Beruflich Dokumente
Kultur Dokumente
Biotecnología Farmacéutica]
[Manual de Laboratorio
[2018]
http://www.unav.es/adi/servlet/Web?nexus=4000006049
Departamento de Bioprocesos
Academia de Biotecnología
Realizado por:
M. en e. Hernán Gortés
M. en C. Flor Selene Villalobos
Dra. Estela Flores Gómez
PROPIEDAD DE :___________________________________
Grupo:________________Equipo:___________________
Manual de Laboratorio de Biotecnologíía Farmaceí utica
2. BITÁCORA 10%
La bitácora tiene como finalidad escribir lo realizado en cada sesión de laboratorio con fecha
para que ésta sirva de guía en la realización del reporte final, deberá llevar:
Titulo 0.5%
Objetivos 0.5%
Hipótesis 1%
Diagrama de flujo de la metodología
con modificaciones al protocolo anotadas a un costado
y puntos críticos marcados con simbología de triangulo
con signo de admiración 2%
Resultados 3%
Discusión 2%
Conclusiones 1%
5. DISCUSIÓN 10%
Consistirá en traer resuelta una guía previa y un cuestionario final el día de inicio de la práctica
y en la sesión de discusión con la finalidad de obtener la participación individual durante la
sesión de discusión.
2
Manual de Laboratorio de Biotecnologíía Farmaceí utica
I. OBJETIVO GENERAL
III. INTRODUCCIÓN
3
Manual de Laboratorio de Biotecnologíía Farmaceí utica
EQUIPO
- Microcentrífuga
- Espectrofotómetro
- Celdas de cuarzo.
- Cámara de Electroforesis
- Campana de extracción
REACTIVOS
- Arena de cuarzo blanca
- Buffer de extracción (100 mM TrisHCl pH 8.0, 20 mM Na2EDTA, 0.5M NaCl, 1% SDS)
- Fenol (25 partes): Cloroformo (24 partes): Isoamilico (1 parte)
- Isopropanol frío
- Acetato de sodio 3.0 M pH 5.2
- EtOH 70 %
- Buffer TE (10 mM Tris-HCl, 1 mM Na2EDTA, pH 8.0)
- Buffer de corrimiento TAE 50X (Trisbase, Ac. acético glacial, Na 2EDTA pH 8.0)
- Buffer de carga (Tris, azul de bromofenol y glicerol)
- Bromuro de Etidio.
- Marcador de peso de 1Kb como control.
4
Manual de Laboratorio de Biotecnologíía Farmaceí utica
V. METODOLOGIA
Método modificado de Chow and Kafer (Fungal Genet. Newsl. 40:25-27) utilizando Arena de
cuarzo blanca usada como agente pulverizante.
17.Decantamos sobrenadante y se deja secar el pellet por 20 min. (si se desea se vuelve a
realizar el lavado)
18.Una vez seco el pellet (ADN) se resuspende en 200 ul de buffer TE ó agua estéril.
5
Manual de Laboratorio de Biotecnologíía Farmaceí utica
Cuando este se encuentra entre 1.8-2.0 la muestra contiene casi exclusivamente ADN.
5.5Realizar Regresión Lineal para el Cálculo aproximado del PM (pares de bases, pb)
a)Gráficar en el eje de las Y, el log 10 del PM (pb) y en el eje de las X, la distancia en cm a cada
banda. Es importante medir de arriba hacia abajo tomando como base el borde superior del gel.
Sacar la ecuación de la regresión lineal y=mx+b, sustituir la distancia a la banda del DNAg y
sacar el antilogaritmo del valor Y para tener el PM en pb.
a) Lleve a cabo un diagrama de flujo del procedimiento efectuado y coloca del lado derecho
la función de cada solución utilizada en el proceso de obtención de ADN.
6
Manual de Laboratorio de Biotecnologíía Farmaceí utica
6. ¿Existen otros colorantes además del Rojo Texas para hacer visible el ADN en el gel de
agarosa?
7. ¿Por que se utilizan celdas de cuarzo y no de plástico para leer ADN en el
espectrofotómetro?
8. ¿Por que se lee el ADN a una absorbancia de 260 y 280 para valorar su pureza?
9. ¿Cómo se llama el equipo que te permite visualizar el DNAg?
10.¿Cuál es el porcentaje adecuado de agarosa para realizar tu gel de acuerdo al PM (pb)?
I. OBJETIVO GENERAL
III. INTRODUCCIÓN
El descubrimiento del grupo sanguíneo ABO en el año 1900 por el científico austriaco Karl
Landsteiner, causó gran entusiasmo en la comunidad científica de la época. Hasta entonces,
7
Manual de Laboratorio de Biotecnologíía Farmaceí utica
toda la sangre se consideraba igual en todas las personas y no se entendían las consecuencias
a menudo trágicas de las transfusiones de sangre.(1).
Los antígenos ABO son glúcidos unidos a proteínas y lípidos de la superficie celular que
sintetizan enzimas glucosiltransferasas polimórficas, cuya actividad varía en función del alelo
heredado. Los sujetos que expresan un antígeno ABO particular toleran ese antígeno, pero los
sujetos que no expresan ese antígeno producen anticuerpos naturales que reconocen el
antígeno. (2)
Los reactivos para tipificar los antígenos del sistema ABO, se basan en anticuerpos
monoclonales producidos por líneas celulares de hibridomas murinos y ofrecen todas las
ventajas de los reactivos monoclonales actuales, es decir, un comportamiento parejo y un
abastecimiento seguro. Dado que estos reactivos no provienen de fuentes humanas, el riesgo
de transmisión de enfermedades tales como Hepatitis o Sida es nulo(3).
En la reacción Ag- Ac, los anticuerpos del sistema ABO son principalmente de clase IgM por lo
que son altamente aglutinantes. Propiedad que se emplea para su identificación (4).
En 1939 LEVINE y STETSON, luego de que una mujer diera a luz un feto muerto, hallan en el
suero de la misma un anticuerpo que aglutinaba a los glóbulos rojos del marido y a los del 80%
de la población ABO compatible.
En 1940 LANDSTEINER y WIENER inyectan hematíes de Macaco Rhesus a un conejo y
observan que éste desarrolla un anticuerpo que aglutina no solo a los eritrocitos del mono sino
que también, a los eritrocitos, del 85% de la población caucásica de Nueva York. Quienes
suponen que se trata del mismo anticuerpo descubierto el año anterior, por lo tanto, proponen
como nombre "Sistema Rh" por analogía con el antisuero producido por el conejo luego de la
sensibilización con el Rhesus. En 1942 utilizan el suero del animal como suero anti-Rh. Se
necesitaron casi 20 años para demostrar que los anticuerpos humanos y los animales no
reaccionaban con el mismo antígeno (Rho), reasignándole a este nuevo sistema el nombre de
LW en honor a sus descubridores; los antígenos de éste sistema son más frecuentes en
individuos Rh-positivos que en Rh-negativos, de allí la concordancia que originó la confusión.
El anticuerpo humano descubierto por Levine y Stetson está dirigido entonces hacia el antígeno
"D" (Rho) del sistema.(5)
Palillos de madera
Frasco gerber con un poco de cloro para desechos de torundas con sangre, palillos.
Un frasco gerber con torundas de algodón con alcohol
8
Manual de Laboratorio de Biotecnologíía Farmaceí utica
V. METODOLOGIA
Toma de muestra
a) Lavarse las manos con agua y jabón (analista y paciente)
b) Preparar la lanceta o pinchador.
c) Masajear colocando el dedo hacia abajo
d) Desinfectar con una torunda con alcohol el dedo que se va a picar con la lanceta.
e)Dejar secar el alcohol y pinchar el dedo de forma rápida en la parte lateral
manteniendo la mano hacia abajo (figura 1).
f)Repartir en un portaobjetos desengrasado previamente de 3 a 4 gotas de sangre de
forma equidistante
9
Manual de Laboratorio de Biotecnologíía Farmaceí utica
Célula
4)¿ Qué tipos de Ig se producen contra estos antígenos ? ¿Qué importancia tienen estos
anticuerpos en el pasaje a través de la placenta de la madre al feto ?
5)- ¿ Qué tipos de reacciones pueden provocar una incompatibilidad de grupo sanguíneo ABO?
6) ¿Qué significa Rh y como se descubrió? ¿Y el Anti D?
10
Manual de Laboratorio de Biotecnologíía Farmaceí utica
1. http://www.medigraphic.com/pdfs/medlab/myl-2009/myl097-8c.pdf
2. http://med.unne.edu.ar/catedras/bioquimica/pdf/guia-11.pdf
3. http://ingemeci.com/productos.html
4. http://microeinmuno.files.wordpress.com/2011/10/grupos-sanguineos-e-
isohemaglutininas.pdf
5. http://www.aathi.com.ar/pdfs/sis_rh_lo_que_hay_que_saber.pdf
6. http://www.galactose.org
7. http://www.joel-sistem-xd.blogspot.mx/2007/10/herencia-gentica-cromosomas.html
8. http://mesa8labd.blogspot.mx/2009/10/pruebas-pretransfunsionales.html
9. http://www.cnts.salud.gob.mx/
De aquí en adelante hay que dar el formato a las prácticas par homogenizar
Práctica 1 y 2 ---Estela
Práctica 5 Screening---- Es la que dejamos que diseñen los alumnos, Estela (ésta me falta)
11
Manual de Laboratorio de Biotecnologíía Farmaceí utica
X. OBJETIVOS ESPECÍFICOS
XI. INTRODUCCIÓN
XII. METODOLOGÍA
PREVIO A LA PRÁCTICA
1.Se selecciona una leguminosa por equipo, pesar 10 g lavar y enjuagar para quitar
carga microbiana
2.Dejar en remojo con sol. salina 0.85% (NaCl) 2 días antes de la práctica, se deben
cubrir las semilla y un volúmen más de sol. salina.
3. El día posterior al remojo descascarillar con las manos limpias las semillas
4. Separar en falcon, 5 ml de agua de remojo, cascarilla y endospermo.
5. GUARDA 2 TUBOS EPPENDORF CON 1 ML DE AGUA DE REMOJO, ESTA MUESTRA
NO SERÁ PROCESADA CON ACETONA
DIA DE LA SESION 1
1. Moler cascarilla y endospermo por separado en un mortero cada uno con 10 ml de sol.
salina 0.85%
2. Filtrar con 2 gasas encontradas Y RECUPERAR 1.5 ML DE CADA MUESTRA EN 2
TUBOS.
3. Centrigugar 10 min a 13 krpm
4. Transferir 500 ul de sobrenadante de cada muestra a un nuevo tubo eppendorf
3. Añadir 1 ml de acetona
4. Mezclamos
5. Dejamos en campana de extracción a que se evapore acetona a temperatura ambiente
6. Se guardan refrigeradas
SESION 2
XIII. RESULTADOS
TAbla 1
12
Manual de Laboratorio de Biotecnologíía Farmaceí utica
- NO HAY
PRESENCIA DE
LECTINAS
+POCA
++MEDIA
+++MUCHA
BRADFORD
LEER A 595 NM
LLENAR TABLA 2
TABLA 2.
13
Manual de Laboratorio de Biotecnologíía Farmaceí utica
ELECTROFORESIS VERTICAL
Preparación de la muestra
10 ul de azul de bromofenol
5 ul de b mercaptoetanol
60 ul de buffer de carga
25 ul de muestra (importante analizar la concentracion de su muestra ya que pueden salir
barridos en lugar de bandas, se recomienda carga la dilucion que entro en la curva tipo)
Discusion de Resultados
Discusión
1. Define una Lectina, fuentes de extracción, tipos de lectinas
2. ¿Por qué acetona en su protocolo de extracción de lectinas? Lipidos
3. ¿Por qué evaporamos la muestra?
4. Que tipo de sangre de se utiliza y por que
5 Fundamento del método
6.Què tipo de proteínas y cuál es la sensibilidad del método
7. Que es la electroforesis SDS-PAGE
8. Fundamento del SDs-PAGE
9.Por que usar acrilamida y no agarosa
10. Identificar el PM de su proteina de lectina
Cuestionario
CONCLUSIONES
14
Manual de Laboratorio de Biotecnologíía Farmaceí utica
OBJETIVO GENERAL
Obtener penicilina por varios sistemas de fermentación
Objetivos específicos
Comparar el rendimiento de la fermentación sólida y la fermentación líquida
Determinar ventajas y desventajas de la extracción del antibiótico
INTRODUCCIÓN
Existen diferentes clases de antibióticos los cuales tienen un valor económico importante
debido a su aplicación clínica, sobre todo en los países como México en el cual actualmente las
enfermedades de etiología infecciosa representan el tercer lugar de causa de mortalidad (1),
siendo los de mayor demanda la cefalosporina , penicilinas y tetraciclinas, estas últimas
representan el 17.5% en ventas del mercado mundial de antibióticos (2) y están considerados
dentro del Cuadro Básico de Medicamentos del Sector Salud.
La producción de tetraciclina se realiza por fermentación líquida con altos costos de operación
lo que se refleja en el valor agregado de los productos, por lo que resulta interesante generar
procesos de producción de antibióticos con aplicación de biotecnologías alternativas que
15
Manual de Laboratorio de Biotecnologíía Farmaceí utica
resulten más rentables como en el caso de la fermentación en estados sólidos o con el uso de
soportes semisólidos, las cuales son ampliamente utilizadas en los países orientales y
presenta ventajas sobre la fermentación sumergida (4)
La fermentación sólida se realiza sobre soportes que generalmente son seleccionados de
acuerdo a sus características , utilización y abundancia regional, siendo México un país con
generación de una gran cantidad de residuos agroindustriales con poca o ningún
aprovechamiento de los mismos, la utilización de estos residuos como soportes en
fermentaciones sólidas para la producción de metabolitos microbianos , representa una
alternativa para su aprovechamiento y una mejora ambiental como económica de las regiones
en las que se producen.
El salvado de trigo por su consistencia y bajo costo, ha sido utilizado como soporte para la
producción de metabolitos en estado sólido de enzimas, ácidos orgánicos.
MATERIALES Y MÉTODOS
Microorganismo . Penicillium Chrysogenum, como productor de penicilina
Inoculo: A un cultivo previamente esporulado de P. chrysogenum se adiciona solución salina al
0.85% hasta obtener una solución de 108 esporas por mililitro, lo anterior puede conseguirse
ajustando a una absorbancia de 0.5 a una longitud de onda de 540nm.
Soporte solido: Salvado de trigo
Medio - Producción de penicilina
Lactosa al 3%
Agua de cocimiento de maíz 5%,
Farmamedia 1%
Minerales: Fosfato de potasio monobásico de 0.3%, fosfato de potasio dibasico 0.2%, CaCl 2
0.01% (preparar por separado). Ajustar a pH 5.0.
Sistema sólido: En matraces erlenmeyer de 125 colocar 5 gramos de salvado, 10 ml del
medio de cultivo. Inocular con el 3% de la solución de esporas y adicionar 5ml de agua estéril
para conseguir una humedad relativa del 58%.
Sistema Células libres o sumergida: En matraces erlenmeyer de 500 mL colocar 200mL del
medio 1 e inocular con 3% de la solución de esporas e incubar a 28°C con agitación orbital de
150 rpm.
Toma de muestra: Se toman una muestra cada 24 horas, en el caso de la fermentación sólida
tomar se toma un matraz cada 24 horas, en caso de la fermentación sumergida se toman 10
ml en condiciones estériles.
Tratamiento de la muestra: En ambos casos de eliminan los sólidos ya sea biomasa y restos
del medio. Para el medio sólido se adiciona agua estéril en una proporción 1:5 agitar durante
10 minutos y filtrar, el filtrado medir el pH y guardarlo en refrigeración para cuantificación de
azucares y antibiótico. En al caso de la sumergida se toman los 10mL y se elimina la biomasa
por medio de filtración o centrifugación el sobrenadante guardar en refrigeración hasta su uso.
Microorganismos
Staphylococcus aureus
Bacillus subtilis
Medios de cultivo
Medio para antibióticos No. 1 agar y medio líquido
Medio para antibióticos No. 2
Diluyente:
Solución Buffer No. 1 ( Disolver 2.0 g de fosfato dibásico de potasio y 8.0 g de fosfato
monobásico de potasio en 1000 ml de agua. Ajustar el pH con ácido fosfórico 18N ó Hidróxido
de potasio 10 N a pH 6.0 +/-0.05)
PROCEDIMIENTO:
16
Manual de Laboratorio de Biotecnologíía Farmaceí utica
RESULTADOS Y DISCUSION
1. Calcule el rendimiento del metabolito con respecto al sustrato
3. Análisis de todos los parámetros en función del las características del soporte utilizado.
CUESTIONARIO
1. Investigar los tipos de fermentación utilizada para la obtención de antibióticos en la
industria
4. Investigar cuales son los microorganismos de prueba para este antibiótico, según la
farmacopea de Estados Unidos
BIBLIOGRAFIA
Bowman, W.C. and M.J. Rand, Farmacología, Ed. Interamericana.
Manuales de Productos Naturales
Farmacopea Nacional de los Estados Unidos
17