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Biología Molecular
Técnicas que se utilizan para
caracterizar, aislar y manipular los
ácidos nucleicos celulares
1. METODOS BASADOS EN LA MANIPULACION ENZIMATICA DE LOS
ACIDOS NUCLEICOS
• Enzimas asociadas a la manipulación de ADN
• Técnicas de manipulación de genes y organismos
(clonación, transgénesis)
2. METODOS BASADOS EN HIBRIDACION DE ACIDOS NUCLEICOS
• Hibridación en soportes solidos (Blots)
• Hibridación masiva (microarrays)
3. METODOS BASADOS EN LA SINTESIS Y AMPLIFICACION DE ACIDOS
NUCLEICOS
• Amplificación de ADN por Reacción en cadena de la Polimerasa (PCR)
• Secuenciación de ADN ( Secuenciación Sanger y Secuenciación
Masiva)
ENZIMAS UTILIZADAS EN BIOLOGIA
MOLECULAR
EcoRI
ENZIMAS DE RESTRICCIÓN:
Fragmentos de ADN
generados por el
corte con las
enzimas indicadas.
Fragmentos de ADN
generados por el
corte con las
enzimas indicadas.
MAPAS DE
RESTRICCI
ÓN Perfil de migración
electroforética
producida por los
fragmentos de ADN
generados por el corte
con las enzimas
indicadas.
ADN recombinante
Union de fragmentos de ADN de distinto origen por acción
de la ligasa
LIGASA:
Transformación de bacterias con el
plásmido recombinante
• Plásmido = vector
Clonación
rción de un gen de interés en un vector para su propagación o exp
Expresión del gen de interés
Un vector de expresión es una construcción genética que
permite la introducción de un gen exógeno en una célula
huésped (ej. una bacteria) que sea capaz de expresar la
proteína que codifica en forma eficiente.
Expresa NO expresa
proteína de proteína de
interés interés
Como detectar productos de digestión de
moléculas de ADN grandes ?
Hibridación de ADN en soporte:
Southern blot
RFLP (polimorfismo de los fragmentos
de restriccion)
RFLPs pueden estar asociados a
una enfermedad genetica
Aplicaciones
• Marcador
molecular
• Mapeo genómico
• Análisis de
enfermedades
genéticas
• Búsqueda de
mutaciones que
inserten o quiten un
sitio de restricción
En soportes sólidos
Southern Blot ADN
Northern Blot ARN
Dot blot
Micro-arrays
Hibridación en soporte (blot):
ADN: Southern blot
ARN: Northern blot
Proteína: western blot
ARN
Proteína
ADN
Técnicas de localización cromosómicas por
hibridación
FISH
Hibridación in situ sobre cromosomas con
sondas fluorescentes
Cariotipo Espectral
Múltiple FISH con sondas específicas
de cada cromosoma marcadas con un
fluorocromo diferente.
Hibridación MASIVA de ácidos nucleicos
(“microarrays”)
• Sondas de
porciones de todos
los genes pegadas a
soporte solido
• Muestras de dos
condiciones
marcadas
fluorescentemente
compiten por la
asociación
Affymetrix U133
> 6 millones sondas
47.000 transcriptos
Síntesis in vitro
de ADN
1. Generación y
marcado de
sondas
de ADN
DNA Polimerasa I
(Fragmento Klenow de la
DNAPol I)
EXO
POL 3’5’ EXO
(5’3’) 5’3’
AMPLIFICACION DE ADN
Reacción en cadena de la polimerasa (PCR)
PCR
Métodos de estudio de la
secuencia del ADN
INDIRECTOS:
DIRECTOS:
Secuenciación
Secuenciación: método de Sanger
H
Secuenciación: método de Sanger
Secuenciación de Sanger
Secuenciació
n: técnicas
masivas
• Permiten:
• Aumentar velocidad de
secuenciado
• Disminuir los tiempos
• Disminuir los costos
• Secuenciación de
genomas completos
• Plataformas:
• Pirosecuenciación
(Roche)
• Illumina/ Solexa
• SOLiD (Applied
Biosystems)
• Helicos Heliscope y
Pacific Biosciences
SMRT (secuenciadores
de moléculas únicas)
Secuenciación Illumina
Secuenciación de tercera generacion