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Una vez efectuada la extensión del frotis debemos dejar secar al aire la
preparación.
Cuando la preparación está seca, la superficie del frotis pasa de ser brillante a
mate.
El secado se puede acelerar calentando ligeramente la parte inferior del porta.
Fijado:
TINCION SIMPLE
Se basa en la afinidad del colorante por
los componentes celulares. La tinción
puede ser uniforme o presentar algunos
gránulos en su interior. Utiliza un solo
colorante (azul de metileno, violeta de
genciana, fuscina diluida). La tinción
simple se utiliza para destacar el microorganismo completo para que se vean las
formas y las estructuras celulares básicas. En las tinciones simples se usa un único
reactivo, que preferentemente es de tipo básico y contiene un cromógeno
(compuesto que da color al tinte) con carga positiva, ya que la pared celular de las
bacterias posee componentes con carga negativa que atraen y enlazan el
cromógeno. Se utilizan solamente para incrementar el contraste; todas las células
absorberán el colorante y quedarán teñidas del mismo color. Por tanto, la tinción
simple mejora la observación de la célula completa.
TINCION NEGATIVA
Es una técnica que permite contrastar las
muestras mediante una sustancia opaca a
los fotones (microscopía óptica) o a los
electrones (microscopía electrónica). Este
método de tinción utiliza colorantes neutros
o ácidos ya que tienen poca afinidad por la
célula bacteriana.
La tinción negativa facilita las observaciones
de la morfología y tamaño de las bacterias,
así como la observación de la cápsula en
algunas especies bacterianas. La cápsula
es una estructura superficial mucosa, más o menos gruesa que envuelve la pared
celular formada por polisacáridos o polipéptidos, que confiere protección a las
bacterias contra la desecación y la fagocitosis. A consecuencia de su elevado
contenido en agua, se tiñen débilmente por los colorantes.
TINCIONES DIFERENCIALES
Consisten en aplicar una combinación de colorantes, mordentes y decolorantes que
permiten poner de manifiesto alguna diferencia importante en la composición de los
microorganismos. De este modo, se pueden distinguir microorganismos que aun
cuando tengan igual morfología, presenten diferencias en su composición química.
Las dos tinciones diferenciales más importantes que se aplican en bacteriología son
la de Gram y la de Ziehl Neelsen. Usando cualquiera de éstas es posible clasificar
a las bacterias por lo menos en dos categorías ya que las células resultarían
positivas o negativas con respecto a la tinción empleada.
Las tinciones diferenciales presentan las siguientes características:
Se necesita de fijación previa generalmente por calor.
se utilizan dos colorantes siendo el ultimo colorante el de contraste
Nos permite visualizar su morfología otras características como puede ser la
composición de la pared bacteriana. Dentro de las tinciones diferenciales
tenemos:
Tinción de Gram: también conocida como
coloración de Gram, es una técnica de
laboratorio que se utiliza rutinariamente en los
estudios microbiológicos de las bacterias. Fue
diseñada por Christian Gram, un científico
danés, en el año 1884. El objetivo de Gram era
conseguir una prueba con la que fuera posible
diferenciar diferentes grupos de bacterias para
así poder estudiarlas y clasificarlas. La prueba
resultó todo un éxito y pronto se convirtió en
una técnica muy útil no solo para el estudio de
las bacterias, sino también para poder identificarlas rápidamente en una
infección y seleccionar el antibiótico más adecuado para tratarla. Es el método
más empleado en bacteriología gracias a esta tinción las bacterias se pueden
clasificar en dos grandes Grupos (Gram+, Gram-). La técnica se basa en aplicar
una serie de colorantes a una muestra de cualquier origen que supuestamente
contenga bacterias no identificadas. Los colorantes tiñen la pared de las
bacterias de color morado y, tras unos minutos, se realiza un lavado del
colorante. Después de eso puede que el colorante permanezca en la pared
bacteriana o que se haya ido. En el primer caso permanecería el color morado,
y se trataría de bacterias Gram positivas y, en el segundo, la pared tendría un
color rosado, y serían Gram negativas.
PROCEDIMIENTO
Realizar los siguientes procedimientos de acuerdo con las muestras biológicas
indicadas por el docente.
1. TINCIÓN DE GRAM:
Para Escherichia Coli.
Tomar un porta
Agregar una muestra Extender la muestra y
objetos y agregarle
de E.Coli, fijar.
una gota de solución
homogenizar.
isotónica.
Teñir:
decolorar con alcohol- con cristal violeta
Agregar lugol (1 min)
acetona y lavar con (1min) y lavar la
y lavar la muestra.
h20. muestra.
Montar el
Realizar las
microscopio en
respectivas
4x,agregar aceite de Obsevar
anotaciones de las
inmersión para luego
imagenes observadas.
enfocarlo en 100x.
PARA STAPHYLOCOCCUS
Teñir:
decolorar con alcohol- con cristal violeta
Agregar lugol (1 min)
acetona y lavar con (1min) y lavar la
y lavar la muestra.
h20. muestra.
Montar el
Realizar las
microscopio en
respectivas
4x,agregar aceite de Obsevar
anotaciones de las
inmersión para luego
imagenes observadas.
enfocarlo en 100x.
2. TINCIÓN SIMPLE:
(VINAGRE)
Teñir:
Observar al
Explicar las microscopío con Con azul de metileno,
observaciones. obejetivos de 4X y por 1 minuto, lavar
100X. con H2O y secarla
muestra
3. TINCIÓN NEGATIVA:
Observar al
Tomar un porta
microscopio y Secar la muetra con el
objetos y expandir la
explicar las secador.
muestra.
observaciones.
ANALISIS Y RESULTADOS
1. TINCIÓN DE GRAM: Para Escherichia Coli.
Mientras que las Gram positivas poseen una capa gruesa de peptidoglicano con
abundantes entrecruzamientos lo que parece contribuir a la retención del colorante
fundamental, cristal violeta, es decir que no tienen su capa susceptible a la acción
de solventes orgánicos, se deshidratan los poros y se cierran, por lo tanto, se retiene
el complejo cristal violeta y por consiguiente el color azul-violeta.
Podemos decir que durante este procedimiento tras fijar la muestra y dejarla secar,
en el microscopio se logran observar bacterias con dos tipos de morfología, pues
se ven cocos y bacilos. Las primeras se observaron en filamentos organizados en
forma de cadena. se trataba de varios cocos unidos entre sí a lo largo de un eje, y
las segundas se observaron solas o formando diplo bacilos, pues estaban dos
unidas o próximas entre sí.
Estas bacterias fueron visibles debido a que sólo dos tipos de bacterias son las
encargadas de la fermentación para obtener yogur, Streptococcus thermophilus y
Lactobacillus delbrueckii subsp. Bulgaricum. Gracias a estas bacterias, que se
encuentran activas en el producto final, la lactosa de la leche se transforma en ácido
láctico. Ahora bien, la característica que hace Streptococcus thermophilus sean
parte fundamental en la fabricación del yogur es que son facultativas, es decir,
pueden desarrollar un metabolismo aerobio o anaerobio. En este concreto caso las,
Streptococcus thermophilus de acuerdo con Bartow (2010) desarrollan un
metabolismo anaerobio mediante el cual fermentan el piruvato en ácido láctico y
acetaldehído, además al ser homofermentativa la mayoría de los productos
formados con la síntesis de piruvato serán lácticos.
Logramos observar que las morfologías para este tipo de bacterias eran en forma
de bacilos con organización de diplobacilos y algunas streptobacilos. Estas
bacterias pueden multiplicarse tanto en condiciones aerobias como anaerobias y
son fácilmente cultivables en medios nutritivos sencillos. Catabolizan glucosa,
lactosa y otros azúcares, mientras que no pueden utilizar urea ni citratos. No se
forma hidrógeno sulfúrico. El rango de crecimiento se sitúa entre 4 y 46ºC. Al igual
que las restantes entero bacterias, las colibacterias son resistentes a las sustancias
tensioactivas.
3. TINCIÓN NEGATIVA:
Para iniciar tomamos un porta objetos y le agregamos una gota de solución
isotónica, seguidamente esterilizamos el asa bacteriológica, lo dejamos enfriar y
tomamos con mucho cuidado una muestra del cultivo bacteriano, luego en un
extremo de la laminilla agregamos una gota de tinta china, que posteriormente
extendimos con la ayuda de un porta objetos, y finalmente secamos la muestra para
llevarla al microscopio para hacer sus respectivas observaciones.
Con el objetivo de 100X observamos lo siguiente:
En esta preparación selectiva pudimos apreciar que la tinción negativa de cápsulas
es una tinción estructural, ya que pone de manifiesto las cápsulas y no tiñe los
microorganismos. Tiñe el fondo de color negruzco y permite ver los
microorganismos sin colorear sobre dicho fondo. Las caracteristicas dinamicas de
las capsulas no permiten que se tiñan concolorantes basicos como el cristal de
violeta o safranina, por tal razón se empleó una tinción negativa con tinta china. La
tinta china es un colorante compuesto por particulas finas de carbono suspendidas
en agua formandose un coloide, las particulas son demasiadas grandes para
penetrar a traves de la matriz de la capsula, motivo por el cual, solo se tiñe el medio
circundante, las celulas se mostraron sin teñir sobre un fondo decolor negro.
DISCUSIÓN DE RESULTADOS
R/: Las bacterias ácido-lácticas se han empleado para fermentar o crear cultivos de
alimentos, su uso más corriente se ha aplicado en todo el mundo a los productos
lácteos fermentados, como el yogur, es por esto que pudimos observarlas en el
microscopio tomando una muestra de yogurt. La acción de estas bacterias
desencadena un proceso microbiano por el cual la lactosa (el azúcar de la leche) se
transforma en ácido láctico. A medida que el ácido se acumula, la estructura de las
proteínas de la leche va modificándose (van cuajando), y lo mismo ocurre con la
textura del producto.
PREGUNTAS COMPLEMENTARIAS
Métodos químicos
Los métodos químicos de esterilización son aquellos que involucran el empleo de
sustancias letales para los microorganismos, tales como el óxido de etileno y el
peróxido de hidrógeno. El uso de este método es muy limitado para la Industria
Alimentaria pero muy utilizado en otras industrias como la farmacéutica.
Métodos físicos
Los métodos físicos son aquellos que no involucran el empleo de sustancias letales
para los microorganismos, sino procedimientos físicos como la radiación ionizante,
el calor o la filtración de soluciones con membranas que impiden el paso de
microorganismos, incluyendo virus. El método más usado en esta categoría es el
calor que mata microorganismos por la desnaturalización de las enzimas; el cambio
resultante en la forma tridimensional de las proteínas las inactiva. La resistencia al
calor varía entre los diferentes microorganismos; esta diferencia puede ser
expresada como el punto térmico de muerte (PTM) el cual se define como la
temperatura más baja a la cual todos los microorganismos en una suspensión
líquida serán eliminados en 10 minutos.
Otro factor que debe ser considerado en una esterilización es el tiempo requerido.
Este puede expresarse como el tiempo de muerte térmica (TMT), el cual es el tiempo
mínimo para que toda bacteria en un cultivo líquido en particular sea exterminada a
una temperatura determinada.
Ambos PTM y TMT son guías útiles que indican la severidad del tratamiento
requerido para matar a una población de bacterias dada. El tiempo de reducción
decimal (TRD, o valor D) es el tercer concepto relacionado con la resistencia
bacteriana al calor. TRD es el tiempo, en minutos, en el cual el 90 % de una
población bacteriana a cierta temperatura será eliminada los tratamientos, térmicos
en resumen, son métodos para conservar los alimentos.
Métodos térmicos
Los métodos térmicos suelen englobar todos los procedimientos que tienen entre
sus fines la destrucción de los microorganismos por el calor. Los métodos son tanto
la pasteurización como la esterilización, cuya finalidad principal es la destrucción
microbiana, como al escaldado y a la cocción, procesos en los que también se
consigue una cierta reducción de la flora microbiana, pero que sus objetivos
principales son la variación de las propiedades físicas.
R/: Con la tinción negativa lo que se tiñe es el medio, el colorante no penetra porque
tiene carga negativa. En este caso las células no están coloreadas. La imagen es
similar a las del campo oscuro, que se ven objetos más pequeños, la morfología
externa, los apéndices, etc. La Tinción negativa es un modo satisfactorio de
aumentar el contraste de las células en la microscopia óptica, pero su máxima
utilidad está en revelar la presencia de cápsulas alrededor de las células
bacterianas. Se usa in colorante sin afinidad a las células ya sea tinta china,
formando una estructura coloidal con el medio, y no se pegan a las células.
6. Investigue otra técnica de tinción selectiva que permita observar estas
estructuras bacterianas.
R/: Otra técnica de tinción selectiva que permita observar las estructuras
bacterianas son la tinción ácido alcohol resistente (Ziehl – Noelsen); se usa para
determinar la presencia de bacterias de los géneros Mycobacterium y Nocardia. Se
basa en la resistencia de estas bacterias a ser decoloradas con una mezcla ácido-
alcohol, se debe a la alta concentración de lípidos de su pared, ácidos micólicos.
Neumococos
Streptococcus
Xhantomonas
Corynebacterium
CONCLUSIÓN
Durante este experimento pudimos observar las diferentes formas que tienen las
bacterias, logramos clasificar distintos tipos de microrganismos y sus estructuras a
través de la afinidad del colorante cristal violeta, también se logró aprender a realizar
algunos de los métodos que existen para cultivar bacterias y de esta manera
observar sus características tanto macroscópicas como microscópicas e
interpretación de las mismas, con lo que se observó que para cada bacteria existen
características diferentes que son las que las identifican y diferencian de otras
bacterias, por lo que de esta manera se le puede llegar a identificar con su correcta
siembra y observación para análisis posteriores o simplemente para la identificación
de una bacteria en algún medio u organismo.
Por otro lado, los microorganismos deben ser manejados con precaución y
alrededor de la llama por su potencial patogenicidad y para observar las
preparaciones en el microscopio óptico siempre tenemos que realizar de forma
correcta todos los pasos para tener un buen enfoque de nuestra muestra.
Los hongos y levaduras pueden utilizar ciertos sustratos como pectinas, carbohidratos como
polisacáridos, ácidos orgánicos, proteínas y lípidos. También pueden causar problemas a través
de: (a) síntesis de metabolitos tóxicos (micotoxinas), (b) resistencia al calor, congelamiento,
antibióticos o irradiación y (c) habilidad para alterar sustratos no favorables permitiendo el
crecimiento de bacterias patógenas. Pueden también causar malos olores y sabores y la
decoloración de las superficies de alimentos.
OBJETIVOS
Adquirir los conocimientos básicos para la manipulación de hongos filamentosos y técnicas
de cultivo.
Describir las características morfológicas macroscópicas y microscópicas e identifique
algunas especies de hongos.
Reconocer y diferenciar las distintas estructuras (micelios, hifas, esporas, etc.) de los hongos
unicelulares y pluricelulares, por observación microscópica en fresco.
EQUIPOS Y MATERIALES
Formas de crecimiento
1. Levaduras (unicelulares)
Formas unicelulares esféricas o elípticas cuyo tamaño varía entre 3-15 µm.
Se reproducen principalmente por brotación que puede dar origen a la formación de
seudohifas (cadena de levaduras) cuando la célula brotada no se separa de la célula
madre.
En medios con agar se desarrollan luego de 1 a 3 días dando colonias pálidas y opacas
con un diámetro entre 0.5 a 3 mm, algunas especies tienen pigmentos característicos,
pero en general son de color crema.
Microscópicamente la mayor parte de las especies de levaduras se diferencian muy poco
y son necesarias pruebas fisiológicas para su identificación.
Micelio no tabicado
LA LEVADURA
Las levaduras son hongos que crecen generalmente por gemación, en forma de agregados sueltos
de células independientes, que pueden ser globosas, ovoides, cilíndricas o alargadas. En algunos
casos, forman cadenas de células alargadas (pseudohifas), adheridas de modo suelto
(blastospora), semejantes a un micelio, por lo que se les denomina pseudomicelio. Algunas
especies forman breves extensiones de verdadero micelio, con frecuencia septado (tabicado).
Hay especies de levaduras esporógenas. No existe, por tanto, un límite de separación definido
entre levaduras y otros hongos que forman un micelio típico. Algunos hongos patógenos para el
hombre presentan dimorfismo, pueden existir en la naturaleza en forma de levadura (forma
parasitaria) o en forma filamentosa (forma saprófita). Las levaduras, cuando crecen sobre medios
sólidos, forman colonias de aspecto característico que recuerdan a las colonias bacterianas. En
casi todas las especies de interés industrial, el modo habitual de reproducción vegetativa es por
gemación. A diferencia de los mohos, las levaduras no pueden identificarse solamente por sus
caracteres morfológicos; se precisa la ayuda de pruebas bioquímicas para la identificación
específica.
PROPIEDADES FISIOLÓGICAS.
En comparación con la mayoría de las levaduras y de las bacterias, la mayoría de los mohos
necesitan menor cantidad de humedad disponible. Un porcentaje total de humedad por debajo del
14 al 15 por ciento en la harina o en algunos frutos secos impedirá o retardará mucho el
crecimiento de los mohos. Los mohos podrían considerarse mesófilos, es decir, que son capaces
de crecer bien a temperaturas normales. La temperatura óptima de la mayoría se encuentra
alrededor de los 25 a 30°C, aunque algunos son psicrótrofos y algunos son termófilos. Son
aerobios, esto es cierto por lo menos en los mohos que crecen en la superficie de los alimentos.
Casi todos los mohos son capaces de crecer dentro de un amplio intervalo de pH (pH
comprendido entre 2 y 8.5), aunque la mayoría crece mejor a pH ácido. Son capaces de utilizar
muchos tipos de alimentos, que van desde sencillos a complejos. Poseen enzimas hidrolíticas, y
de aquí que algunos se utilicen para la producción industrial de las amilasas, pectinasas,
proteasas y lipasas.
Observar en el microscopio a
Cubrir el porta objeto y secar.
4x, 10x y 40x.
3. Levadura
Observar en el microscopio a
secar
4x, 10x y 40x.
ANÁLISIS Y RESULTADO
Esta práctica de laboratorio se llevó acabo en dos momentos, en el primero se hizo la descripción macroscópica de los hongos
filamentosos que utilizamos en la práctica y obtuvimos la siguiente información:
TIPO DE HONGO Descripcion FORMA TAMAÑO TIPO DE ASPECTO COLOR DEL MEDIO
COLONIA DEL MICELO Y DE
MICELO ESPORAS CULTIVO
FUSARIUM SP Es un hongo filamentoso
aislado de plantas y suelo. Se
encuentra como microbiota
normal en arroz, frijol, soya y
otros cultivos. Además de ser
Plana Ilimitado Sabouraud Algodonosa Blanco a rosada PDA
un contaminante común y
salmón
fitopatógeno, las especies
de Fusarium pueden causar
varias infecciones en humanos,
como infecciones oportunistas
sistémicas e infecciones
superficiales como
onicomicosis. Este género
contiene más de 20 especies de
las cuales las más comúnmente
aisladas son F. solani, F.
oxysporum y F. moniliforme.
TRICHODERMA Es un hongo filamentoso que
pertenece al grupo de los
ascomicetos, en los que la
mayoría de las especies no
tienen un periodo sexual, De anillos
simplemente producen esporas con un
asexuales. Este hongo se sistema de
caracteriza por predominar en ramas Ilimitado AGAR Algodonoso Blanco verdoso PDA
los ecosistemas terrestres irregular Czapeck
(suelos agrícolas, pastizales, de manera
bosques y desiertos) y piramidal.
acuáticos.
Inicialmente tomamos un porta objeto, le agregamos una gota de azul de lactofenol y tomamos
un muestra del hongo Fusarium con el estilete.
Seguidamente colocamos la muestra tomada en el porta objetos, cubrimos y secamos con papel
absorbente los residuos del azul de lactofenol.
Observamos que el micelio está formado por hifas septadas y los conidióforos presentan racimos
en macroconidios, es importante resaltar que este hongo es un extenso género de hongo
filamentoso que se encuentra comúnmente en el sustrato. Debido a la gran variedad de especies
que engloba este hongo podemos clasificarlos según la parte de la planta a la que afecte.
En este procedimiento tomamos un porta objeto, le agregamos una gota de azul de lactofenol y
tomamos un muestra del hongo Trichoderma con el estilete.
Seguidamente colocamos la muestra tomada en el porta objetos, cubrimos y secamos con papel
absorbente los residuos del azul de lactofenol.
4x 10x 40x
Tomamos un porta objetos, le agregamos una gota de azul de lactofenol y tomamos una muestra
del hongo Aspergillo con el estilete. Seguidamente colocamos la muestra tomada en el porta
objetos, cubrimos y secamos con papel absorbente los residuos del azul de lactofenol.
4x 10x 40x
Logramos observar las hifas hialinas septadas y puede tener reproducción sexual (con formación
de ascosporas en el interior de ascas) y asexual (con formación de conidios). Aspergillus es uno
de los principales hongos productores de micotoxinas. Las micotoxinas son metabolitos
secundarios producidos y secretados por el hongo durante el proceso de degradación de la
materia orgánica, como mecanismo de defensa frente a otros microorganismos.
Lo primero que hicimos en este procedimiento fue pegar un pedazo de cinta adhesiva en la fruta
(zapote), seguidamente pegamos la cinta en el porta objetos y le agregamos una gota de azul de
lactofenol. Cubrimos el porta objeto y procedimos a observar en el microscopio en los diferentes
enfoques.
Obtuvimos las siguientes imágenes:
4x 10x 40x
En este procedimiento observamos conidios, coníferas, hifas. Esta fruta posee buenas cualidades
antibióticas y se les atribuye propiedades curativas, que contribuyen a la mejora del sistema
inmunológico. Otro de los beneficios de esta fruta es que ayuda a prevenir la formación de
coágulos en las arterias. Por eso es muy recomendable su consumo para personas con
hipertensión arterial.
2. Observación de levadura
Inicialmente tomamos un porta objeto y le agregamos una gota de solución de levadura,
seguidamente le agregamos una gota de Lugol, cubrimos el porta objetos y observamos en el
microscopio.
Observamos lo siguiente:
4x 10x 40x
Las levaduras existentes en el medio producen colonias esféricas, pálidas y opacas de color
amarillo y crema, de aspecto gelatinoso y de mayor tamaño que las bacterias. También
observamos células de distintos tamaños; las pequeñas corresponden a células recién formadas
por gemación que aún no han alcanzado su tamaño normal y células reproduciéndose por
gemación. El contacto, en algunos casos, entre una célula grande y otra pequeña indica que las
dos células hijas que acaban de formarse por gemación aún no se han separado.
PREGUNTAS DE CONSULTA
•Producción de ascosporas.
• Producción de micelio.
• Color de la colonia.
• Asimilación de nitratos.
• Crecimiento a 37ºC.
• Producción de almidón
-Métodos de reproducción
-Crecimiento
-Tinción
-Pruebas bioquímicas
3. Describa los tipos de esporas sexuales y asexuales que caracterizan a las diferentes
clases de hongos.
R/: Esporas con reproducción sexual: pueden formar estructuras femeninas y masculinas a
partir del mismo micelio o talo; sin embargo, los heterotálicos pueden formar estructuras
masculinas o femeninas, o bien ambas estructuras en el mismo talo, en este último caso pueden
requerir otro individuo compatible. Los hongos del filo Ascomycota se han encontrado genes
ubicados en la misma posición (locus) entre especies heterotálicas, cada gen está flanqueado por
regiones de ADN homologas entre sí, que permiten el reconocimiento y retrocrucamiento entre
los genes compatibles llamados genes MAT, los cuales tienden a ser clusters o grupos de varios
genes. En el caso del filo Basidiomycota, cuando se produce la reproducción sexual se forma un
basidio, cuerpo fructífero o seta contenedora de las esporas sexuales, las cuales pueden ser
dispersadas por el aire, insectos o diferentes presiones mecánicas que dependerán del mecanismo
dispersor de la especie.
4. Describa de manera breve tres problemáticas causadas al hombre por hongos y tres
ejemplos de sus aplicaciones industriales.
* Los hongos causan gran cantidad de enfermedades en plantas y animales y pueden destruir
alimentos y materiales de los que depende el hombre.
* Las levaduras se vienen utilizando desde hace miles de años para la fabricación de pan y
bebidas alcohólicas.
* Entre las especies bacterianas de interés industrial están las bacterias del ácido acético,
Gluconobacter y Acetobacter que pueden convertir el etanol en ácido acético.
CONCLUSIÓN
El Azul de Lacto fenol gracias a sus condiciones químicas permite identificar estructuras
fúngicas.
REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS
Frazier W. & Westhoff D. (1994) Microbiología de los Alimentos. 4ª. ed. Acribia,
España. 23-50.
Beuchat L.R. & Cousin M.A. (2001) “Yeasts and Molds”. In: Compendium of Methods
for the Microbiological Examination of Foods. 4th ed. Downs F.P. & Ito K. (Eds.)
APHA. Washington. 209-215.