INFORME Nº8

“Actividad Enzimática“

CURSO: Laboratorio de Microbiología

PROFESOR: Roberto Ramos

LIMA-PERÚ

2015
 I. INTRODUCCIÓN:

Los microorganismos poseen una variedad de enzimas mucho más amplia que
la encontrada en células eucariotas, especialmente en vías catabólicas. El
conjunto de actividades enzimáticas que exhiben, reflejo de su dotación
genética, define la naturaleza misma del microorganismo, debido a que sus
propiedades fisiológicas dependen de las enzimas presentes.

Para la identificación de una bacteria es importante basarse en la detección

cualitativa de actividades enzimáticas en el microorganismo, que reflejen su
posición taxonómica y permitir su diferenciación de otros géneros y especies
Olivas y Alarcón (2004) nos dicen que las células de los microorganismos al
igual que las de todos los seres vivos, por medio de su metabolismo incorporan
y transforman los diversos compuestos obtenidos del medio ambiente, en
compuestos requeridos para vivir, para su crecimiento y para su reproducción.
En estas transformaciones participan diferentes enzimas que catalizan las
reacciones de oxidación, reducción, hidrólisis, transferencia de grupos,
isomerización y síntesis, dando lugar a la degradación de los compuestos
incorporados (durante el catabolismo) y a la síntesis de nuevos compuestos
(durante el anabolismo). En el siguiente informe, se diferenciará al
microorganismo mediante los productos finales de la acción enzimática.

Objetivos:

 Averiguar la presencia del tipo de enzima que presenta un

microorganismo por medio de la acción de esta sobre un determinado
sustrato.
 La acción enzimática favorece el desarrollo de microorganismos.
 II. MARCO TEÓRICO :

Enzimas: Las enzimas son catalizadores biológicos que permiten que las
reacciones metabólicas ocurran a gran velocidad en condiciones
compatibles con la vida. En las células, la actividad secuencial de muchas
enzimas permite que las moléculas se degraden, o bien se formen
moléculas de mayor tamaño a partir de moléculas sencillas. Desde el
punto de vista químico, las enzimas son proteínas globulares, algunas de
ellas con estructura cuaternaria. Para cumplir su función requieren
conservar su estructura nativa, en particular se destaca una región
conocida como sitio activo, que es responsable de catalizar la reacción.
Las enzimas se clasifican de acuerdo al tipo de reacción que catalizan las
enzimas pertenecen a seis grupos que aparecen a continuación:

1. Oxidoreductasas: actúan en reacciones de oxido-reducción y se las llama

también deshidrogenasas.

2. Transferasas: transfieren grupos funcionales de un compuesto a otro. Las

quinasas representan un grupo especializado que transfiere grupos fosfato.

3. Hidrolasas: rompen un enlace adicionando una molécula de agua.

4. Liasas: rompen enlaces por mecanismos distintos a la hidrólisis o la

oxidación. Las decarboxilasas y aldolasas son ejemplos de liasas.

5. Isomerasas: catalizan reacciones de interconversión de isómeros.

6. Ligasas: unen moléculas utilizando energía proveniente del ATP. También se

llaman sintetasas.El nombre de cada enzima hace referencia al sustrato y al tipo
de reacción que cataliza.

 Propiedades generales de las enzimas:

1. Son los catalizadores de las reacciones químicas de los sistemas biológicos

2. Tienen gran poder catalítico

3. Poseen un elevado grado de especificidad de sustrato

4. Funcionan en soluciones acuosas en condiciones suaves de pH y temperatura

5. La mayoría de las enzimas son proteínas

Actividad Enzimática:

La acción de las enzimas es absolutamente necesaria para los sistemas vivos, ya

que las reacciones sin catalizar tienden a ser lentas y las posibilidades que tiene
una molécula de cambiar en un ambiente estable como es el medio biológico,
son muy bajas, de ahí que las enzimas proporción en el medio adecuado para
contrarrestar la lentitud en la realización del cambio. Las reacciones sean
catalizadas o no, dependen para su desarrollo de las leyes termodinámicas. El
principal parámetro que desde el punto de vista termodinámico, permite
deducir si una reacción se desarrolla o no de forma espontánea, es el cambio en
la energía libre de Gibbs, (ΔG) deducido de la segunda ley de la termodinámica
(una reacción es espontánea si la entropía global del universo aumenta), que
mide la capacidad de un sistema para desarrollar trabajo. Para que se realice la
transformación de una molécula, que denominamos sustrato(S), en otra que
denominamos producto (P), el cambio de energía libre de Gibbs ha de ser
negativo, lo que implica que la energía libre del producto ha de ser menor
que la del sustrato. Esquemáticamente, el desarrollo de una reacción enzimática
sencilla consistiría en. En una reacción química la conversión de sustrato en
producto requiere una situación energética intermedia que se denomina estado
de transición, donde el nivel de energía es superior al del sustrato o del
producto. La diferencia entre el nivel de energía basal y la correspondiente al
estado de transición se denomina energía de activación y cuanta más alta sea
menor será la velocidad de reacción. La presencia del catalizador provoca una
disminución en la energía de activación requerida, y de esta forma aumenta la
velocidad con que se desarrolla la misma. Un detalle importante a la hora de
analizar la actividad enzimática, es que en las reacciones catalizadas
enzimáticamente, se incrementa la velocidad de la reacción; pero lo que no se
modifica es el equilibrio de la misma, que sigue las leyes termodinámicas
independientemente de la presencia o ausencia del catalizador. La forma que
tiene la enzima de realizar su actividad catalítica será en primer lugar unirse con
el sustrato, y en segundo lugar facilitar la modificación del mismo para su
cambio a producto.
La molécula o moléculas a modificar se sitúan en una región concreta de la
enzima denominada centro o sitio activo. Esta zona de la enzima es responsable
de las dos propiedades básicas de la molécula: la especificidad y la acción
catalizadora de la proteína. Dentro de todo el conjunto de enzimas les hay que
presentan una alta especificidad, aceptando tan sólo un tipo de moléculas sobre
las que realizar la catalización, y siendo capaces de discriminar incluso entre
moléculas isoméricas; por otro lado, otras enzimas con un menor nivel de
especificidad catalizan reacciones utilizando como sustratos moléculas que
presenten una cierta similitud. La interacción entre enzima y sustrato se realiza a
través de enlaces de naturaleza débil entre la molécula de sustrato y el centro
activo. Cuanto mayor sea el número de estos enlaces, mayor será la
especificidad de la enzima, y mayor también su capacidad de discriminar entre
dos sustratos estructuralmente próximos. La especificidad de las enzimas fue
estudiada ya en 1890 por Fischer mediante el modelo de la llave y la cerradura,
según el cual centro activo y sustrato presentaban morfologías
complementarias que les hacían encajar como una llave y su cerradura.
Actualmente, se conoce que al unirse el sustrato al centro activo, pueden
desarrollarse interacciones entre ambos que producen cambios en la morfología
tanto del sustrato como del centro activo, pasando a considerarse un segundo
modelo (Koshland y Neet) que se denomina modelo del guante y la mano o
teoría del ajuste inducido. A través de este segundo modelo se afirma que los
enlaces no sólo servirían para enlazar sustrato y centro activo, sino para facilitar
la transformación del sustrato en producto
 Técnica de tamizado:

La tamización es un método físico para separar mezclas en el cual se separan

dos sólidos formados por partículas de tamaño diferente.

Consiste en hacer pasar una mezcla de partículas de diferentes tamaños por un

tamiz o cualquier cosa con la que se pueda colar. Las partículas de menor
tamaño pasan por los poros del tamiz o colador atravesándolo y las grandes
quedan atrapadas por el mismo. Un ejemplo podría ser: si se saca tierra del
suelo y se espolvorea sobre el tamiz, las partículas finas de tierra caerán y las
piedras y partículas grandes de tierra quedarán retenidas en el tamiz. De esta
manera se puede hacer una clasificación por tamaños de las partículas.

Es un método muy sencillo utilizado generalmente en mezclas de sólidos

heterogéneos. Los orificios del tamiz suelen ser de diferentes tamaños y se
utilizan de acuerdo al tamaño de las partículas de una solución homogénea, que
por lo general tiene un color amarillo el cual lo diferencia de lo que contenga la
mezcla.

a) Hidrolisis del almidón:

El almidón se deposita en las células formando gránulos cuya forma y
tamaño varían según el vegetal de origen. Este es considerado el
principal hidrato de carbono de la alimentación humana; se encuentra en
abundancia en papas, cereales y en algunas legumbres. (Blanco, 2008)La
hidrólisis es una reacción química entre una molécula de agua y otra
molécula,en este caso almidón, en la cual la molécula de agua se divide
en átomos, estos pasan a formar parte de una nueva especie química; en
este tipo de reacción el agua actúa como disolvente. (Morcillo, 1989)La
hidrólisis del almidón se produce por la amilasa que es una enzima que
actúa
en procesos de digestión de carbohidratos, específicamente actúa sobre
el almidón, enzima glucolítica que se encuentra en la saliva; esta hidroliza
los enlace glucosídicos alfa 1,4 de la fracción amilosa de la molécula de
almidón. Esta desdobla el almidón hasta alfa dextrinas y luego hasta
maltosa. (Morcillo, 1989)

b) Hidrolisis de la gelatina:
Las proteínas que se producen naturalmente son demasiado grandes
para entrar en la célula bacteriana, por lo que primero deben ser
degradadas a polipéptidos y finalmente hasta aminoácidos, que entrarán
en la célula.
 La gelatina, proteína de estructura sencilla, es un colágeno
desnaturalizado que tiene poco valor nutritivo, pero se usa para detectar
la actividad proteolítica. Con este test se determina la capacidad de un
organismo para producir enzimas de tipo proteolítico, gelatinasas, que
licúan la gelatina.

c) Hidrolisis de la caseína:
Los microorganismos que proliferan en el agar leche liberan exoenzimas
hidrolíticas que atacan la caseína desdoblando y produciendo una
sucesión de moléculas de tamaño decreciente hasta aminoácidos libres
(cristaloide).

d) Hidrolisis de los lípidos:

Algunas bacterias excretan lipasas extracelulares que pueden hidrolizar
lípidos grandes en sustratos de bajo peso molecular que son
trasportados al interior de la célula para ser utilizados en el crecimiento.
La mayoría de los lípidos son hidrolizados. El enlace entre el glicerol y los
ácidos grasos son separados dando origen a glicerol y tres ácidos grasos.
El glicerol se fermenta rápidamente para formar ácidos grasos volátiles.
La lipasa es una enzima de la clase de las hidrolasas, que se usa en el
organismo para disgregar los lípidos (grasas) de los alimentos de manera
que se puedan absorber. La degradación de los triacilglicéridos depende
de la actividad de la Lipasa Pancreática (Triacilgliérido Hidrolasa, EC:
3.1.1.3) enzima que se libera al intestino y cataliza la hidrólisis
detriacilglicéridos en las posiciones 1 y 3, formado 2- monoácilglicéridos
y ácidos grasos libres. La enzima, necesita de otra proteína,
llamada Colipasa , que le facilita la unión en la interfase lípido-agua.Para
que la actividad de la lipasa sea significativa se precisa que la grasa forme
una emulsión fina gracias a la acción de la masticación, actividad motora
gástrica, y las sales biliares. Estas últimas tienden a interponerse entre la
lipasa y su sustrato y es necesario un cofactor (colipasa) que permita
actuar a la lipasa. La colipasa se une a la región del enlace ester del
triglicérido y posteriormente a la lipasa mediante interacciones
electrostáticas.Los ácidos grasos y monoacilglicéridos producidos por la
lipasa, y el Colesterol, son absorbidos por las células del epitelio
intestinal, donde se utilizan para volver a formar los triacilglicéridos.Las
lipasas se encuentran en gran variedad de seres vivos, al igual que las
esterasas hidrolizan grasas y aceites en los procesos digestivos; también
están involucradas en el rompimiento y movilización de los lípidos dentro
de las células de un organismo y de la transferencia de lípidos de un
organismo a otro.
III. MATERIALES Y MÉTODOS:

Materiales:

 Medios de cultivo: placas de agar almidón, agar gelatina, agar caseína y agar
grasa.
 Asa de kolle
 Mechero
 Cultivo de microorganismos:
- Bacillus
- E. coli
- Staphylococcus

Procedimiento

 Con un plumón marcador se

Agar caseína Agar grasa dividió la base de la placa
encuatro secciones.

Agar gelatina Agar almidón

Agar Gelatina
  Luego,cada sección se enumeró
como I, II, III yIV. Utilizando la aguja
de kolle(previamente esterilizada),
secolocó una estría de cada cultivo
(Bacillus, E.coli, Staphylococcus) en
uncuadrante, después se invirtió
las placas y se incubó a 37ºC por
24 horas.
 I : Bacillus
 II: E.coli
 III. Staphylococcus
 IV. Control

Después de la incubación, se determinó los resultados de la prueba, de la siguiente

manera:

a) Hidrólisis del Almidón :

Se cubrió la superficie de la placa con solución Lugol.

b) Hidrólisis de la gelatina:
Se cubrió la superficie de la placa con HgCl2 por 5min.

c) Hidrólisis de la caseína:
Sólo se observa el halo de hidrólisis.

d) Hidrólisis de los lípidos:

Se cubrió la superficie con CuSO4 por 5 min.
IV. RESULTADOS Y DISCUSIONES:

Microorganismo Agar almidón Agar caseína Agar gelatina Agar grasa

Bacillus sp +++ +++ +++ -

E. coli - - - -

Staphylococcus sp - - ++ +++

 Dentro del género Bacillus se pueden identificar distintos tipos de

amilasas, de acuerdo a nuestra práctica de laboratorio, el cultivo de
Bacillus nos dio positivo para amilasa. Bacillus licheniformis posee alfa
amilasa que ayuda a la hidrólisis de almidón residual en jugo de caña y
aditivo de cervecería, Bacillus polymixa cuenta con beta amilasa que se
usa para la obtención de almidón con alto contenido de maltosa, usada
para la producción de cerveza (García et al, 1993). Podemos concluir que
el género Bacillus es usado frecuentemente en la industria alimentaria
por la presencia de sus enzimas hidrolíticas.

 La lipasa puede ayudar a la diseminación del microorganismo en los

tejidos cutáneos y subcutáneos. Staphylococcus aureus produce una
lipasa que puede favorecer la colonización de la piel al hidrolizar los
lípidos de las superficies epiteliales (MacFaddin, 2003). Según este autor,
que S. aureus posea enzimas como la lipasa le da el carácter patógeo a
esta bacteria, se pudo comprobar que cuenta con estas enzimas al
cultivar la bacteria en agar grasa, lo que mostró luego del periodo de
incubación un halo de crecimiento mayor y casi exclusivo con respecto a
otras bacterias.

 El cultivo de Bacillus subtilisen condiciones anaerobias en agar nutritivo

caseína (agar nutritivo) es positivo y la hidrólisis del almidón es
positiva porque el bacillus hidroliza e almidón y caseína convirtiéndola
en aminoácidos. (Nakamura, et al., 1999).
 Agar Almidón

Bacillus
Control

 Como se observa en la imagen, la zona clara,blanquesina que aparece en

la sección I donde se colocó una estría de Bacillus sp, es ahí donde se
muestra la presencia de hidrólisis del almidón, aparece un halo grande
alrededor de la bacteria. Esto quiere decir que esta bacteria debe
producir la enzima alfa-amilasa que le ayuda a hidrolizar el almidón
(Guarnizo & Martínez, 2009).

 Se observó también que a medida que pasaba el tiempo, el color azulado

se iba desapareciendo, esto se debió a que el lugol con el almidón
forman un complejo color café-purpura que desaparece cuando el
almidón ha sido degradado.

 En la sección II (E. coli), se observó crecimiento del microorganismo, mas

no hubo halo de hidrólisis. Se observó también una mancha blanquecina
circular, esto se debió a que al momento de colocar la estría de Bacillus,
cayó una parte en esta sección.

 En la sección III (Staphylococcus sp), hubo un crecimiento del

microorganismo, mas no hubo halo de hidrólisis y en la sección IV
(control) no hubo crecimiento de ningún microorganismo.
 Agar Caseína

Control

Bacillus

 En la sección del Bacillus, se observa una zona turbia resaltante, un halo de

hidrólisis alrededor de la colonia indicando la degradación de la caseína.

 Con lo que respecta a la muestra de E. coli, Staphylococcus y control no se

pudo distinguir ningún crecimiento.

 En este Agar se puede apreciar un crecimiento notorio de Bacillus. Para poder

observar la hidrolisis, se debe usar agentes desnaturalizantes de proteínas, el
que se usa comúnmente es el cloruro de mercurio, pero es toxico, por ello no
lo podemos utilizar libremente, es por ello que se utilizó el ácido acético, este
ácido también es desnaturalizante; al desnaturalizar a la proteína, ésta va a
precipitar y alrededor se nota la presencia de la hidrolisis (Olivas & Alarcón.
2004).

Agar Gelatina

Control
Bacillus
 En la sección de Bacillus, se observa un halo grande de hidrólisis de color
blanquecino.

 En este Agar se pudo observar el crecimiento de todas las bacterias, pero

en mayor proporción el Bacillus, al agregar a la muestra ácido acético 5%,
este desnaturaliza a la proteína (Huertas &Riol, 2008) y además Bacillus
presenta el halo de hidrolisis muy notorio esto quiere decir que esta
bacteria tiene la enzima proteasa el cual facilitara la hidrolisis del Agar
Gelatina; En Staphylococcus se aprecia un halo de hidrolisis de menor
tamaño con respecto al de Bacillus, esto nos indicará que el
microorganismo produce la enzima pero no en grandes cantidades. En lo
que respecta a Escherichia coli, no se observó el halo de hidrólisis, pero si
un crecimiento pequeño del microorganismo. En el control no se apreció
ningún tipo de crecimiento.

Agar Grasa

Bacillus

Control

 No se pudo observar el crecimiento de ningún microorganismo, nuestra placa

se contaminó. Pero pudimos observar la placa de otra mesa de trabajo y se
determinó lo siguiente:
 Control

Bacillus

 En la sección del Staphylococcus se observa un color verde azulado, un halo de

hidrólisis, esto indica la producción de la enzima lipasa.

 En la sección de E. coli y Bacillus, se observa crecimiento del microorganismo

pero no halo de hidrólisis.

 En la sección del control, no se observa ningún crecimiento de

microorganismo.

 En este Agar se puede apreciar que Staphylococcus aureus contiene

lipasas, ya que al adicionar el Sulfato de cobre se observó de color
turquesa la parte hidrolizada. La lipasa va a hidrolizar el triglicérido, va a
utilizar los ácidos grasos y luego va a generar butiratos, acetatos y otros
productos metabólicos; estos van a poder formar sales de cobre y
estassales de cobre son las que van a precipitar en el medio con un color
turquesa; por ello vemos de este color la zona donde fue liberada la
lipasa.Además el S. aureuscontiene dos fosfolipasas, una hidroliza el
fosfatidilinositol y el lisofosfatidilinositol; la otra hidroliza la
esfingolmielina (MacFaddin, 2000).
  HIDROLISIS DEL ALMIDÓN:

Harrigan y McCance (1979) señalan que la hidrólisis del almidón se puede

ensayar sobre medios líquidos o sólidos, aunque quizá resulte más conveniente
el agar almidón. y este fue precisamente el que se empleó en la práctica
realizada. Agrega además que si no se ha producido hemólisis, el almidón se
tiñe de azul. Las áreas de hidrólisis aparecen por tanto como zonas claras, como
consecuencia de la actividad de la β-amilasa. Es debido a esto que a partir de las
observaciones luego de adicionar el lugol, podemos afirmar que EscherichiaColi
hidroliza el almidón presente en el medio de cultivo. La enzima que efectúa esta
reacción se llama amilasa. Tanto la α- como la β-amilasa constituyen ejemplos
del tipo extracelular, es decir, se secretan a través de la pared celular para que
degraden sustancias complejas en unidades que puedan penetrar a la célula con
facilidad. (Wistreich yLechtman, 1983)

En los casos donde no se observan estos halos transparentes no se ha dado la

hidrólisis.

 HIDRÓLISIS DE LA GELATINA:

Los microorganismos que degradan las proteínas de este medio de cultivo,

sintetizan gelatinasas. De acuerdo a la prueba realizada, podemos decir que se
efectúo utilizando Agar gelatina de Frazier(modificado). Por lo que la geltina no
hidrolizada forma un precipitado blanco opaco con el reactivo, mientras que la
hidrolizada parece como una zona clara.

A partir de esto, se puede afirmar que en los cuadrantes donde se observaron

estas características, los m.o sintetizan proteasas, siendo así capaces de
degradar las proteínas para su nutrición, obteniendo como productos finales
aminoácidos. (Wistreich y Lechtman, 1983)

La gelatina es una proteína fibrosa que se obtiene al hervir huesos, cartílago y

otros tejidos conectivos que al enfriarse forma un gel. Ciertos microorganismos
tienen habilidad para romper la molécula mediante la exoenzimagelatinasa,
liberando aminoácidos que se usan como nutrientes. La gelatina hidrolizada se
vuelve líquida. (Alarcón, 2001)
  HIDRÓLISIS DE LA CASEÍNA:

Alarcón (2001) indica que la caseína es una proteína encontrada en la leche.

Como todas las proteínas, está compuesta de aminoácidos que son utilizados
por los microorganismos como fuente de energía y de carbono. Cuando la leche
es mezclada con un medio de cultivo, el medio pierde su transparencia y se
vuelve turbio debido a que la caseína reacciona con los iones calcio y forma
complejos coloidales insolubles de caseinato de calcio. Cuando la enzima
caseinasa cataliza la hidrólisis de la caseína, los aminoácidos resultantes se
disuelven en el medio acuosos y el medio se torna de nuevo transparente
alrededor de la colonia del microorganismo. Este fenómeno permite detectar la
degradación de la proteína.

Debido a esto podemos afirmar que solo Staphilococcusspsintetiza las proteasas

requeridas para la degradación del medio.

 HIDRÓLISIS DE LÍPIDOS:

Las grasas son ésteres de glicerina y ácidos grasos que requieren la acción de
enzimas lipasas que hidrolicen los enlaces éster entre ambos compuestos, como
en los triglicéridos, resultando ácidos grasos de cadena larga y glicerol. Las
fosfolipasas hidrolizan los fosfolípidos. En un medio de cultivo sólido con
mantequilla se observa un halo transparente alrededor de la colonia del
microorganismo que hidroliza la grasa. Estas moléculas resultantes son usadas
como fuente de energía y carbono. La hidrólisis de grasa en los alimentos
origina la rancidez, misma que se refleja en el sabor y olor desagradables. En el
medio de cultivo con agar, los ácidos grasos liberados acidifican el medio, lo
que puede detectarse mediante un indicador de pH en el medio. (Alarcón, 2001)

En nuestro caso, para diferenciar aún mejor la actividad de las lipasas, se cubrió
el medio con SO4Cu2, indicando un color verde azulado alrededor de las
colonias la producción de la enzima lipasa. Harrigan y McCance (1979) indican
queeste halo verde azulado aparece como consecuencia de la formación de
sales de cobre insolubles en los ácidos grasos que se liberan al producirse la
lipólisis.De esta forma, podemos afirmar que Staphilococcus sp sintetiza la
enzima requerida para degradar el medio.

Wistreich y Lechtman (1983) señalan que la presencia de lipasa en las funciones

enzimáticas de un microorganismo se puede tomar como un atributo potencial
de su capacidad de invasión ya que las membranas celulares animales se
compone principalmente de lípidos. Esta capacidad de degradación constituye
otra característica de los microorganismos que puede ser útil para su
clasificación.
V. CONCLUSIONES:
 Las bacterias del grupo Bacillus sp, secreta exoenzima amilasa .La
amilasa permite la coloración azul intensa al agregar lugol. Las bacterias
del grupo Escherichia sp. no hidroliza la caseína, aceite, gelatina, ni
almidón.
 Las bacterias del grupo Bacillus sp. presentan exoenzimas caseinasa. Las
bacterias del grupo Staphylococcus sp presentan exoenzimas lipasas.

VI. BIBLIOGRAFÍA:
 HARRIGAN, W.F y MCCANCE M.E. 1979. Métodos de Laboratorio en
Microbiología de Alimentos y productos lácteos. Editorial Academia.
 WISTREICH, G.A., LECHTMAN, M.D. 1983. Prácticas de Laboratorio en
Microbiología. 2da edición. Editorial Limusa.México
 OLIVAS, E. y ALARCÓN L.R. 2004. Manual de prácticas de Microbiología
básica y Microbiología de Alimentos. Universidad autónoma de Ciudad
Juárez. 1ª reimpresión. México.
 GUARNIZO A. & MARTÍNEZ P. 2009. Experimentos de Química Orgánica.
Editorial Elizcom. Colombia. Página 142.
 OLIVAS & ALARCÓN. 2004. Manual de prácticas de Microbiología básica
y Microbiología de alimentos. Primera edición. Editorial UACJ .Página
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 HUERTAS &RIOL. 2008. Manual de Histeroscopia Diagnóstica y
quirúrgica. Editorial Glosa. España. Página 82.
 MACFADDIN. 2000. Pruebas bioquímicas para la identificación de
bacterias de importancia clínica. 3ra Edición. Ed. Médica Panamericana.
España. Pág. 270.
 MACFADDIN J. Pruebas bioquímicas para la identificación de bacterias de
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 GARCIA M., QUINTERO R., LOPEZ A. Biotecnología alimentaria. Editorial
Limusa. 1993
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spizizenii subsp. nov. Int. J. Syst. Bacteriol. 49: 1211-1215.