine Übersicht
über einige häufiger verwendete Tracer-Substanzen
findet sich in (. Tab. 6.2).
Da man meist nicht nur die nächsten Nachbarn
eines Neurons identifizieren, sondern gegebenen-
falls auch die Verbindungen über mehrere Schalt-
stellen und ganzer neuronaler Netze untersuchen
möchte, benötigt man Tracer, die von einer Zel-
le an die nächste weitergeben werden und somit
den synaptischen Spalt überwinden können. Hier
kommen entweder tritzierte, also mit Tritzium ge-
koppelte Aminosäuren zum Einsatz, die dann mit
Hilfe der Autoradiographie nachgewiesen werden,
oder Pflanzenlektine, die für den enzymatischen
Nachweis an Peroxidasen gekoppelt sind. Darüber
hinaus wurden in den letzten Jahren virale Systeme
etabliert, die dazu in der Lage sind, in einer Zelle
infektiöse Partikel zu bilden, welche dann wiede-
rum Nachbarzellen befallen können. Meist werden
Herpes- oder Rabiesviren verwendet, die je nach
Spezies in anterograder oder retrograder Richtung
wandern. Über die virale Infektion kommt es zur
Expression von fluoreszierenden Proteinen und
man kann so verbundene Neuronenpopulationen
in Schnittpräparaten schnell identifizieren. Da es
allerdings auch passieren kann, dass benachbarte
nicht-synaptisch verbundene Zellen infiziert wer-
den, versucht man über verschiedene gentech-
nische Manipulationen das virale Tracing soweit
zu verbessern, dass es nur in wirklich verbundenen
Zellen zu Expression der fluoreszenten Proteine
kommt. Neben dem unspezifischen Befall benach-
barter Nervenzellen kann auch die virale Infek-
tion selbst ein Problem darstellen, denn es kann
zum Absterben der Nervenzellen und zur Infekti-
 142 Kapitel 6 • Anatomische Untersuchung des Nervensystems

. Tab. 6.2 Übersicht über häufig verwendete Tracer-

wickelte GRASP-Technologie (GFP reconstitution
Substanzen across synpatic partners), die der Bimolekularen
Fluoreszenz-Komplementation (BIFC; 7 Kap. 3.4.7 )
Tracer Richtung zur Untersuchung der Proteininteraktion sehr äh-
Biocytin retrograd und anterograd
nelt. Bei GRASP nutzt man zwei Teilfragmente des
grünfluoreszierenden GFP's, welche in zwei mitein-
Lucifer Yellow retrograd und anterograd
ander verbundene Zellen transfiziert werden. Über
DiI, DiO retrograd und anterograd
verschiedene genetische Modifikationen kann man
Biotinylierte Dextrana- retrograd und anterograd
erreichen, dass die Teilproteine an die Synapsen
mine (BDA)
transportiert werden und dort in den synaptischen
Meerrettichperoxidase retrograd und anterograd
Spalt ragen. Da der synaptische Spalt nur 100 nm
Weizenkeim-Agglutinin retrograd und antero-
breit ist, kommen die beiden Teilfragmente in un-
(WGA) grad;
mittelbare Nähe und können so gemeinsam das
6 Phaseolus vulgaris- leu-
transsynaptisch
anterograd
fluoreszierende Protein bilden und die synaptische
coagglutinin (PHA-L) Verbindung zwischen zwei Neuronen visualisieren.
Fluoreszente Mikro- retrograd Auch wenn dieses System bisher nur für C. elegans
partikel etabliert ist, hat es großes Potenzial, und es ist nur
Fluoro-Gold retrograd einen Frage der Zeit, bis dieses Verfahren auch er-
Diamidino Yellow retrograd folgreich für Verbindungsstudien am Säugergehirn
Fast blue retrograd
eingesetzt werden kann.
Cholera Toxin, Unterein- retrograd
heit B (CTB)
Tetanus Toxin, Fragment transsynaptisch
Literatur und World-Wide-Web-Links
C (TTC)
Web-Ressourcen:
Pseudorabies Virus transsynaptisch
Genexpression:
Herpes Simplex Virus transsynaptisch http://mouse.brain-map.org
(HSV) www.gensat.org
Tritzierte Aminosäuren transsynaptisch Anatomie des Gehirns:
(3H-Proline, 3H-Leucin) http://www.mbl.org/mbl_main/atlas.html
http://www.hms.harvard.edu/research/brain/
http://www.brainnav.com/home

on des zu untersuchenden Organismus kommen.

Allerdings konnten durch neuere gentechnische
Manipulationen die viralen Tracer bereits soweit
verbessert werden, dass sie weniger pathogen sind,
weniger unspezifisch nicht verbundene Nervenzel-
len infizieren und selektiver bestimmte Neuronen-
typen befallen.
kGRASP
Da jede Nervenzellen nicht nur eine Verbindung zu
einer Nachbarzelle hat, sondern tausende synapti-
sche Kontakte ausbilden kann, hat der Experimen-
tator es schwer, wenn er genau wissen will, über
welche Synapsen zwei Neurone miteinander ver-
bunden sind. Ein vielversprechender Ansatz, der
im wahrsten Sinne des Wortes Licht ins Dickicht
der Verbindungen bringt, ist die recht neu ent-
Stereology:
Glaser JR, Glaser EM (2000) Stereology, morphometry, and
mapping: the whole is greater than the sum of its parts.
J Chem Neuroanat 20, 115–126.
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