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Universidad Autónoma de

Zacatecas
“Francisco García Salinas”
Unidad Académica de Física

“Attempted DNA extraction from a Rancho La Brea


Columbian mammoth (Mammuthus columbi):
prospects for ancient DNA from asphalt deposits”

David A. Gold,
Jacqueline Robinson,
Aisling B. Farrell,
John M. Harris,
Olaf Thalmann,
David K. Jacobs

Alumno: Natalia Elena Solís de Ávila


Asignatura: Química
Docente: Leticia Pérez Arrieta

Zacatecas, Zac, a 24 de Noviembre de 2017


La preservación del ADN antiguo se ha ido optimizando a través de los años debido a
avances tecnológicos como la amplificación de ADN mediante PCR1 (reacción en cadena de la
polimerasa), que de forma general consiste en la amplificación in vitro de un fragmento de ADN
específico y para llevar a cabo el experimento de amplificación es necesario conocer, al menos
parcialmente, la secuencia del fragmento a amplificar (un gen, una parte de un gen, etc).
Básicamente, se trata de replicar una y otra vez un mismo fragmento de ADN y, para ello, se debe
realizar in vitro lo que hacen las células in vivo para replicar su ADN. Sin embargo, sigue siendo
difícil saber a priori qué muestras son capaces de proveer ADN endógeno para así poder preservarlo
a pesar de su antigüedad.

Los pozos de alquitrán proporcionan una forma única de preservar tejidos antiguos y esto
aporta una fuente valiosa de ADN antiguo. Y el asfalto filtrado de estos pozos en el Rancho La Brea
en Los Ángeles, California, provee uno de los depósitos más ricos del mundo de biota del
Pleistoceno tardío, con más de un millón de huesos recuperados. Pues el asfalto en sí mismo
proporciona un ambiente anóxico e hidrofóbico que teóricamente limita la diagénesis mediada por
agua y preserva los huesos a un nivel donde se pueden fechar radiométricamente y someterse a
análisis de isótopos estables (Marcus y Berger, 1984; Coltrain et al., 2004; Ward et al. al., 2005;
O'Keefe et al., 2009), apuntando que las condiciones pueden ser propicias para la preservación del
ADN.

Ha habido numerosos intentos de extraer ADN del Rancho La Brea pero sólo uno ha tenido
un resultado significativo que fue el ADN de un dientes de sable, Smilodon fatalis, en 1992 por
Janczewski pero se obtuvieron datos diferentes a los estudios morfológicos tradicionales con más
información en secuencia, entonces se concluyó que el ADN conseguido estaba contaminado por el
asfalto del Rancho La Brea de donde se adquirió el esqueleto, sin embargo no se ha replicado ni
seguido el estudio original para probar que el asfalto inhibe la extracción de ADN.

Por otro lado, los restos de mamuts en la biota del Rancho La Brea son tan sólo 36
especímenes que han sido identificados a lo largo del siglo XX y al más nuevo esqueleto
descubierto llamado “Zed” que está relativamente completo se le extrajo suficiente colágeno para
fecharlo mediante radiocarbono y resultó tener 36,770 ± 750 años de antigüedad. Y aunque el
esqueleto no se recupero de una fosa, éste estaba impregnado de asfalto lo cual ofreció una
oportunidad para analizar el porqué del fracaso de anteriores extracciones de ADN del Rancho La
Brea, lo que impulsó la investigación de la que se está redactando.

Para poder estudiar el ADN del mamut en el Rancho La Brea inicialmente se tuvo que hacer
una recolección y preparación de huesos, donde dos muestras fueron recolectadas.

La primera fue una parte central removida de la escápula, ésta se limpió con etanol antes del
muestreo y se pudo ver que la cantidad de asfalto impregnado era menor que lo que normalmente se
encuentra en las muestras extraídas del Rancho La Brea. Tres muestras diferentes fueron preparadas
a partir del material de la parte central de la escápula para probar grados distintos de contaminación
de asfalto. Una se pulverizo con un mortero sin importar la cantidad de asfalto que tuviera. La
segunda extracción, se le removió manualmente el asfalto antes de molerse. Por último, la tercera

1
muestra del hueso se limpió más rigurosamente utilizando un protocolo para muestras datadas con
radiocarbono creado en el 2009.

La segunda muestra se extrajo de un fragmento de costilla y esta costilla no mostró


exposición visible de asfalto pero sí tenía permineralización y había estado un tiempo considerable
en el laboratorio del Museo George C. Page, entonces aún se sometió a un proceso de
descontaminación.

Luego, se tuvo que hacer una extracción de ADN a estas muestras, usando un método
específico para ADN antiguo basado en el de Rohland et al. (2010). Para estas extracciones, se
combinaron 100-250 mg de muestra en polvo con 5 ml de buffer2 de extracción (para 50 ml de
solución: 45 ml de EDTA 0,5 M, pH 8,0, 1,25 ml de proteinasa K (10 mg / ml) y 3,75 ml de
ddH2O). La muestra se agitó y se dejó durante la noche en un rotador. Al día siguiente, las muestras
se centrifugaron durante 2 minutos a 4000 rpm. El sobrenadante se colocó en un tubo falcón nuevo
y se añadieron 0,5 volúmenes de buffer de unión (para una solución de 50 ml: 29,5 g de tiocianato
de guanidina, 5 ml de acetato de sodio 3 mol / l y 23 ml de ddH2O). Entonces se añadieron 100 μL
del buffer de suspensión de sílice. El sobrenadante, el buffer de unión y la suspensión de sílice se
dejaron en un rotador durante 3 horas en la oscuridad y luego se centrifugaron durante 2 minutos a
4000 rpm. El sobrenadante se descartó y el sedimento de sílice se resuspendió en 1 ml de buffer de
unión. La suspensión se transfirió a un nuevo tubo y se centrifugó a velocidad máxima durante 15
segundos. El sobrenadante se descartó y el sedimento se resuspendió en 1 ml de buffer de lavado
(para 50 ml de solución: 25,65 ml de etanol, 1,25 ml de cloruro de sodio, 0,5 ml de 1 mol / l de Tris
pH 8,0, 100 μL de EDTA 0,5 mol / l pH 8,0, y ddH2O a 50 ml). La muestra se centrifugó luego a
velocidad máxima durante 20 segundos y se resuspendió en el buffer de lavado una segunda vez,
seguido de centrifugación a velocidad máxima durante 20 segundos, después de lo cual se eliminó
todo el sobrenadante. El sedimento se secó durante 5 minutos bajo una campana extractora de
humos y se añadieron 50 μl de buffer TE. La muestra descansó durante 10 minutos en buffer, antes
de centrifugarse a velocidad máxima durante 2 min. Se colocaron 48 μl en un tubo nuevo, teniendo
cuidado de evitar la sílice, y esta muestra se usó para los procesos de amplificación aguas abajo.
Para cada preparación de muestra ósea, se intentaron al menos dos extracciones independientes.

Además del antiguo protocolo de extracción de ADN, se hicieron tres extracciones de fenol-
cloroformo (modificadas de Sambrook y Russell 2001) en cada una de las dos muestras de hueso de
mamut, y en un fémur de pollo para un control positivo.

El siguiente paso fue la amplificación del ADN, que inició con los primers3 de PCR que se
diseñaron utilizando el gen mitocondrial citocromo b4 del mastodonte americano (Mammut
americanum), el mamut lanudo (Mammuthus primigenius), el elefante asiático (Elephas maximus)

2
Buffer, es una mezcla en concentraciones relativamente elevadas de un ácido y su base conjugada, es decir, sales
hidrolíticamente activas. Tienen la propiedad de mantener estable el pH de una disolución frente a la adición de
cantidades relativamente pequeñas de ácidos o bases fuertes.
3
Primer, es una cadena de ácido nucleico o de una molécula relacionada que sirve como punto de partida para la
replicación del ADN.

4
Citocromo b, es la subunidad principal de los complejos transmembrana b6f y bc1 que forman parte de la cadena
respiratoria de eucariotas y procariotas aeróbios
y el elefante africano (Loxodonta africana). Luego, el proceso de PCR se llevó a cabo que por lo
general consiste en una serie de 20 a 35 cambios repetidos de temperatura llamados ciclos; cada
ciclo suele consistir en 2-3 pasos a diferentes temperaturas. La PCR común se realiza con ciclos que
tienen tres pasos de temperatura. Los pasos de ciclos a menudo están precedidos por un choque
térmico (llamado "hold") a alta temperatura (> 90 °C), y seguido por otro hold al final del proceso
para la extensión de producto final o el breve almacenaje. Las temperaturas usadas y el tiempo
aplicado en cada ciclo dependen de gran variedad de parámetros. Estos incluyen la enzima usada
para la síntesis de ADN, la concentración de iones divalentes y de los dNTP en la reacción, y la
temperatura de unión de los cebadores, así como la longitud del ADN que se desea amplificar.

Para realizar la técnica se necesitan: los 4 desoxirribonucleótidos-trifosfato (dNTP),


sustratos para polimerizar nuevo ADN; dos cebadores o iniciadores (en inglés, primers),
oligonucleótidos que son, cada uno, complementarios a una de las dos hebras del ADN que
delimitan la zona de ADN a amplificar; Iones divalentes que actúan como cofactores de la
polimerasa; iones monovalentes; un buffer que mantiene el pH adecuado para el funcionamiento de
la ADN polimerasa; ADN molde, que contiene la región de ADN que se va a amplificar y por
último un termociclador, el aparato que mantiene la temperatura necesaria en cada una de las etapas
que conforman un ciclo.4

Sin embargo, después de todo este proceso de recolección de muestras, extracción de ADN
y amplificación de ADN, resultó que ninguna de las muestras extraídas de la parte central de la
escápula amplificó los productos de PCR, incluidos tanto los primers diseñados para dirigirse al
ADN de mamut, como los primers universales 12S. El fragmento de costilla amplificó los productos
de PCR de mamut específicos "70-bp" y "120-bp", pero no tenían el tamaño predicho. Cuando estos
productos de PCR se secuenciaron, no coincidieron con el ADN mitocondrial animal, sino que
mostraron un bajo soporte de valor e frente a un pequeño número de microbios. Tampoco se pudo
amplificar la secuencia 12S mitocondrial a partir del fragmento de costilla, lo que sugiere que si
quedan fragmentos de ADN endógenos tienen menos de 153 pb de longitud o están de alguna
manera dañados y resistentes a la amplificación.

Los resultados más informativos fueron los intentos de amplificar el ADN de un fémur de
pollo moderno. Pues el ADN se amplificó fácilmente a partir del hueso de pollo utilizando una
extracción estándar de fenol-cloroformo, cuando el mismo material se limpió utilizando el
protocolo diseñado para eliminar el asfalto, la amplificación por PCR falló. Esto sugiere que los
reactivos típicamente utilizados para limpiar las muestras de Rancho La Brea eliminan el ADN de
las muestras o inhiben la extracción / amplificación de ADN mediante cualquiera de los métodos de
extracción.

Por otra parte, se probó amplificar ADN de pollo se combinado con ADN de omóplato de
mamut, antes o después de la extracción de ADN. Entonces cuando el ADN del pollo se extrajo de
forma independiente y se añadió al ADN de mamut antes de la amplificación por PCR, se pudo
recuperar los productos PCR universales en todas las diluciones. Sin embargo, si el hueso de pollo
se combinó con el material de mamut antes de la extracción de ADN, ninguna de las extracciones
amplificó un producto de PCR. Esto sugiere fuertemente que los productos químicos presentes en el
material de hueso de mamut inhiben la extracción de ADN.
Se puede decir que el ADN antiguo es evidentemente difícil de trabajar; extraer material
genético de un fósil es impredecible, nada es seguro. Los resultados de este estudio sugieren que un
obstáculo importante para cualquier intento de extraer muestras de ADN recuperadas de Rancho La
Brea, o cualquier depósito de asfalto con fósiles, será encontrar una forma de eliminar el asfalto sin
eliminar o dañar el ADN. Asimismo, el ambiente en el sur del California del Pleistoceno tardío
probablemente no es propicio para la preservación del ADN antiguo, e incluso si lo fuera, la
contaminación asfáltica inhibe la extracción de muestras impregnadas de asfalto utilizando técnicas
de extracción actuales.

Referencias

Artículo científico utilizado: Attempted DNA extraction from a Rancho La Brea Columbian
mammoth (Mammuthus columbi): prospects for ancient DNA from asphalt deposits.

Gold D., Robinson J., Farrell A., Harris J., Thalmann O., & Jacobs D.. (2014, enero 11).
Attempted DNA Extraction From La Brea Mammoth . Ecology and Evolution, I, 8. 2017,
noviembre 23, De Wiley Online Library Base de datos.

[1] PCR

http://www.ugr.es/~mgarrido/PCR.htm

Joseph Sambrook and David W. Russel (2001). Molecular Cloning: A Laboratory Manual
(3rd ed. edición). Cold Spring Harbor, N.Y.: Cold Spring Harbor Laboratory Press.