Manual de Microbiología General v05

UNIVERSIDAD CENTRAL DEL ECUADOR
FACULTAD DE CIENCIAS QUÍMICAS
MANUAL DE LABORATORIO DE
MICROBIOLOGÍA GENERAL
Elaborado por:
Dra. Rommy Terán. MSc.
Dra. Ana Poveda. PhD.
Docentes del área de formación básica.

CÓDIGO: PPL-LAB-01-MG
Versión: 05
GUIA DE PRACTICAS DE
Fecha de vigencia: 03/2018
MICROBIOLOGÍA
UCE- FAC.CCQQ GENERAL
LABORATORIO
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GENERAL
CONTENIDO
Contenido...................................................................................................................................................... 2
GENERALIDADES DEL CURSO PRÁCTICO ....................................................................................................... 3
Seguridad en el laboratorio. ......................................................................................................................... 4
PRACTICA N° 1: Medios de cultivo microbiológicos y método de siembra por estría. ................................. 6
PRACTICA N° 2: Técnicas de tinción simple y diferencial. ........................................................................... 15
PRACTICA N° 3: Movilidad bacteriana y tinción de estructuras: endosporas y cápsulas. Resistencia de
endosporas.................................................................................................................................................. 21
PRÁCTICA N°4: crecimiento microbiano. Recuento directo e indirecto del número de células totales de
Escherichia coli en cultivo líquido y crecimiento microbiano según las necesidades de oxígeno .............. 28
PRACTICA N° 5: Recuento directo de células viables. ................................................................................. 35
PRACTICA N°6: Sensibilidad bacteriana a los antibióticos. Antibiograma. ................................................. 39
Práctica N° 7. Metabolismo microbiano I. Pruebas bioquímicas en bacterias Gram negativas. ................ 44
PRACTICA N° 8. Metabolismo microbiano II y Mecanismos de patogenicidad microbiana. Cocos Gram
positivos del género Staphylococcus .......................................................................................................... 50
Práctica N° 9. Efecto de la radiación UV sobre el crecimiento microbiano. ............................................... 53
PRACTICA N° 10. Transformación de Escherichia coli con plásmido pUC18 (AmpR, LacZ)......................... 56
Recursos bibliográficos para la clase. ......................................................................................................... 61
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GENERAL
GENERALIDADES DEL CURSO PRÁCTICO

Durante este curso el estudiante se entrenará en las técnicas microbiológicas básicas para el
manejo de microorganismos. El estudiante seguirá protocolos para el contaje, observación, aislamiento
e identificación de microorganismos patógenos y no patógenos.
Objetivos del curso:
- Adquirir destreza en el manejo de cultivos microbiológicos.

- Aplicar los conocimientos teóricos en las sesiones prácticas.
- Comprender el fundamento de las metodologías empleadas en el laboratorio.
- Aprender a trabajar en equipo.
- Incentivar la actitud crítica e investigativa en los alumnos.
Modalidad de la clase práctica:

Los estudiantes asistirán a una sesión de laboratorio semanal, la misma que se desarrollará en
dos partes: la primera será la explicación de lo que se va a realizar, para lo cual los alumnos DEBEN leer
la guía, de lo contrario perderán puntos en desempeño, y la segunda parte será experimental en la que
los alumnos trabajarán en grupos pequeños y les será asignado un código individual y grupal. Este
código será usado para ETIQUETAR adecuadamente tubos, cajas y demás material para su fácil
identificación. TODOS los estudiantes deben acudir al laboratorio para leer los resultados de las
prácticas y firmar en la hoja de control de asistencia, de lo contrario no podrán presentar el cuaderno de
laboratorio.
Evaluación:
Los alumnos serán evaluados oralmente tanto sobre temas revisados en las prácticas anteriores,
como los que se van a realizar.
La nota de laboratorio es sobre 6 ptos distribuidos de la siguiente manera:
Evaluación práctica de laboratorio (Aula virtual): 5 ptos
Comportamiento en el laboratorio: 1 pto
Cuando sea necesario se deben especificar los nombres científicos de los microorganismos de la
siguiente manera, primero el género con la primera letra mayúscula y luego la especie escrita
totalmente en letras minúsculas. Tanto el género como la especie deben escribirse en cursiva (en
computadora) o subrayado (en el cuaderno). Ejs:
Escherichia coli (en computadora) o Escherichia coli (en el cuaderno).
Escherichia es el género y coli es la especie.
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GENERAL
Nombres científicos mal escritos implicarán disminución en la nota del cuaderno, evaluaciones,
presentaciones y trabajos escritos de la materia en general.
Políticas y requerimientos de la clase:

CADA estudiante debe utilizar un mandil blanco, cifrado con su nombre, un marcador permanente punta
fina para vidrio (evite el de color rojo), asa y aguja de inoculación, un cuaderno cocido y el manual de
laboratorio impreso.
• Se prohíbe el uso de celulares o dispositivos electrónicos.

• Se requiere que los estudiantes preparen medios de cultivo e implementos, laven el material y
mantengan limpia su área de trabajo.
• Se requiere que los estudiantes sean responsables en el manejo de equipos y materiales del
laboratorio. Si no sabe cómo usar un equipo o instrumento debe solicitar ayuda. Cualquier
conducta negligente que implique daño de los bienes del laboratorio será sancionada y el
estudiante deberá hacerse responsable de su arreglo o reposición.
• Si algún estudiante rompe material de vidrio debe NOTIFICAR a la profesora o ayudante y colocar
el material en el sitio destinado para material de vidrio roto.
• Los estudiantes deben comprometerse a reponer el material de vidrio roto durante el semestre.
• Los estudiantes cuidarán los bienes materiales del Laboratorio de Microbiología y respetarán los
de sus compañeros.
• NO se aceptará la presentación de cuadernos fuera de la fecha límite de entrega.
• Los estudiantes que no justifiquen su inasistencia a alguna práctica tendrán la nota de cero en el
reporte correspondiente.
• Los estudiantes deben asistir puntualmente a las prácticas y evaluaciones.
• Las prácticas de laboratorio y las evaluaciones NO SON RECUPERABLES.
• Los estudiantes serán honestos y responsables en su trabajo, todo acto de plagio comprobado
por el docente, será sancionado con la nota de cero sea en informes, trabajos o cuadernos.
• Los estudiantes mantendrán un trato respetuoso con todo miembro de la comunidad
universitaria.
Seguridad en el laboratorio.
Los laboratorios microbiológicos constituyen medios ambientes de trabajo especiales,
generalmente únicos, que pueden presentar riesgos de enfermedades infecciosas identificables para las
personas que se encuentran en o cerca de ellos. Se han reportado casos de infecciones adquiridas en el
laboratorio, donde el descuido, la negligencia o las malas técnicas en la manipulación de materiales
infecciosos han sido algunas de las causas.
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GENERAL
Equipos de seguridad (barreras primarias) incluyen las cabinas de bioseguridad y el equipo de

protección personal.
Es obligatorio que cada estudiante lleve su equipo de protección personal en todas las prácticas de
laboratorio:
• Guantes quirúrgicos o de nitrilo de su talla (2 pares por práctica)

• Mandil limpio con mangas y con todos los botones.
• Zapatos cerrados (no se admite el uso de sandalias o zapatos sin punta).
• Toca y mascarilla.
Normas de bioseguridad para todo el personal del laboratorio:
1. Se prohíbe fumar, comer, beber o maquillarse.
2. En caso de que el estudiante tenga alguna herida, esta debe ser cubierta adecuadamente con
curita o gasa antes de iniciar la práctica.
3. Se prohíbe el pipeteo con la boca.
4. En caso de derrames de agentes químicos o biológicos se debe notificar inmediatamente, de lo
contrario puede ser la causa de lamentables accidentes.
5. Si se producen eventos como cortes, pinchazos o quemaduras deben ser inmediatamente
notificados al docente o ayudante de cátedra.
6. Se designará en cada grupo de trabajo un alumno y un reemplazo que se encargarán de activar el
extintor en caso de ser necesario.
7. Por razones de seguridad no se admite el ingreso de estudiantes que no tomen la asignatura.
8. Todo material cortopunzante (agujas, palillos, hisopos, porta y cubre objetos, tubos rotos) debe
ser colocado en el recipiente destinado para ese fin.
9. Materiales que hayan estado en contacto con cultivos bacterianos o fluidos biológicos, los guantes
quirúrgicos usados y demás material de protección, DEBEN desecharse en el tacho con FUNDA
ROJA que es SOLAMENTE PARA DESECHOS INFECCIOSOS, mientras que la basura común se coloca
en los tachos con FUNDA NEGRA. Los estudiantes que incumplan esta norma serán sancionados.
10. Se debe usar los mecheros y lámparas de alcohol con cuidado, evitando contacto con piel y
cabello.
11. Se debe limpiar el área de trabajo con alcohol etílico antes y después de ser usada.
12. NUNCA abandone el laboratorio sin lavarse bien las manos, su salud está en riesgo sino lo hace.
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GENERAL
PRACTICA N° 1: Medios de cultivo microbiológicos y método de siembra por

estría.
Unidad curricular: 1
Objetivos:
• Describir los diferentes tipos de medios de cultivo y su utilización.

• Preparar y esterilizar medios de cultivo en caja.
• Aislar bacterias en cajas Petri mediante la técnica de estriamiento, tomando en cuenta las técnicas
asépticas de siembra.
• Diferenciar las características y morfología de las colonias bacterianas.
Fundamento y método:
En el laboratorio los microorganismos crecen en medios de cultivo que cumplen con requisitos
nutricionales para su desarrollo.
Los medios de cultivo contienen una fuente de energía, carbono, nitrógeno, azufre, fósforo, oxígeno,
soluciones estabilizadoras del pH, trazas de elementos denominados microelementos, factores de
crecimiento, agua y otros ingredientes para permitir el crecimiento del microorganismo deseado. Con
frecuencia se utilizan suplementos como antibióticos o vitaminas.
Clasificación de los medios de cultivo.
En Microbiología podemos encontrar varias clasificaciones de los medios de cultivo de acuerdo a lo
siguiente:
Por su composición química.
Se usan dos medios de cultivo, los químicamente definidos (simples) y los no definidos (complejos). Los
primeros. Sin embargo los medios complejos están compuestos por sustancias nutritivas, pero no
definidas químicamente.
• Medios químicamente definidos o simples: se preparan añadiendo cantidades conocidas de
compuestos orgánicos o inorgánicos. Por tanto se sabe la composición química exacta del medio.
Los medios químicamente definidos a su vez pueden ser medios selectivos, que se caracterizan
por tener compuestos que inhiben el crecimiento de determinados microorganismos y por
potenciar el crecimiento del microorganismo requerido.
• Medios químicamente indefinidos o complejos: son medios que emplean lisados de caseína, de
carne, de soya, de levadura o cualquier sustancia altamente nutritiva cuya composición es
químicamente indefinida.
Por su estado físico.
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GENERAL
Esta clasificación se basa en la cantidad de agente solidificante que existe. El agar es uno de los agentes
solidificantes más comúnmente utilizados, y es un polisacárido derivado de las algas rojas. Se distinguen
tres tipos de medios:
Medios sólidos: agar 1,5%. Se preparan en caja Petri o en tubo (agar inclinado).
Medios semisólidos: agar 0,7 %. Se preparan en tubo.
Medios líquidos: no contiene agar. Son los llamados caldos nutritivos y se preparan en tubos o
Erlenmeyers.
Por su selectividad de crecimiento.
Medios no selectivos: son medios en los que crece una amplia variedad de microorganismos sin
restricción. Ej. Agar nutritivo, agar Mueller Hinton, tripticasa soya agar.
Medios selectivos: son medios que contienen agentes que favorecen el crecimiento de ciertos
microorganismos e inhiben el crecimiento de otros. Ej. Agar manitol contiene altas concentraciones de sal
de manera que solo microorganismos tolerantes a estas altas concentraciones como los estafilococos
pueden crecer.
Medios diferenciales: son medios empleados en la identificación de diferentes grupos de
microorganismos de acuerdo a sus propiedades metabólicas. Ej. En agar MacConkey se puede distinguir
bacterias que fermentan lactosa de las que no tienen esta característica.
Equipos, medios de cultivo y materiales:
INDICACIONES EQUIPOS
Medios/materiales
Incubadora de microorganismos
Manitol o
1 caja/estudiante Autoclave
MacConkey
balanza
XLDA 1 caja/estudiante
cocineta
Asas de inoculación individuales
mecheros
CEPAS BACTERIANAS
Staphylococcus aureus en TSA
Escherichia coli en TSA
Procedimiento:
1ra parte: PREPARACIÓN DE MEDIOS DE CULTIVO EN CAJA PETRI.
En esta práctica se van a preparar medios sólidos que se distribuyen en cajas Petri. La mayoría de los
medios que se utilizan en el laboratorio de Microbiología se esterilizan por calor húmedo en el autoclave.
Sin embargo, algunos compuestos de los medios de cultivo son termolábiles y se degradan por el calor,
por lo cual no pueden esterilizarse en el autoclave (figura 1.1). Es importante que el estudiante lea las
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GENERAL
etiquetas de los medios de cultivo cuidadosamente antes de preparar un medio de cultivo pues esta
información viene proporcionada en la etiqueta de los envases.
Un ejemplo típico son los aminoácidos, algunos son termolábiles así que en este caso se puede esterilizar
por filtración y agregarlos al medio base. Cuando el medio base se enfría hasta aproximadamente 45°C,
se adicionan las cantidades requeridas de aminoácidos, siempre en condiciones asépticas.
Otros medios, como el Agar SS y el XLDA requieren para su preparación tener agua destilada previamente
esterilizada a la que se adiciona el medio en polvo, en condiciones de esterilidad.
Así pues, dependiendo del medio, su composición y del experimento a realizar, deberemos considerar el
método más apropiado para su preparación. En esta práctica los estudiantes realizarán la preparación de
un medio que se autoclava y de uno que no se autoclava.
Figura 1.1 Autoclave para esterilizar por calor húmedo.
Lo primero que se debe hacer antes de preparar medios, es buscar el nombre del medio en la “LISTA DE
MEDIOS DE CULTIVO” con que cuenta el laboratorio y determinar si el medio que va a preparar se
AUTOCLAVA o NO (esta información está en la etiqueta de cada medio).
Si el medio se autoclava el procedimiento que debe seguir es el siguiente:
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GENERAL
1. Se determina el volumen de medio de cultivo a preparar, esto depende del número de cajas y del
volumen de medio por caja, por lo general 25 ml. Todos los cálculos de cuánto debe pesar y del
volumen de medio a preparar, deben hacerse en el cuaderno de laboratorio. NO se aceptará el
uso de hojas sueltas.
Ejemplo:
Preparar 20 cajas de TSA (Tripticasa Soya Agar)
Volumen de medio de cultivo a prepararse = Número de cajas ∗ Volumen de medio por caja
Volumen de medio de cultivo a prepararse = 20 ∗ 25 ml

Volumen de medio de cultivo a prepararse = 500 ml
2. Se calcula la cantidad de medio de cultivo a pesar, esto depende del volumen de medio a
prepararse y de la relación peso-volumen del medio.
La relación peso-volumen es propia de cada medio de cultivo, está dada por el fabricante y se encuentra
detallada en el frasco. Esta relación por lo general es a un litro.
Continuando con el ejemplo anterior:
• La relación peso-volumen del medio TSA marca MERCK indicada en el frasco es: 40g/L o 40g/1000
ml.
Cálculo (se realiza un regla de tres simple):
1000 ml de medio 40 g medio sólido
500 ml de medio Xg
500 𝑚𝑙 𝑑𝑒 𝑚𝑒𝑑𝑖𝑜 ∗ 40 𝑔 𝑚𝑒𝑑𝑖𝑜 𝑠ó𝑙𝑖𝑑𝑜

𝐶𝑎𝑛𝑡𝑖𝑑𝑎𝑑 𝑑𝑒 𝑚𝑒𝑑𝑖𝑜 𝑑𝑒 𝑐𝑢𝑙𝑡𝑖𝑣𝑜 𝑎 𝑝𝑒𝑠𝑎𝑟 =
1000 𝑚𝑙 𝑑𝑒 𝑚𝑒𝑑𝑖𝑜
𝐶𝑎𝑛𝑡𝑖𝑑𝑎𝑑 𝑑𝑒 𝑚𝑒𝑑𝑖𝑜 𝑠ó𝑙𝑖𝑑𝑜 𝑎 𝑝𝑒𝑠𝑎𝑟 = 20 𝑔
3. Se ETIQUETA con el marcador de punta fina un Matraz de Erlenmeyer con el nombre del medio,
el número de cajas a preparar y el código de la persona o grupo que lo preparó. La capacidad del
Matraz de Erlenmeyer debe ser MAYOR al volumen de medio de cultivo a preparar (etiquetar el
matraz es muy importante, si ud no lo etiqueta perderá puntos en desempeño).
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GENERAL
Disolver los 20g del medio en 250ml de agua destilada en un matraz de 1000 ml, una vez disuelto
completar el volumen con 250 ml más.
Se tapa el matraz con papel aluminio con pequeños agujeros y se calienta hasta disolución total
en la cocineta a temperatura baja, para ello se agita repetidamente sin abandonar el medio en la
hornilla. SE DEBE USAR GUANTES DE CALOR y evitar que el medio de cultivo se derrame, lo cual
puede causar QUEMADURAS GRAVES y pérdida del material.
4. Para autoclavar el medio, se reemplaza el papel aluminio por un tapón de gasa que se cubre con
papel empaque y se sujeta con piola. Se coloca en el papel del tapón la misma información que
se escribió en el matraz.
5. Una vez que el medio sale del autoclave, se procede a la repartición en cajas, para lo cual se
trabaja en el interior de la cabina, que ha sido previamente desinfectada con alcohol etílico. Se
enciende el mechero y se procede a sacar las cajas Petri estériles de su empaque y etiquetarlas
en la BASE con el nombre del medio.
6. Antes de distribuir el agar en cajas Petri, se debe esperar a que el medio alcance la temperatura
de distribución que es de 45-50ºC. Si la temperatura es más alta, habrá excesivo vapor de agua
en las cajas, lo cual puede afectar la calidad de los cultivos, y si es más baja puede empezar a
solidificarse y no podrá ser distribuido.
7. Las cajas tapadas se dejan solidificar a temperatura ambiente (aproximadamente 1 hora), luego
se guardan en refrigeración con la tapa hacia abajo, en una funda plástica y etiquetada con el
nombre del medio, el número de cajas que contiene y el grupo al que pertenecen.
Si el medio NO se autoclava el procedimiento que debe seguir es el siguiente:
Leer cuidadosamente la PREPARACIÓN (instrucciones del fabricante) del medio de cultivo, está
información se localiza en el frasco que contiene el medio. Identificar la frase: “NO AUTOCLAVE”. Si no
está seguro de cómo preparar un medio, debe solicitar AYUDA al encargado/a del laboratorio.
1. Se determina el volumen de medio de cultivo a preparar y se manda a autoclavar un matraz con

la cantidad de agua destilada que se calculó.
2. Se calcula la cantidad de medio de cultivo y se pesa en la balanza que está dentro de la cabina
(que ha sido previamente desinfectada) y está con el mechero encendido.
3. Una vez que el agua sale del autoclave es llevada a la cabina donde se procede a colocar
asépticamente, el medio en polvo pesado.
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4. Se vuelve a tapar el matraz y se calienta el medio hasta disolución total, para ello se agita
repetidamente (evitando el sobrecalentamiento) y cuidando que el medio de cultivo no se
derrame. No quite el tapón durante en calentamiento, recuerde que el medio está ESTERIL.
5. Para los pasos finales referirse al numeral 7 y 8 del procedimiento para preparar medios que se
autoclavan que se detalló arriba.
2da parte: METODO DE SIEMBRA POR ESTRIA.
En Microbiología es una técnica común el transferir microorganismos de un cultivo a otro, a esto se

denomina subcultivo. La finalidad de usar la técnica de estriamiento para hacer un subcultivo, es tener
COLONIAS AISLADAS de microorganismos. En esta práctica se pretende que los estudiantes hagan el
subcultivo de microorganismos que están en un medio líquido (o sólido) a otro medio sólido en cajas Petri
por medio de estriamiento. La finalidad es que aíslen colonias y puedan apreciar el crecimiento de las
bacterias en diferentes medios de cultivo.
Procedimiento:
1. Las cajas que contienen los medios de cultivo deben ambientarse por unos minutos antes de
empezar el trabajo y debe asegurarse que no tengan exceso de agua.
2. Se anota el color del medio antes de sembrar los microorganismos, pues esto ayudará luego en la
interpretación de los resultados.
3. Se etiquetan las cajas en la BASE con la información necesaria. Ej. Código personal, nombre del
microorganismo y la fecha.
4. Se limpia el área de trabajo con alcohol etílico para lograr un ambiente aséptico y evitar la
contaminación del cultivo.
5. Se enciende el mechero o la lámpara de alcohol y se esteriliza el asa de atrás hacia adelante en la
zona más caliente de la llama (la técnica será indicada en la práctica).
6. Si el cultivo a partir del cual se hará el subcultivo es un caldo, se destapa el tubo con cuidado y se
flamea la boca en el mechero. Se procede a tomar un inóculo con el asa fría. Se flamea el tubo
nuevamente y se tapa.
7. Si el cultivo es sólido, se destapa cuidadosamente la caja y se procede a tocar una colonia aislada
con el asa fría y luego se estría el material en la nueva caja de cultivo.
8. Se procede a realizar el estriamiento en la caja de cultivo como se observa en la fig 1.2.
9. Se esteriliza el asa cuidando de no generar aerosoles (pequeñas gotas que pueden contener
microorganismos).
10. Se coloca la caja en la incubadora con la base hacia ARRIBA por 18 a 24 horas a 37°C a este proceso
se denomina “INCUBACIÓN”.
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GENERAL
11. Al día siguiente se procede a leer los resultados y se anotan en el cuaderno. Se observa si hubo
cambio en el color del medio así como las características de las colonias (forma, tamaño, color y
bordes), como se observa en la fig 1.3.
Fig 1.2. Ejemplo de cómo se puede estriar microorganismos en caja.
Fig. 1.3. Ejemplos de las características de las colonias.
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GENERAL
Resultados:
Nombre del medio sólido:
Color del medio antes de sembrar
Color del medio después del crecimiento
Microorganismo sembrado
Crecimiento (si o no)
Es un medio selectivo, diferencial o

ambos? Por qué?
Colonias aisladas (si o no)
Color de las colonias aisladas
Tamaño de las colonias aisladas
Forma de las colonias aisladas
Elevación de las colonias aisladas
Borde de las colonias aisladas
Cuestionario:
1. Siguiendo las instrucciones detalladas en el manual Merck o Difco, describa todos los pasos para
preparar lo siguiente:
a. 15 cajas de tripticasa soya agar (TSA).
b. 30 cajas de agar EMB (Eosin methylene blue lactosa sucrose agar)
c. 10 cajas de agar VRB (Violet red bile agar)
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GENERAL
2. Indique las condiciones de temperatura, presión y tiempo que el proceso de autoclavar con calor
húmedo requiere.
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GENERAL
PRACTICA N° 2: Técnicas de tinción simple y diferencial.

Objetivos:
• Reconocer la diferencia entre una tinción simple y diferencial.

• Aprender el procedimiento adecuado para preparar un frotis bacteriano.
• Distinguir las diferentes morfologías bacterianas por medio de la tinción.
Los microorganismos se colorean para aumentar el contraste de las células con el medio que las rodea, lo
cual mejora su visualización y permite distinguir formas y tamaños. También se pueden diferenciar grupos
bacterianos por su reacción frente a determinados colorantes.
Tinción simple
Se refiere al uso de UN SOLO COLORANTE para crear contraste entre el microorganismo y el medio que lo
rodea. Este tipo de tinción es sencilla y aporta información de la forma de la célula, el tamaño y su manera
de agruparse. Se emplean colorantes básicos como el cristal violeta, cabolfuscina y azul de metileno.
Tinción diferencial.
En la tinción diferencial se utiliza más de un colorante. Un ejemplo de tinción diferencial ampliamente

usada en Microbiología, para diferenciar bacterias, es la tinción Gram (llamada así por el científico danés
Christian Gram, 1853-1938), en la que a más de ser útil para evidenciar la forma, tamaño y la manera de
agruparse de los microorganismos, sirve para distinguirlos entre Gram positivos y Gram negativos
dependiendo del color que adoptan después de la coloración, lo cual está relacionado con las
características de la pared celular bacteriana.
El primer paso consiste en colorear el frotis con un colorante básico denominado cristal violeta que tiñe
la pared celular o peptidoglicano de TODAS las bacterias, el lugol (solución a base de iodo) que es el
segundo colorante es un mordiente cuya función es incrementar la interacción entre la pared bacteriana
y el cristal violeta. El frotis es luego decolorado con una solución de etanol 95% o isopropanol-acetona
(3:1 v/v). Los microorganismos GRAM POSITIVOS (pared celular gruesa) retienen el complejo cristal
violeta-lugol en el paso de decoloración, mientras que los GRAM NEGATIVOS (pared celular delgada)
pierden el complejo y se decoloran. Finalmente, al agregar el colorante de contraste, la safranina de color
rojo, las bacterias que dejaron ir al cristal violeta o sea las Gram negativas se tiñen con este colorante y
muestran una coloración roja o rosada.
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GENERAL

CEPAS BACTERIANAS EQUIPOS
Cultivo en TSA o manitol de Staphylococcus aureus microscopios
mecheros
Cultivo en TSA o MacConkey de Escherichia coli
Cultivo en TSA de Bacillus spp
Reactivos
Cristal violeta, lugol, alcohol cetona, safranina, aceite de inmersión
Agua destilada
Placas portaobjetos
Procedimiento:
- Se prepara el frotis (fig 2.1), lo cual comprende las siguientes etapas:
1) Extensión de la muestra. Con un lápiz de cera se etiqueta la placa en uno de los bordes con el
número de identificación correspondiente y el nombre del microorganismo. Si se va a realizar la
coloración a partir de un cultivo en medio líquido, se coloca con el asa (previamente esterilizada)
una gota de cultivo sobre un portaobjetos limpio y se extiende. Si la muestra proviene de un
cultivo en medio sólido, se coloca primero una gota de agua estéril o solución fisiológica estéril
sobre el portaobjetos y se toma la muestra con el asa (previamente esterilizada), se homogeniza
bien con el asa y se extiende.
2) Secado. Se deja secar la placa portaobjetos al ambiente.
3) Fijación. Un vez seco se fija el frotis por calor, para lo cual se pasa la placa portaobjetos tres
veces por la llama del mechero. La fijación por calor es el método más utilizado y su propósito es
matar los microorganismos, coagular el protoplasma de la célula y adherir la preparación al
portaobjetos. Sin la fijación se lavaría el frotis durante el proceso de tinción.
- Tinción simple:
1. Una vez preparado el frotis se procede a realizar la coloración.

2. Se coloca la placa en un soporte para tinciones.
3. Se cubre con solución de azul de metileno y se deja actuar durante 1 min. Si se usa cristal violeta
se deja por 30 segundos.
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GENERAL
4. Transcurrido el tiempo se lava con agua, se elimina el exceso de agua de la placa con papel
absorbente y se coloca una pequeña gota de aceite de inmersión.
5. Se observa en el microscopio óptico con el lente de 100X.
- Tinción Gram:
1. Una vez preparado el frotis, se procede a su coloración.

3. Se cubre con solución de cristal violeta y se deja actuar durante 1 min.
4. Transcurrido el tiempo se lava con agua.
5. Se cubre con lugol y se deja actuar durante 1 min.
6. Transcurrido el tiempo se lava con agua.
7. Se cubre la placa con alcohol-cetona y se deja actuar durante 20 segundos moviendo suavemente
la lámina. Adicionar la solución decolorante hasta que no quede cristal violeta en la placa. *El paso
de decoloración es CLAVE para lograr una tinción satisfactoria y no debe sobrepasar el tiempo
recomendado.
8. Se lava con agua.
9. Se cubre con safranina y se deja actuar durante 30 segundos.
10. Se lava con agua, se elimina el exceso de agua de la placa con papel absorbente y se coloca una
pequeña gota de aceite de inmersión.
11. Se observa en el microscopio óptico con el lente de 100X. Las bacterias Gram positivas se verán
de color azul-violeta y las Gram negativas rojas o rosadas.
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GENERAL
Resultados:
Tinción simple OBSERVACION AL MICROSCOPIO.

Nombre del microorganismo:
Morfología: (Cocos o Bacilos)
Forma de agrupación
(cadenas, pares, racimos de
uvas):
Tinción diferencial GRAM POSITIVO GRAM NEGATIVO
Tinción Gram
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MICROBIOLOGÍA
LABORATORIO
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GENERAL
Cuestionario:
1. Explique por qué en la coloración Gram se recomienda el uso de cultivos de máximo 24 horas.
2. Complete la siguiente tabla DIBUJANDO lo que ocurre con las bacterias en cada paso de la
tinción Gram y explique la función y el tipo de colorante en cada paso:
PASO GRAM GRAM FUNCION DEL COLORANTE BASICO

NEGATIVOS POSITIVOS O ACIDO
(cocos y bacilos) (cocos y bacilos)
cristal violeta
Colocar solución de
lugol
alcohol-cetona
safranina
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GENERAL
Fig 2.1. Preparación de un frotis bacteriano a partir de un medio sólido y líquido.
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GENERAL
PRACTICA N° 3: Movilidad bacteriana y tinción de estructuras: endosporas y

cápsulas. Resistencia de endosporas.
Objetivos:
• Seleccionar el tipo de tinción dependiendo de la estructura que se desea observar.

• Distinguir y reconocer endoesporas y cápsulas al observar al microscopio placas teñidas.
• Distinguir entre el movimiento bacteriano y el movimiento browniano al observar al microscopio
placas preparadas mediante la técnica de la gota pendiente.
• Validar la capacidad de las endosporas a resistir procesos físicos de control microbiano.
Movilidad bacteriana.
Muchos microorganismos son capaces de moverse porque poseen estructuras denominadas flagelos, los
mismos que son apéndices largos, delgados, de forma helicoidal, libres en un extremo y unidos a la célula
por otro.
La célula bacteriana puede tener uno o más flagelos dispuestos de manera distinta y en base a esa
disposición la flagelación puede ser:
- polar: uno solo flagelo en un extremo del cuerpo celular.
- anfítrica: un solo flagelo en cada uno de los dos extremos.
- lofótrica: penacho de flagelos en un extremo
- perítrica: flagelos alrededor de toda la célula
Endosporas bacterianas.
Ciertas especies bacterianas, en particular de los géneros Bacillus y Clostridium, producen elementos de
resistencia denominados endosporas debido a que se forman dentro de la célula.
A diferencia de la célula vegetativa, la endospora es muy resistente a condiciones adversas tales como
alta temperatura, baja humedad, radiaciones y agentes químicos. Es una forma de vida latente que puede
permanecer largos períodos como tal y cuando desaparecen las condiciones adversas pueden germinar.
También puede inducirse esa germinación mediante, por ejemplo, un shock térmico, es decir un
calentamiento a 80ºC.
Las endosporas son altamente impermeables a los colorantes, de manera que con las técnicas de
coloración comunes aparecerán como regiones sin teñir dentro de las células coloreadas. Por lo tanto,
para teñirlas, se deben usar métodos de coloración especiales; una vez coloreada, la endospora resiste
fuertemente la decoloración. La posición de la endospora dentro de la célula es característica y puede ser
central, subterminal o terminal.
Cápsulas.
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GENERAL
Muchas bacterias tienen una capa mucosa que las rodea, la cual se denomina comúnmente cápsula, su
composición así como su grosor varía entre especies de bacterias. Estas estructuras están formadas por
polisacáridos, polipéptidos y glucoproteínas y sirven para proteger a los microorganismos de la acción
fagocítica de las células de defensa del sistema inmune del huésped.

Cultivo en caldo de Klebsiella pneumoniae microscopios
Cultivo en caldo de Escherichia coli o mecheros
Pseudomonas aeruginosa
Cultivo en caja de Bacillus spp
Reactivos
Cristal violeta, verde de malaquita, tinta china, safranina, aceite de inmersión
Agua destilada
Placas portaobjetos, placas para movilidad, cubreobjetos
Procedimiento movilidad:
El método de la gota pendiente (fig 3.1) ayuda a observar la movilidad de bacterias vivas, no propiamente
la estructura flagelar de tal manera que no es un método de tinción de flagelos.
1. Con un palillo de dientes se coloca un anillo de vaselina alrededor de la concavidad de una placa
de depresión.
2. Se coloca con el asa de inoculación una pequeña gota del cultivo de Escherichia coli (previamente
homogenizado) en el centro de un cubreobjeto limpio.
3. La placa de depresión se coloca sobre el cubreobjeto de manera que la gota de cultivo protruya
hacia el centro de la concavidad. Se presiona suavemente.
4. Se voltea la placa de manera que el cubreobjetos está ahora encima.
5. Se examina al microscopio. Primero con el lente de menor aumento se localiza la gota y luego
usando aceite de inmersión se procede a observar con el lente de 100X. Se debe cerrar el
diafragma de manera que se incremente el contraste y mejore la visualización.
6. Se observa la forma de moverse de los microorganismos (corridas o tumbos). Hay que ser
cuidadoso para distinguir entre el movimiento Browniano y la movilidad bacteriana propiamente
dicha.
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GENERAL
7. Las placas usadas se descartan en una solución desinfectante pues los microorganismos están
viables.
Procedimiento para tinción de endosporas (Método de Schaeffer-Fulton)

1. Se prepara el frotis (referirse a la práctica 2)*.
*Para la observación de endosporas se partirá de un medio sólido del que se debe tomar una
cantidad considerable de muestra, de tal manera que el frotis sea grueso y concentrado.
3. Se cubre con solución de verde de malaquita y se calienta la placa pasándola cuidadosamente
sobre la llama del mechero. Una vez que se observe el desprendimiento de vapores, seguir
calentado la placa por 2 minutos. EVITAR que hierva o que se seque el colorante por
sobrecalentamiento. Se puede añadir más colorante de ser necesario.
4. Se espera que la placa se enfríe y se lava con agua, de lo contrario se puede romper o trizar por
el cambio brusco de temperatura.
5. Se cubre la placa con safranina y se deja actuar por 30 segundos.
6. Se lava con agua, se seca la placa con papel absorbente y se coloca una pequeña gota de aceite
de inmersión.
8. Las endosporas en libertad o en formación aparecen de color verde, mientras que el resto de la
célula y las formas vegetativas aparecen de color rojo.
Procedimiento para validar la resistencia de las endosporas a procesos físicos de control microbiano.
1. Se colocan tiras de papel filtro impregnadas con endosporas de Bacillus subtilis en el autoclave
(ciclo completo de esterilización), en agua hirviendo durante 10 minutos y bajo luz ultravioleta
durante 20 minutos.
2. Se anotan las condiciones de presión, tiempo y temperatura del ciclo de esterilización que se va a
monitorear.
3. Una vez que las endosporas han sido sometidas a los tres procesos, se toma con una pinza estéril
la tira y se coloca en 15 ml de caldo TSB. Los tubos se incubaran por 24 horas a 37 °C.
4. Al siguiente día se registra la turbidez o no en los tubos.
Control positivo: Se coloca en caldo TSB una tira sin ser sometida a ningún proceso físico y se incuba
según las condiciones antes mencionadas
Control negativo: Se incuba un tubo con 15 ml de caldo TSB y se incuba según las condiciones antes
mencionadas.
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GENERAL
Procedimiento para cápsula: Hay dos métodos para observar la cápsula en el laboratorio: el de Anthony
y el de Graham y Evans. En esta práctica seguiremos el de Graham y Evans.
1. En el extremo de la placa portaobjetos se mezcla una pequeña asada del cultivo de Klebsiella
pneumoniae con una pequeña cantidad de tinta china (2 gotas). No olvide etiquetar la placa en el
extremo donde no está la muestra.
2. Se extiende esta mezcla con la ayuda de una segunda placa.
3. Hay que permitir que la placa se seque al ambiente.
4. GENTILMENTE se enjuaga la placa con agua destilada de manera que el frotis no se pierda con el
lavado.
5. Se cubre la preparación con cristal violeta por 1 minuto.
6. Se enjuaga con agua.
7. Se tiñe con safranina por 1 minuto y medio.
8. Se lava con agua, se seca la placa con papel absorbente y se coloca una pequeña gota de aceite
de inmersión.
10. Si la cápsula está presente se observarán las bacterias rosadas o rojas rodeadas por una zona clara
y el fondo del campo estará oscuro.
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GENERAL
Resultados:
Tinción para endosporas OBSERVACION AL MICROSCOPIO.

Nombre del
microorganismo:

Tinción para cápsula OBSERVACION AL MICROSCOPIO.
Nombre del
microorganismo:
Gota pendiente para la observación de movilidad.
Describa lo que observó en

cuanto al movimiento de los
microorganismos
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GENERAL
Proceso físico al que se CRECIMIENTO (+ o -)

sometieron las endosporas
Control +
Control -
Cuestionario:
1. ¿Por qué en la tinción de endosporas se calienta la placa después de colocar verde de

malaquita?
2. En la tinción de cápsula, por qué no se usa la fijación por calor?
3. Qué procesos fueron efectivos en matar las endosporas y cuáles no? Consulte cuál es el
mecanismo de eliminación de endosporas en el caso de los que si funcionaron.
4. Explique el por qué de los resultados que observó para los controles positivo y negativo.
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Fig 3.1 Método de la gota pendiente para la observación de movilidad bacteriana.
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PRÁCTICA N°4: Crecimiento microbiano. Recuento directo e indirecto del

número de células totales de Escherichia coli en cultivo líquido y crecimiento
microbiano según las necesidades de oxígeno
Objetivo:
• Medir de la turbidez del cultivo (método indirecto) y comparar estos datos con los del recuento
del nº de células al microscopio (método directo).
• Comparar el crecimiento microbiano según las necesidades de oxígeno y relacionarlo con la
presencia de la enzima catalasa.
• Adquirir destreza en la siembra de microorganismos en caldo.
El crecimiento microbiano se define como un incremento en el nº de células, es decir, se refiere

al crecimiento de poblaciones. Este viene dado como consecuencia del crecimiento de cada célula
individual y su división celular. El crecimiento de un microorganismo depende de varios factores como:
1. El microorganismo en sí. Así por ejemplo, en condiciones óptimas Escherichia coli tiene un ciclo de vida
de 15-20 minutos, mientras que Mycobacterium tuberculosis lo tiene de 18 horas.
2. La composición del medio de cultivo. Las células crecerán más lentamente en un medio mínimo (MM)
que en un medio rico (MR) con todos los nutrientes. Dependiendo de la fuente de carbono y de la facilidad
con que la asimilen crecerán más o menos rápidamente (por ejemplo, crecen mejor con glucosa (Glc)
como fuente de carbono que con galactosa (Gal).
3. Las condiciones de incubación. Temperatura de incubación, la concentración de CO2 en la atmósfera

de cultivo y la agitación.
4. La procedencia y características del inóculo. La curva de crecimiento variará dependiendo de que se

parta de un cultivo estacionario o de uno en crecimiento exponencial, que se pase un cultivo crecido en
MM+Glc a MM+Gal o de MR a MM+Glc.
Existen varios métodos para medir el crecimiento microbiano:
1. MÉTODOS DIRECTOS: son aquellos en los que se cuenta el nº total de células en un volumen conocido
y así se estima el nº total en la población. Entre ellos:
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GENERAL
1.1. Recuento directo del nº de células al microscopio. Se utilizan portas especialmente diseñados para
el recuento celular y denominados cámaras de recuento. Existen varios tipos de cámaras de
recuento, una de ellas es la cámara Thoma que es la que nosotros utilizaremos. Este método tiene
el inconveniente de que no diferencia entre células viables y no viables. Es poco preciso.
1.2. Contadores electrónicos o citómetros de flujo. Las células son suspendidas en un fluido conductor
que pasa lentamente a través de una abertura fina por la que pasa una corriente eléctrica. Cada
célula que pasa produce un cambio en la conductividad y estos cambios o pulsos
convenientemente amplificados son registrados electrónicamente dando una medida directa del
nº de células en el medio. No diferencia entre células viables y no viables ni entre células o
partículas inertes.
1.3. Recuento de células viables. Haciendo diluciones apropiadas seguidas de siembra sobre placas
Petri podemos obtener crecimiento de colonias aisladas procedentes cada una de una única
célula. Si se multiplica por el factor de dilución tendremos el nº de células en cultivo. Sólo detecta
viables pero es un método lento y caro por el elevado número de placas que hay que utilizar para
que los resultados sean significativos.
2. MÉTODOS INDIRECTOS: son aquellos que utilizan parámetros distintos del nº de células, pero que
pueden relacionarse de forma directa con éste (masa celular, actividad metabólica, etc).
Ello es posible porque durante el crecimiento de un cultivo hay un aumento ordenado de todos los
constituyentes celulares y así la velocidad de crecimiento de la población puede estimarse por la velocidad
del incremento de cualquiera de estos parámetros. Entre los métodos indirectos se encuentran:
2.1. Determinación del peso seco. Se trata de medir la masa celular presente en un cultivo y estimar
el nº de células proporcional a ésta.
2.2. Determinación del nitrógeno celular. Medir el contenido proteico del cultivo.
2.3. Determinación del DNA
2.4. Determinación de una actividad metabólica según el tipo de microorganismo: consumo de

oxígeno (en aerobios), liberación de CO2 u otro producto de fermentación, aumento de la
concentración de alguna enzima constitutiva, incorporación en la célula de algún material
radiactivo, etc.
2.5. Medida de la turbidez del cultivo. Se basa en la capacidad de las células y partículas en general de
absorber y/o dispersar la luz que incide sobre ellas. Un cultivo celular aparece turbio porque las
células dispersan la luz que atraviesa la suspensión. La turbidez es proporcional al número de
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células y puede medirse utilizando un espectrofotómetro. El espectrofotómetro es un aparato

que hace pasar la luz a través de una suspensión celular y detecta la luz no dispersada. Este
instrumento mide la relación de intensidad entre la luz incidente y la emergente después de
atravesar la muestra. Cuanto mayor sea el nº de células mayor es la turbidez del cultivo o densidad
óptica (DO) y menor la cantidad de luz no dispersada que emerge tras atravesar la muestra. Por
tanto, la DO de un cultivo es proporcional a la densidad celular. Sin embargo, esto es así dentro
de ciertos límites, puesto que a elevadas concentraciones pueden formarse agregados celulares
y producirse un efecto “pantalla” de unas células sobre otras. Por tanto, en algunos casos será
necesario diluir la muestra antes de realizar la medida (ej. para hacer una dilución 1/10 se
mezclaría 1 ml de cultivo con 9 ml de medio de cultivo o agua). Cuando la dilución sea alta (mayor
de 1/10) conviene hacer diluciones seriadas para reducir el error (ej. para una dilución 1/50
primero se hace una dilución 1/10 y después se hace una dilución 1/5 de la dilución 1/10). Este
método no diferencia entre células vivas y muertas. Cuando seguimos el crecimiento de una
población microbiana, midiendo por ejemplo su DO en función del tiempo, obtenemos su curva
de crecimiento, que nos viene dada por una gráfica del tipo:
El incremento en el número de células es lento al principio y después llega a ser de forma exponencial.
Esta gráfica es característica de un cultivo en un recipiente cerrado en el que los nutrientes son limitados.
En la curva se distinguen cuatro fases:
Fase de latencia. Fase de adaptación de las células a las nuevas condiciones del medio de incubación al
que han sido transferidas. Las células no crecen inmediatamente sino después de este tiempo de latencia.
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Las células son metabólicamente activas, se adaptan al medio y eventualmente lo modifican. Para un
mismo inóculo, esta fase de latencia varía dependiendo del medio al que se transfieren y de las
condiciones de incubación.
Fase de crecimiento exponencial. Fase en la que las células se están dividiendo regularmente a ritmo
constante. En condiciones apropiadas durante esta fase, el grado de desarrollo es máximo. Es en este
periodo donde puede calcularse el tiempo de generación de un microorganismo.
Fase estacionaria. El nº de células no se incrementa más porque los nutrientes del medio se van agotando
y posibles sustancias tóxicas pueden ir acumulándose. No hay incremento neto del nº de células, el nº de
células que se originan es igual al nº de las que mueren.
Fase de muerte celular. Las células mueren a una velocidad mayor a la que se originan debido al
agotamiento total de algún nutriente y/o excesiva acumulación de sustancias tóxicas.

Precultivo de Escherichia coli en caldo LB (50 mL) microscopios
Incubadora de microorganismos a 37 ºC
Cepas bacterianas
espectrofotómetro
Medios y Materiales refrigerador
Pipetas estériles
cámara de recuento (Cámara Thoma o Neubauer)
Puntas azules y amarillas estériles
Dos gatorade con 50 mL de caldo LB
Placas portaobjetos
Tubos con 10 ml de caldo tioglicolato
Agua oxigenada de 30 vol.
Palillos
Aguja de inoculación
Procedimiento:
1. Día -2. Sembrar la cepa en placa.
2. Día -1. Poner un precultivo de 50 mL de LB.
3. Día 0. Medir la A600 del precultivo y determinar el volumen de inóculo para tener dos
cultivos en gatorades con 50 mL de caldo LB a A600inicial=0.050 (t0).
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4. Se seguirá la evolución de la turbidez de los dos cultivos, el primero incubado a 37 ºC y el

segundo a temperatura de refrigeración.
5. Se medirá la D.O. en el espectrofotómetro cada 30 min* mientras dura la práctica.
6. Al mismo tiempo se contará los microorganismos usando la cámara de recuento o cámara
Thoma. Esta cámara de recuento consiste en un porta modificado con una hendidura de 0,1
mm de profundidad. Está dividida en 16 cuadrados y éstos a su vez divididos en 16 ó 25
celdillas. Cada celdilla tiene una superficie de 0,0025 mm2 y una profundidad de 0,1 mm. Por
tanto el volumen de cada celdilla (Vc) es de 0,00025 mm3. Como hay 16 celdillas por
cuadrado, el volumen total de una celda (VT) es de
Vc × 16 = 0,004 mm3. Como 1 mm3 = 10-3 mL
V = 4 × 10-6 mL (volumen de una celda)
Se cuentan 6 celdas al azar, se calcula la media (X) de células por celda y se expresa la
concentración en células por ml:
X cel / 4 × 10-6 ml = X × 25 × 104 células/ml
* Mientras transcurre el tempo de incubación de los cultivos, los estudiantes realizarán la siembra de
microorganismos en caldo tioglicolato, con la finalidad de observar el crecimiento según sus necesidades
de oxígeno. Una vez sembrados, los tubos se incuban a 37 ºC durante 24 horas y al día siguiente se observa
el sitio del tubo donde hay turbidez. También se realizará la prueba de catalasa para ver si los
microorganismos producen o no la enzima, lo cual está relacionado con el tipo de crecimiento según la
presencia de oxígeno. Procedimiento:
- En una placa portaobjetos, se coloca una gota de agua oxigenada de 30 volúmenes.
- Con un palillo se toman colonias del medio Agar Nutritivo y se mezclan con el agua oxigenada.
- El resultado positivo será evidente a los pocos segundos por el aparecimiento de burbujas.
- Las placas portaobjetos se deben colocar en una solución desinfectante ya que contienen
bacterias viables.
Resultados:
Tiempo de Densidad óptica Densidad óptica Número de células/ml Número de células/ml
lectura cultivo a 37 ºC cultivo refrigeración (cámara de Thoma) (cámara de Thoma)
(minutos) (DO600) (DO600) cultivo a 37 ºC Cultivo refrigeración
0
30
60
90
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GENERAL
Realizar un solo gráfico DO vs tiempo en las dos condiciones de incubación.
Dibujar los tubos con el crecimiento en caldo tioglicolato. Indicar el nombre del o los microorganismos
y su clasificación según sus requerimientos de oxígeno.
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Microorganismo ensayado Positivo o negativo para catalasa
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GENERAL
PRACTICA N° 5: Recuento directo de células viables.

Objetivos:
• Comparar los resultados obtenidos en las técnicas de siembra por extensión y vertido en medios
sólidos utilizados para el recuento de microorganismos a partir de muestras de alimentos.
• Determinar las diferencias entre estos dos métodos de contaje de células viables.
Las técnicas de siembra por vertido en placa y por extensión se emplean para obtener colonias
aisladas de microorganismos a partir de muestras líquidas. El paso previo en ambas técnicas es la dilución
de la muestra original para reducir la población microbiana lo suficiente como para obtener colonias
separadas que se puedan contar en placas de medios. El número de colonias por placa debe oscilar entre
30 y 300 para que el cálculo del número de colonias en la muestra sea estadísticamente significativo.
En la siembra por vertido, pequeños volúmenes de las muestras diluidas se colocan en cajas Petri estériles
y se mezclan con TSA (Tripticasa soya agar) líquido y que ha sido enfriado a 45 a 55° C (temperatura de
distribución). Después de que el agar se ha solidificado, cada célula es inmovilizada y formará una colonia.
Las colonias se forman tanto en la superficie como en el entramado del agar.
En la siembra por extensión las muestras diluidas se esparcen en la superficie del agar con ayuda del asa
de Digralsky de manera que las bacterias se multiplican y forman colonias solo en la superficie de la placa.
Mediante los dos métodos se establece que el número total de colonias es equivalente al número de
microorganismos viables en la muestra diluida.
Medios y Materiales EQUIPOS

Pipetas estériles y micropipetas Incubadora de microorganismos a 37 ºC
6 cajas de TSA o agar nutritivo para extensión
6 cajas de TSA o agar nutritivo para vertido
Cajas vacías estériles
2 tubos con 9 ml de TSB o agua peptonada
1 gatorade con 45 mL de TSB o agua peptonada
Asas de Digralsky
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GENERAL
Procedimiento:
Diluciones sucesivas decimales (paso previo tanto para la siembra por extensión como por vertido).
1. Para obtener la dilución 1/10 o 10-1 se toma 5 ml o 5 gramos de la muestra a analizar y se coloca en
un gatorade que contenga 45 ml de agua peptonada (AP) o TSB y se homogeniza bien.
2. Para obtener la dilución 1/100 o 10-2 se toma 1ml de la dilución 10-1 y se coloca en un tubo que
contenga 9 ml de AP o TSB y se homogeniza bien la mezcla.
3. Para obtener la dilución 1/1000 o 10-3 se toma 1ml de la dilución 10-2 y se coloca en un tubo que
contenga 9 ml de AP o TSB.
4. Se puede continuar diluyendo la muestra si se sospecha que la carga microbiana que contiene es alta,
para de esta manera asegurar que se puedan contar las colonias de microorganismos.
Siembra de las diluciones por extensión y vertido.

En la figura 5.1 se pueden observar las dos técnicas.
Técnica de siembra por extensión:
1. Se etiquetan 2 cajas de TSA por cada dilución realizada.
2. Para esterilizar el asa de Digralsky, esta se humedece con alcohol potable y se procede a flamear
en la llama del mechero.
3. Se coloca en el centro de cada caja 0.1 ml de cada dilución (usar una pipeta estéril para cada
dilución).
4. Se extiende la muestra en toda la superficie del agar con el asa de Digralsky (fig 5.2) con
movimientos hacia a delante y hacia atrás a la vez que se rota la caja.
5. Las cajas se incuban durante 24 horas a 37 °C.
6. Se cuenta el número de colonias en todas las diluciones.
7. Se calcula el promedio del número de colonias en cada dilución y se reporta el número de
microorganismos encontrados en la muestra original en ufc/mL o ufc/g.
Técnica de siembra por vertido:
1. Se etiquetan 2 cajas de TSA por cada dilución realizada.
2. Se coloca en cada caja 1 ml de cada dilución (usar una pipeta estéril para cada dilución).
3. Se disuelve el medio TSA (previamente esterilizado) en un baño de agua.
4. Se deja enfriar el medio hasta que alcance la temperatura de distribución de 45 a 55°C y se vierte
sobre la muestra en cada caja.
5. La muestra se distribuye en el agar fundido realizando movimientos circulares en sentido de las
manecillas del reloj y en sentido contrario.
6. Se espera que el agar se solidifique y se incuban las cajas durante 24 horas a 37° C.
7. Se cuenta el número de colonias en todas las diluciones (tomar en cuenta tanto las colonias de la
superficie como las que crecen dentro del medio).
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GENERAL
8. Se calcula el promedio del número de colonias en cada dilución y se reporta el número de

microorganismos encontrados en la muestra original en ufc/mL o ufc/g
Resultados:
Identificación de la muestra:
Muestra
Apariencia (color, olor)
Procedencia
Resultados. Técnica Vertido: Contaje Total de Mesófilos aerobios:
Dilución ufc/caja 1 ufc/caja 2 Promedio ufc/ml o gr de alimento
Cálculos:
Resultados. Técnica por extensión: Contaje Total de Mesófilos aerobios:
Dilución ufc/caja 1 ufc/caja 2 Promedio ufc/ml o gr de alimento
Cálculos:
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GENERAL
Fig 5.1 Técnicas de siembra: extensión y vertido.
Fig 5.2 Asa de Digralsky para extensión sobre agar.
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GENERAL
PRACTICA N°6: Sensibilidad bacteriana a los antibióticos. Antibiograma.

Unidad curricular 2
Objetivo:
- Determinar la sensibilidad o resistencia de una cepa bacteriana frente a distintos antibióticos.
Conocer la sensibilidad bacteriana a los antibióticos tiene varias aplicaciones, como por ejemplo
dirigir el tratamiento frente a una infección causada por un agente conocido, generar una base de datos
para determinar la presencia de cepas resistentes y su seguimiento.
Los métodos para determinar la sensibilidad frente a antimicrobianos pueden ser cualitativos o
cuantitativos.
Los métodos cualitativos son aquellos que permiten clasificar a los microorganismos en sensibles,
moderadamente sensibles o resistentes frente a los antibióticos en estudio, para lo cual se sigue la técnica
de difusión en agar, antibiograma o método de Kirby-Bauer. En la cual un inóculo microbiano de
concentración conocida, se siembra por hisopado en una placa de agar Mueller-Hinton* sobre la que se
depositan discos de papel filtro (también llamados discos de antibiograma) impregnados con el antibiótico
(fig 7.1). El antibiótico difunde en el agar y puede o no formarse a su alrededor un halo de inhibición de
crecimiento. Dependiendo del diámetro del halo de inhibición se puede establecer si el microorganismo
es sensible, moderadamente sensible o resistente al antibiótico.
Los métodos cuantitativos son aquellos que permiten calcular la concentración inhibitoria mínima (CIM)
y la concentración mínima bactericida (CMB). La CMI es la mínima concentración del antibiótico capaz de
inhibir el crecimiento de un inóculo bacteriano previamente estandarizado. Mientras que la CMB es la
mínima concentración del antibiótico capaz de matar al 99.99% de una población bacteriana previamente
estandarizada. La determinación de la CMI se realiza por la técnica de dilución en tubo que consiste en
exponer a las cepas de microorganismos a estudiar, a diferentes concentraciones del antimicrobiano, en
diluciones a la mitad y observar el crecimiento o no de los microorganismos en los tubos.
El medio Agar Mueller -Hinton debe cumplir con los siguientes parámetros antes de su utilización:
- Cationes divalentes.- este medio posee una concentración baja de iones divalentes y debe ser
suplementado para obtener concentraciones fisiológicas adecuadas. (20 a 35ug/L de Mg2+ y 50 a 100ug/L
de Ca2+). Las variación en cationes divalentes, principalmente Mg y Ca afecta los resultados de ensayo de
aminoglucósidos y tetraciclinas con cepas de Pseudomonas aeruginosa. Para ello se debe probar con la
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GENERAL
cepa P. aeruginosa ATCC (American Type Culture Collection) 27853 con gentamicina 10 ug y debe dar una
lectura de 16-21mm.
-pH.- el pH del medio debe ajustarse entre 7.2 - 7.4, si el pH es muy bajo, ciertas drogas parecerían
perder potencia (ej. aminoglucósidos, quinolonas y macrólidos), mientras que otras drogas pueden
presentar excesiva actividad (ej. tetraciclinas). Si el pH es muy alto se esperan efectos opuestos. El pH se
ajusta con HCl o NaCl 0.1N estériles.
-Timina y Timidina.- el medio debe contener bajo contenido de Timidina o Timina para evitar
invertir los efectos inhibitorios de sulfonamidas y trimetoprim, dando zonas más pequeñas, menos nítidas
o ninguna zona lo que podría resultar en un falso informe de resistencia. Para evaluar el medio se utiliza
la cepa Enterococcus faecalis ATCC 33186 con discos de trimetoprim/sulfametoxazole y debe dar una
lectura de ≥20 mm.
-Espesor.- debe ser de 4mm es decir se debe colocar una cantidad de medio entre 25 a 30 ml en
placas de 85-100 mm de diámetro interno. Cuando existe un espesor mayor a 4 mm, se genera un
diámetro de halo de inhibición menor (falsa resistencia), mientras que un espesor menor a 4 mm se
genera un diámetro de halo de inhibición mayor (falsa sensibilidad).
-Humedad.- El medio debe dejarse a temperatura ambiente unas dos horas antes de utilizarlo. Si
existe agua en la superficie del agar, las placas pueden colocarse en el incubador a 35ºC por 30 minutos
con la tapa ligeramente abierta.
-Temperatura de incubación.-colocar entre un rango de 35º a 37ºC. Tener en cuenta que ciertas
especies requieren condiciones de anaerobiosis, si fuere el caso deberá generar el ambiente anaeróbico.

Pipetas estériles y micropipetas Incubadora de microorganismos a 37 ºC
12 cajas de Agar Mueller-Hinton
Hisopos estériles
Referencias escala 0.5 McFarland
Discos de antibióticos
Pinzas
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LABORATORIO
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DE MICROBIOLOGÍA
GENERAL
Procedimiento
Técnica para el método de difusión en agar o antibiograma
a) Preparación del inóculo.
- Método de suspensión directa de colonias.- a partir de una placa de cultivo de 18 a 24 horas tomar
varias colonias con un asa o hisopo y ajustar el inóculo a una turbidez equivalente a 0.5 McFarland que
equivale a 1.5 x 108 ufc/ml, en suero fisiológico o agua destilada estéril. Agitar en "vortex" durante 15-20
segundos. El control del inóculo se realiza con un estandar de 0.5 McFarland que se puede preparar o
comprar.
b) Inoculación de placas.
Antes de que transcurran 15 minutos de haber ajustado el inóculo, introducir un hisopo estéril dentro
de la suspensión y al retirarlo rotar varias veces contra la pared del tubo para eliminar cualquier exceso.
Inocular completamente el medio mediante la técnica de hisopado y dejar secar por 5 minutos antes de
depositar los discos. El medio más comúnmente usado en esta técnica es el Agar Mueller-Hinton que es
un medio nutritivo no selectivo que por su composición ha sido recomendado por el CLSI para ser
utilizado de forma rutinaria en la realización del antibiograma en medio sólido. Este medio presenta
buena reproducibilidad en las pruebas de sensibilidad, bajo contenido en inhibidores de sulfonamidas,
trimetoprima y tetraciclina y, la mayoría de los patógenos microbianos crecen satisfactoriamente.
c) Dispensación de los discos.
Colocar los discos manualmente con pinzas estériles y presionarlos ligeramente sobre la superficie del
agar. No deben situarse discos a menos 15 mm del borde de la placa y han de estar distribuidos de forma
que no se produzca superposición de los halos de inhibición (20 mm de borde a borde de cada disco).
Nota: Para placas de 150 mm de diámetro interno no se emplearán más de 12 discos y para las de 100
mm de diámetro interno no más de 6 discos.
Resultados:
- Lectura de los halos de inhibición.
Después de 18 horas de incubación leer el diámetro de las zonas con una regla estandarizada. Si el
organismo es un estafilococo o un enterococo debemos esperar 24 horas para asegurar la sensibilidad a
oxacilina y vancomicina.
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Versión: 05
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LABORATORIO
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DE MICROBIOLOGÍA
GENERAL
Las zonas de los medios transparentes se miden sobre el reverso de la placa y en los medios que contienen
sangre sobre la superficie del agar.
Cuando aparecen colonias dentro del halo de inhibición, puede tratarse de mutantes resistentes,
contaminaciones, poblaciones heterogéneas o cultivos mixtos y conviene volver a identificarlas y realizar
otra vez el ensayo de sensibilidad antimicrobiana.
- Interpretación de resultados.
La lectura de los resultados se realiza en función de las normas CLSI (Clinical and laboratory standars
institute). De esta forma se han fijado 3 categorías: sensible (S), intermedia (I), y resistente (R).
Sensible.- indica que la infección ocasionada por la cepa para la que se ha determinado el halo de
inhibición puede tratarse de forma adecuada empleando las dosis habituales de antimicrobiano.
Intermedio.- indica que el halo de inhibición se aproxima a las concentraciones de antimicrobiano

alcanzables en sangre o tejidos y que puede esperarse eficacia clínica en aquellas localizaciones en las que
se alcanzan altas concentraciones de antimicrobiano (ej. orina) o cuando se emplean dosis más elevadas
de lo habitual.
Resistente.- se refiere a aquellos microorganismos que no se inhiben por las concentraciones habituales
alcanzadas en sangre y tejidos del correspondiente antimicrobiano. También se refiere a microorganismos
en los que existe algún mecanismo de resistencia.
Los diámetros de los halos de inhibición en mm se comparan con datos publicados en tablas en las que se
determinará si el microorganismo es sensible, moderadamente sensible o resistente al antibiótico.
NOTAS: Los discos de antibióticos se conservan en refrigeración o congelación y deben ser sacados una
hora antes de su uso. Cada disco tiene inscritas las iniciales del antibiótico y la concentración. Se DEBE
copiar esta información para luego compararla con la de las tablas de referencia.
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Versión: 05
MICROBIOLOGÍA
LABORATORIO
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GENERAL
Fig 7.1 Antibiograma.
Reporte de resultados:
ANTIBIOTICO CODIGO NOMBRE DEL DIAMETRO DEL SENSIBLE, MODERADAMENTE SENSIBLE
DEL DISCO MICROORGANISMO HALO (mm) O RESISTENTE
1
2
3
4
5
ANTIBIOTICO CODIGO NOMBRE DEL DIAMETRO DEL SENSIBLE, MODERADAMENTE SENSIBLE

DEL DISCO MICROORGANISMO HALO (mm) O RESISTENTE
1
2
3
4
5
Cuestionario:
Según los resultados que obtuvo, qué antibiótico recomendaría para tratar una infección causada por
los microorganismos ensayados y por qué?
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Versión: 05
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GENERAL
PRÁCTICA N° 7. Metabolismo microbiano I. Pruebas bioquímicas en bacterias

Gram negativas.
Unidad curricular 3
Objetivos:
- Comprender el fundamento de las pruebas bioquímicas utilizadas para la identificación de
bacterias Gram negativas.
- Identificar la cepa asignada por su género y especie mediante pruebas bioquímicas.
Día 1:

Cepas bacterianas para su identificación Microscopios
Materiales para tinción Gram ( Referirse a la práctica Incubadora de microorganismos a 37 ºC
No. 3)
Discos prueba oxidasa
Agua estéril
12 cajas de Agar MacConkey
12 baterías de pruebas bioquímicas (Simmons
Citrato, TSI, SIM, UREA, OF LACTOSA)
Palillos
Asa de siembra
Se dará a cada grupo dos cepas aisladas en Agar Nutritivo o TSA a las que debe identificar y reportar su
género y especie. Para lo cual debe realizar:
a) Tinción Gram.
Referirse a la práctica No. 3
b) Prueba de la Oxidasa
Una vez identificada la bacteria como Gram negativa al ser observada al microscopio, se procede a realizar
la prueba de Oxidasa.
Procedimiento:
-Se coloca un disco de Oxidasa en una caja petri o portaobjetos.
- Se humedece el disco de Oxidasa con UNA gota de agua destilada estéril.
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GENERAL
- Se toma con un palillo de dientes una colonia del Agar nutritivo o un agar que sea NO selectivo
y se procede a colocar la colonia en el disco de Oxidasa previamente humedecido.
- Al cabo de 10 segundos se cataloga la prueba como positiva o negativa. Recuerde que a
medida que pasa el tiempo toda prueba de Oxidasa tiende a ser positiva.
Prueba positiva (coloración morada oscura en el disco): bacterias Gram negativas que NO pertenecen a la
familia Enterobacteriaceae.
Prueba negativa (el disco no cambia de coloración): bacterias Gram negativas que pertenecen a la familia
Enterobacteriaceae.
c) Identificación de Enterobacterias:
Siembra en un medio selectivo MacConkey.
Las cepas oxidasa negativas se siembran por agotamiento o "estrias" en el medio selectivo MacConkey
que se incuba a 37ºC por aproximadamente 18 horas.
Pruebas bioquímicas para enterobacterias.
Una batería simple de pruebas bioquímicas permite identificar el género y la especie de las cepas
proporcionadas. Estas pruebas son:
- Simmons Citrato
- TSI
- SIM
- UREA
- OF LACTOSA
d) Identificación de Gram negativas no enterobacterias:

Siembra en un medio selectivo.
Las cepas oxidasa positivas se siembran por agotamiento o "estrias" en el medio selectivo agar Cetrimida
para observar la producción de pigmentos.
Pruebas Bioquímicas NO enterobacterias.
Para bacterias no pertenecientes a la familia Enterobacteriaceae como son las Pseudomonas spp., se
utilizan únicamente las siguientes pruebas:
- TSI o algún medio para observar fermentación de carbohidratos, el más utilizado es el medio OF
- SIM o algún medio para observar movilidad.
E) Incubación
Después de sembrar en cada tubo, NO cerrar herméticamente las tapas e incubarlos a 37ºC por
aproximadamente 18 horas.
Día 2
Al día siguiente se deben observar el crecimiento en las cajas y leer los resultados de las pruebas
bioquímicas. Lo cual significa identificar si ha habido algún cambio de color en los tubos o alguna otra
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GENERAL
característica como la formación de precipitados o la producción de gas a partir de carbohidratos, etc.

Algunas pruebas como la detección de indol en el tubo SIM, requieren de un “revelador”. En este caso
debe destapar el tubo SIM y colocar dos gotas del reactivo Kovac’s indol. Si se forma un anillo rojo la
prueba es positiva y si el anillo queda del color del reactivo, la prueba es negativa.
Resultados:
Resultados para enterobacterias:
Nombre de la bacteria (género y especie)
Morfología y coloración Gram

Color del medio MacConkey antes / después de sembrar.
Forma, tamaño y color de las colonias en MacConkey
Este medio es selectivo, diferencial o ambos? EXPLIQUE
SU RESPUESTA.
Resultados pruebas químicas para enterobacterias:
CEPA Pruebas bioquímicas

Número Oxidasa Oxida Fermenta
lactosa lactosa
Triple Sugar Iron Sulfuro Indol CIT Urea

Movilidad
H2S I M
Pico/Base Gas H2S
Género y especie del microorganismo/s asignado/s:…………………………………………………………..
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GENERAL
Resultados pruebas químicas para no enterobacterias:
CEPA Pruebas bioquímicas

Número Oxidasa Oxida Fermenta
lactosa lactosa
Triple Sugar Iron Sulfuro Indol CIT Urea

Movilidad
H2S I M
Pico/Base Gas H2S
Género y especie del microorganismo/s asignado/s:…………………………………………………………..
NOTAS:
• Si se hacen pruebas adicionales completar las tablas con la información correspondiente o colocar NA en caso de que no se hayan
realizado la/s prueba/s de las tablas.
• Los resultados se deben comparar con los establecidos en la literatura para así determinar el microorganismo que le fue asignado. Los
fundamentos de las pruebas bioquímicas se pueden consultar en el manual de Pruebas Bioquímicas de Jean F. MacFaddin (2003).
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GENERAL
BACILOS O COCOBACILOS
GRAM NEGATIVOS
OXIDASA
NEGATIVO
POSITIVO
Pseudomonas spp. Enterobacterias

Haemophilus spp. E. coli
Eikenella spp. Klebsiella spp.
Pasteurella spp. Proteus spp.
Vibrio spp. Salmonella spp.
Etc Acinetobacter spp.
Enterobacter spp.
Citrobacter spp.
PRUEBAS BIOQUIMICAS Serratia spp.
ESPECÍFICAS Morganella spp.
"Directamente sin INDOL" Shigella spp.
Providencia spp.
Yersinia spp.
o con INDOL
INDOL
POSITIVO NEGATIVO
POSITIVO NEGATIVO
Enterobacteria Enterobacterias
Haemophilus spp. Pseudomonas spp.
s Klebsiella spp.
Pasteurella spp. Eikenella spp.
E. coli (K. pneumoniae)
Vibrio spp. Etc
Proteus Proteus mirabilis
Etc
vulgaris Salmonella spp.
Acinetobacter Acinetobacter
spp. spp.
Enterobacter spp.
Citrobacter spp.
Serratia spp..
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PRUEBAS BIOQUIMICAS
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GENERAL
Cuestionario:
1. Indique tres características indispensables para que una bacteria pertenezca a la familia
Enterobacteriaceae
2. Haga la reacción química que se dá en una prueba de indol positiva.
3. Haga la reacción química que se dá cuando la enzima ureasa descompone la úrea.
4. Dibuje los tubos de las pruebas bioquímicas (TSI, SIM, UREA y CITRATO) antes de sembrar y
luego con todas las opciones de resultados.
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GENERAL
PRACTICA N° 8. Metabolismo microbiano II y Mecanismos de patogenicidad

microbiana. Cocos Gram positivos del género Staphylococcus
Unidad curricular 3
Objetivos:
- Comprender el fundamento de las pruebas bioquímicas utilizadas para la identificación de
bacterias Gram positivas del género Staphylococcus.
- Identificar la cepa asignada por su género y especie mediante pruebas bioquímicas y
características de crecimiento en medios sólidos.
- Realizar pruebas para determinar la producción de enzimas vinculadas con la patogenicidad de
microorganismos del género Staphylococcus.
Día 1:

Cepas bacterianas para su identificación Microscopios
Materiales para tinción Gram ( Referirse a la práctica Incubadora de microorganismos a 37 ºC
No. 3)
Agua oxigenada 30 % (v/v)
Agua estéril
Plasma citratado
12 cajas de Manitol salado
12 cajas de Agar Sangre
Portaobjetos
Asa de siembra o palillos
Se dará a cada grupo una cepa aislada en Agar Nutritivo a la cual debe identificar y reportar género y
especie. Para lo cual debe realizar:
a) Tinción Gram
Referirse a la práctica No. 3
b) Prueba de la Catalasa
Una vez identificada la bacteria como Gram positiva al ser observada al microscopio, se procede a realizar
la prueba de Catalasa.
Procedimiento:
- En una placa portaobjetos, se coloca una gota de agua oxigenada de 30 volúmenes.
- Con un palillo se toman colonias del medio Agar Nutritivo y se mezclan con el agua oxigenada.
- El resultado positivo será evidente a los pocos segundos por el aparecimiento de burbujas.
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Versión: 05
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GENERAL
- Colocar las placas portaobjetos en una solución desinfectante ya que contienen bacterias
viables.
Una vez realizada la prueba las bacterias pueden ser clasificadas como cocos Gram positivos catalasa
positivo pertenecientes al género Staphylococcus spp., y cocos Gram positivos catalasa negativa
pertenecientes a los géneros Streptococcus o Enterococcus spp.
c) Prueba de coagulasa
La prueba de coagulasa se debe realizar a las bacterias catalasa positivas. Esto nos permitirá clasificar las
bacterias como Staphylococcus coagulasa positivos (SCP) o Staphylococcus coagulasa negativos (SCN).
Procedimiento de coagulasa en tubo:

- En 0.5 ml de plasma citratado se realiza una emulsión densa de colonias con ayuda de un asa
estéril.
- Se coloca el tubo a baño maría a 37ºC durante 2 horas y se revisa cada 30 minutos la formación
de un coágulo.
- Se considera positiva cuando hay formación total o parcial de un coágulo.
Una prueba positiva al test en tubo de coagulasa en una prueba confirmatoria de Staphylococcus aureus.
d) Crecimiento del género Staphylococcus en medio Manitol Salado.

Se procede a sembrar las bacterias por estriación en el medio Manitol y se incuba a 37ºC por
aproximadamente 18 horas.
e) Producción de hemólisis en Agar Sangre

Algunas cepas de cocos Gram positivos pueden distinguirse inicialmente por el tipo de hemólisis que
producen. Así tenemos:
ß-hemolíticos: son aquellos que producen una hemólisis total de los glóbulos rojos,
observándose un halo transparente alrededor de las colonias.
α- hemolíticos: son aquellos que producen hemólisis parcial, la cual se observa un halo con
tonalidad verdosa alrededor de las colonias.
γ- hemolíticos: son aquellos que no producen hemólisis sobre el agar sangre.
Para observar el tipo de hemólisis de los Staphylococcus se procede a sembrar por estriación en agar
sangre humana. Este agar se prepara colocando a un medio base como por ejemplo TSA una cantidad de
sangre desfibrinada al 5%.
Día 2:
Se leen los resultados del crecimiento en manitol y Agar sangre.
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Versión: 05
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GENERAL
Reporte de resultados:
Nombre de la bacteria (género y especie)
Morfología y coloración Gram
Color del medio manitol antes y después de

sembrar.
Forma, tamaño y color de las colonias en manitol
Este medio es selectivo, diferencial o ambos?
EXPLIQUE SU RESPUESTA.
Prueba Resultado
CATALASA
COAGULASA
Producción de hemolisinas en agar sangre (describir

las características de las colonias y el tipo de
hemólisis)
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GENERAL
PRÁCTICA N° 9. Efecto de la radiación UV sobre el crecimiento microbiano.

Unidad Curricular 4
Objetivos:
• Reforzar la preparación y cálculos para realizar diluciones.
• Reforzar la siembra por extensión.
• Determinar el efecto de la luz UV, factor físico germicida, sobre las células de levadura.
• Determinar el efecto diferencial que genera la luz UV, dependiente del genotipo de la cepa de
levadura utilizada
Fundamentos y método:
La luz ultravioleta (UV) tiene un efecto germicida debido principalmente a que genera dímeros de timina
en el ADN, lo que puede impedir el avance de la horquilla de replicación. La presencia de dímeros de
timina es detectada como una lesión por la célula. Los llamados mecanismos de checkpoint son unos
mecanismos de protección que detectan las lesiones y activan a los mecanismos de reparación. La
proteína Rad53 juega un papel central para el correcto funcionamiento del checkpoint.
En esta práctica trabajaremos con dos cepas, una salvaje (APY108; wt, wild type) cuyo genotipo es MATa,
ade2-1, trp1-1, can1-100, leu2-3,112, his3-11,15, ura3, GAL, psi+, RAD5, y una cepa que porta una
mutación puntual en el dominio catalítico del gen RAD53 (rad53-11) (APY37), cuyo genotipo es MAT alpha,
ade2-1, trp1-1, can1-100, leu2-3, his3-11 ura3, rad53-11.
El hecho de que la cepa mutante es portadora de una mutación que afecta al funcionamiento de la
proteína Rad53, hace que esta cepa tenga problemas a la hora de detectar los daños y lesiones en el ADN,
y de activar las rutas de reparación. Por ello, esta cepa es más sensible a agentes como la luz UV, que una
cepa salvaje donde el checkpoint funciona correctamente.
Esta aproximación de estudio se conoce como diseccionista, porque consiste en “diseccionar” un gen para
estudiar la pérdida (o a veces ganancia) de una función.
Sin embargo, la cepa salvaje aunque mucho menos sensible, también tiene un límite de exposición a la
luz UV. Células salvajes son capaces de detectar lesiones y activar mecanismos de reparación, pero
sobrepasado un umbral de exposición a la luz UV, no van a ser capaces de reparar todas las lesiones
generadas, aumentando la tasa de mortalidad.
En esta práctica vamos a observar el efecto germicida de la luz UV sobre una población de células de
levadura, y vamos a observar que el efecto es más fuerte en células deficientes en el sistema de
checkpoint, comparado con células salvajes.
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GENERAL

Cepas de levadura: Incubadora de microorganismos a 28 ºC
APY108 (WT): MATa, ade2-1, trp1-1, can1-
100, leu2-3,112, his3-11,15, ura3, GAL, psi+,
RAD5
APY37: MAT alpha, ade2-1, trp1-1, can1-
100, leu2-3, his3-11 ura3, mec2-1 (rad53-11)
Medio sabouraud líquido (dos erlenmeyers con 20
mL/sesión de prácticas)
8 placas Petri de medio sabouraud/grupo
8 placas Petri de medio sabouraud/grupo
8 tubos de vidrio estériles/grupo
100 mL de solución salina estéril/grupo
pipetas de 2, 5 y 10 mL
Asa de digralsky
Alcohol potable para extensión
Procedimiento:
1. Se ajustan los cultivos de las cepas WT y rad53-11 a una DO600=0.5 unidades de absorbancia.
Esto equivale a 0.7x107 cel/mL.
2. Se hacen las diluciones que se indican en la Tabla 8.1 y figura 8.1, tanto para la cepa salvaje
como para la mutante:
10 -1 10 -2 10 -3 2 x 10 -4
V (mL) de cultivo o 0.5 mL de cultivo a 0.5 mL de 0.5 mL de 1.0 mL de
dilución DO600=0.5 ua dilución 10 -1 dilución 10 -2 dilución 10 -3
V (mL) de solución 4.5 mL 4.5 mL 4.5 mL 4.0 mL
salina
Tabla 8.1. Diluciones del cultivo de levaduras.
3. Se siembra por extensión 0.2 mL de la dilución 2x 10 -4 de la cepa wt en 4 cajas Petri (0.2 mL/
placa). Se realiza lo mismo con la cepa rad53-11.
4. Las placas se dejan unos minutos boca arriba para que se absorba bien el exceso de líquido
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GENERAL
5. Se procede a Irradiar las placas según los tiempos determinados en la tabla 9.2 (Nota: La luz
UV de la campana de flujo laminar debe prenderse con anticipación para que se caliente, sino
se dan variaciones en los resultados).
6. Una vez irradiadas, las placas se incuban a 28-30°C durante 2-4 días.
7. Al cabo de la incubación se cuenta el número de colonias y se interpretan los resultados.
Figura 8.1. Procedimiento a seguir para realizar las diluciones seriadas y sembrar en placa por extensión.
Resultados:
Completar la siguiente tabla:
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GENERAL
Tiempo de irradiación N° colonias WT N° colonias mutante

0 (control)
De acuerdo a los datos anteriores, calcular los porcentajes y representar los datos en una gráfica de barras.
Discutir los resultados obtenidos.
Tiempo de irradiación % colonias WT % colonias D
0 100 100
Cuestionario:
Calcular de acuerdo al valor de OD600 de partida y teniendo en cuenta que OD600= 0.5 ua equivalen a
0.7x107 cel/mL, cuantas células espera tener en los 0.2 mL de la dilución 2x10 -4 sembrados en las placas.
¿Concuerda con el valor que ha obtenido? Discuta.
PRACTICA N° 10. Transformación de Escherichia coli con plásmido

pUC18 (AMPR, LACZ)
Unidad Curricular 4
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GENERAL
Objetivos:
• Realizar una transformación de bacterias con DNA plasmídico, in vitro.
• Utilizar un método de selección para aquellas bacterias que han incorporado plásmido, con o sin
el gen de interés “A”.
• Utilizar un método de diferenciación entre bacterias que han incorporado el plásmido CON el gen
de interés “A” de aquellas que han incorporado el plásmido SIN el gen de interés “A” (plásmido
“vacío”).
La transformación es el proceso por el cual una bacteria introduce una molécula de DNA, siendo
esta lineal o circular (ej. Plásmido).
Para introducir el DNA, la bacteria debe ser competente, una condición que permite el paso del DNA. La
competencia puede ser natural o artificial. Aproximadamente el 1% de las bacterias son competentes de
forma natural, lo que implica la presencia de proteínas de membrana que ayudan a introducir el DNA.
Pero la competencia puede ser inducida en condiciones de laboratorio, que alteran la membrana
haciéndola permeable de forma pasiva. Para ello las células son incubadas en un tampón con un exceso
de cationes divalentes que interaccionan con las cargas negativas de los fosfolípidos de la membrana.
Las células competentes pueden transformarse con un plásmido en condiciones de laboratorio. Los dos
métodos de transformación desarrollados son el choque térmico/osmótico y la electroporación. La
electroporación consiste en introducir una suspensión de bacterias y moléculas de plásmido a
transformar, en una cubeta especialmente diseñada para ser utilizada en un electroporador. El
electroporador somete a las células a un campo eléctrico durante milisegundos, lo que genera poros en
la membrana y permite la entrada del DNA. En esta práctica transformaremos bacterias por choque
térmico/osmótico, que consiste en someter las células electrocompetentes a una diferencia de
temperatura, 4°C - 42°C - 4°C, que genera poros transitorios en la membrana que atraviesan las moléculas
de DNA.
Sin embargo, la eficiencia de transformación, entendida como n° células que han incorporado una o varias
moléculas de plásmido/ ug de DNA, es muy baja, y oscila entre 104-108 células/mg de DNA plasmídico.
Este valor equivale a 1 molécula de plásmido incorporada, de cada 2000-4000 moléculas. Esto implica que
el proceso de transformación debe ir seguido de un proceso de selección, que nos permita identificar y
aislar aquellas células que han incorporado el DNA. En el laboratorio, para poder seleccionar
transformantes, debemos utilizar un plásmido que confiera una capacidad distintiva a aquellas células que
lo incorporen, normalmente la resistencia a un antibiótico.
En esta práctica utilizaremos la ampicilina, que es la primera penicilina semisintética que inhibe la síntesis
de pared celular, mediante la inhibición de la transpeptidasa que establece los puentes peptídicos entre
las cadenas de peptidoglicano. El gen de resistencia a la ampicilina codifica para una b-lactamasa, que
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GENERAL
degrada el anillo b-lactámico de la ampicilina, sólo aquellas bacterias que hayan incorporado el plásmido
serán capaces de sobrevivir en presencia del antibiótico, y generarán una colonia.
Algunos plásmidos como el de la figura 11.1, tienen un sitio de clonación en el que se puede insertar un
gen de interés.
Figura 11.1 Plásmido PUC 18.
Sin embargo tras un proceso de clonación, sólo un pequeño porcentaje de moléculas de plásmido
incorpora el gen de interés. Para diferenciar entre plásmidos que han incorporado el gen de los que no lo
han hecho se ha desarrollado un sistema biotecnológico. Este sistema consiste en un plásmido que
contiene, además del gen AmpR (b-lactamasa), el gen LacZ que codifica para el enzima beta-galactosidasa.
La beta-galactosidasa es un enzima que de forma natural hidroliza la lactosa, un disacárido entre galactosa
y glucosa (β 1,4 Galactosa-Glucosa). In vitro este enzima también escinde un compuesto conocido como
X-gal (5-bromo-4-cloro-3-indolil-β-D-galactopiranósido) (figura 11.2).
Cuando el X-gal es hidrolizado se libera X + Gal, siendo X un compuesto que da coloración azul a las células
que expresan este enzima. Estos plásmidos contienen el sitio de clonación en medio del gen X-gal, de
manera que si el plásmido ha incorporado el gen de interés, el gen está escindido y no es funcional. En
este caso las colonias son blancas y resistentes a Ampicilina. Sin embargo, si el plásmido no contiene el
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GENERAL
gen de interés, la b-galactosidasa es funcional, dando en este caso colonias azules, además de resistentes
a Ampicilina como se observa en la figura 11.3.
Figura 11.2 Estructura del X-Gal y la lactosa.
Figura 11.3 Posibles resultados de la transformación de Escherichia coli con el plásmido PUC 18.
En esta práctica vamos a transformar células competentes de E. coli con una población de plásmido que
contiene el gen LacZ y el gen AmpR. Una proporción de esta población contiene insertado el gen de interés
“A” en el sitio de clonación múltiple interrumpiendo el gen LacZ. Las células transformadas serán
sembradas en placas conteniendo ampicilina y X-gal, como compuestos selectivos.
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GENERAL

Medio LB líquido (1 mL / grupo) Incubadora de microorganismos a 37 ºC
Células competentes de E. coli (DH5 alfa). 2 alícuotas
/ grupo.
Plásmido pUC (AmpR-LacZ y +/- gen de interés “A”)
2 µl / grupo.
Agua estéril. 2 µl / grupo
Placas de LB (2 placas por grupo)
Placas de LB + amp (100 ug/mL) + X-gal (60 ug/mL) +
IPTG (0.1 mM). (2 placas por grupo)
Procedimiento:
1. Antes de empezar se debe poner a calentar un baño María a 42°C.

2. Se utiliza células competentes congeladas a -80°C de E. coli (normalmente DH5alfa). Se debe
descongelar dos alícuotas de células por grupo, poniéndolas 10 min en hielo. Una alícuota se
rotula con P (plásmido) y la otra con C (control).
3. Se añaden 2 µl de plásmido en la alícuota P; y 2 µl de agua estéril en la alícuota C.
4. Se someten los tubos a un choque térmico utilizando el baño precalentado, durante 60
segundos a 42ºC.
5. Se vuelve aponer los tubos en hielo durante 5 minutos más.
6. Luego se transfieren las células de cada alícuota, P y C, a dos tubos estériles también
rotulados como P y C, conteniendo 1 mL de medio LB sin ampicilina ni X-Gal cada uno. Esto
tubos se incuban a 37°C durante 40 min.
7. Del tubo marcado como P se siembran 100 µl en una placa de LB y otra con LBA_X-Gal y del
tubo marcado como C se siembran igualmente 100 µl en una placa de LB y otra con LBA_X-
Gal.
8. Se incuban las placas a 37° hasta el día siguiente, y se observan los resultados.
Cuestionario:
1. ¿Por qué es necesario incubar las células 40 min en LB sin ampicilina? ¿y sin X-Gal?
2. Indicar que permite seleccionar la ampicilina
3. Indicar que permite seleccionar el X-Gal
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MICROBIOLOGÍA
LABORATORIO
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DE MICROBIOLOGÍA
GENERAL
Recursos bibliográficos para la clase.
1. Baron E. et al.A Guide to Utilization of the Microbiology Laboratory for Diagnosis of Infectious
Diseases: 2013 Recommendations by the Infectious Diseases Society of America (IDSA) and the
American Society for Microbiology (ASM), Clinical Infectious Diseases Access published July
10,2013.
2. CDC NIH. Bioseguridad en laboratorios de Microbiología y Biomedicina. 4ta edición.
3. National Committee for Clinical Laboratory Standards. Performance standards for antimicrobial
disk susceptibility tests. Approved standard M2-A6. Wayne, Pa: National Committee for Clinical
Laboratory Standards; 1997.
4. Harley−Prescott: Laboratory Exercises in Microbiology, Fifth Edition. The McGraw−Hill
Companies, 2002
5. Merck Microbiology Manual, 12 ed, Germany.
6. National Committee for Clinical Laboratory Standards. Performance standards for antimicrobial
disk susceptibility tests. Approved standard M2-A6. Wayne, Pa: National Committee for Clinical
Laboratory Standards; 1997.
7. Harley−Prescott: Laboratory Exercises in Microbiology, Fifth Edition. The McGraw−Hill
Companies, 2002
8. Merck Microbiology Manual, 12 ed, Germany.
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MICROBIOLOGÍA
LABORATORIO
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DE MICROBIOLOGÍA
GENERAL
Elaborado Revisado Aprobado
Cargo: DOCENTES Cargo: Docente Cargo:
Firma:
Nombre y Apellido: Rommy Terán

Firma:
Nombre y Apellido: Ana Poveda Firma Firma
Nombre y Apellido: Rommy Terán Nombre y Apellido
Fecha: Fecha: Fecha:
CONTROL DE CAMBIOS
Revisión Nº Fecha Razón de la modificación

Versión 01 Septiembre 2015 Versión Inicial
Versión 02 Marzo 2016 Incorporación y/o modificación de prácticas
Versión 03 Octubre 2016 Incorporación y/o modificación de prácticas
Versión 04 Abril 2017 Incorporación y/o modificación de prácticas
Versión 05 Octubre 2017 Incorporación y/o modificación de prácticas
LISTA DE DISTRIBUCIÓN
Copia N° de Documento Código Área Cargo del

copias responsable
Original 3 Instructivo de práctica IPL-LAB-01 Laboratorio Docentes
impresa de laboratorio Asignatura
Original 3 Instructivo de práctica IPL-LAB-01 Archivo Docente

digital de laboratorio maestro Asignatura
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Controlada de laboratorio
Copia Instructivo de práctica IPL-LAB-01 Laboratorio Estudiantes

Controlada de laboratorio
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UNIVERSIDAD CENTRAL DEL ECUADOR

FACULTAD DE CIENCIAS QUÍMICAS

Docentes del área de formación básica.

GENERALIDADES DEL CURSO PRÁCTICO

Objetivos del curso:

- Adquirir destreza en el manejo de cultivos microbiológicos.

Modalidad de la clase práctica:

Escherichia es el género y coli es la especie.

Políticas y requerimientos de la clase:

• Se prohíbe el uso de celulares o dispositivos electrónicos.

Equipos de seguridad (barreras primarias) incluyen las cabinas de bioseguridad y el equipo de

• Guantes quirúrgicos o de nitrilo de su talla (2 pares por práctica)

PRACTICA N° 1: Medios de cultivo microbiológicos y método de siembra por

• Describir los diferentes tipos de medios de cultivo y su utilización.

Equipos, medios de cultivo y materiales:

Figura 1.1 Autoclave para esterilizar por calor húmedo.

Preparar 20 cajas de TSA (Tripticasa Soya Agar)

Volumen de medio de cultivo a prepararse = 20 ∗ 25 ml

Continuando con el ejemplo anterior:

1000 ml de medio 40 g medio sólido

500 𝑚𝑙 𝑑𝑒 𝑚𝑒𝑑𝑖𝑜 ∗ 40 𝑔 𝑚𝑒𝑑𝑖𝑜 𝑠ó𝑙𝑖𝑑𝑜

Si el medio NO se autoclava el procedimiento que debe seguir es el siguiente:

1. Se determina el volumen de medio de cultivo a preparar y se manda a autoclavar un matraz con

2da parte: METODO DE SIEMBRA POR ESTRIA.

En Microbiología es una técnica común el transferir microorganismos de un cultivo a otro, a esto se

Fig 1.2. Ejemplo de cómo se puede estriar microorganismos en caja.

Fig. 1.3. Ejemplos de las características de las colonias.

Nombre del medio sólido:

Color del medio antes de sembrar

Color del medio después del crecimiento

Crecimiento (si o no)

Es un medio selectivo, diferencial o

Colonias aisladas (si o no)

Color de las colonias aisladas

Tamaño de las colonias aisladas

Forma de las colonias aisladas

Elevación de las colonias aisladas

Borde de las colonias aisladas

b. 30 cajas de agar EMB (Eosin methylene blue lactosa sucrose agar)

c. 10 cajas de agar VRB (Violet red bile agar)

PRACTICA N° 2: Técnicas de tinción simple y diferencial.

• Reconocer la diferencia entre una tinción simple y diferencial.

En la tinción diferencial se utiliza más de un colorante. Un ejemplo de tinción diferencial ampliamente

Equipos, medios de cultivo y materiales:

- Se prepara el frotis (fig 2.1), lo cual comprende las siguientes etapas:

1. Una vez preparado el frotis se procede a realizar la coloración.

1. Una vez preparado el frotis, se procede a su coloración.

Tinción simple OBSERVACION AL MICROSCOPIO.

Morfología: (Cocos o Bacilos)

Nombre del microorganismo:

Morfología: (Cocos o Bacilos)

PASO GRAM GRAM FUNCION DEL COLORANTE BASICO

Fig 2.1. Preparación de un frotis bacteriano a partir de un medio sólido y líquido.

PRACTICA N° 3: Movilidad bacteriana y tinción de estructuras: endosporas y

• Seleccionar el tipo de tinción dependiendo de la estructura que se desea observar.

Equipos, medios de cultivo y materiales:

Procedimiento para tinción de endosporas (Método de Schaeffer-Fulton)

Tinción para endosporas OBSERVACION AL MICROSCOPIO.

Morfología: (Cocos o Bacilos)

Morfología: (Cocos o Bacilos)

Gota pendiente para la observación de movilidad.

Nombre del microorganismo:

Describa lo que observó en

Proceso físico al que se CRECIMIENTO (+ o -)