Biotecnología Ambiental

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Introducción
El crecimiento de células, microorganismos células vegetales y animales, puede tener dos
acepciones, una referida al incremento de la masa celular y la otra al incremento del
número de células; esta última es la válida desde el punto de vista microbiológico. A la vez,
ello puede mirarse bajo dos aspectos o tipos de crecimiento reproductivo: Células
individuales o población de células en crecimiento sincronizado o división estocástica de la
población (división al azar).

Por tanto, la división celular se efectúa luego de un aumento en el tamaño de la célula,

duplicación del núcleo, división celular y de esta manera una célula genera a dos células de
tamaño similar, conteniendo los mismos elementos estructurales y potencialidades.

El crecimiento bacterial se encuentra profundamente influenciado por la temperatura. La

temperatura a crecimiento óptimo permite el crecimiento más rápido de las bacterias
durante un período de tiempo, usualmente entre 12 y 14 horas. La temperatura mínima de
crecimiento es aquella temperatura menor a la cual la especie puede crecer. La Temperatura
de crecimiento máximo es la temperatura mayor en la cual el crecimiento es posible. Los
microorganismos se dividen en 3 grandes grupos en base a su preferencia de rango de
temperatura:
Sicrófilos son capaces de crecer a 0°C o menos, pero crecen mejor a una temperatura
mayor. Estas bacterias son capaces de crecer a 0°C, pero tienen una temperatura óptima de
15°C o menos y una máxima de aproximadamente 20°C. Los sicrófilos estrictos mueren si
se exponen a la temperatura de salón. Un ejemplo de sicrófilos estrictos son las bacterias
que crecen en la Antártica. Aún a una temperatura óptima estas bacterias se tardan en crecer
de 2 a 3 semanas. Los sicrófilos facultativos o sicrotrofos son aquellos organismos que
pueden crecer a 0°C, pero crecen mejor a una temperatura de entre 20 a 30°C.
Los mesófilos crecen mejor a temperaturas que fluctúan de entre 25°C a 40°C. Aquí
encontramos los patógenos de humanos y animales de sangre caliente, éstos crecen mejor a
37°C.
Los termófilos son bacterias que crecen a una temperatura óptima sobre los 45°C. La
región de crecimiento de muchos termófilos se extiende a la región de los mesófilos. Estas
se conocen como termófilos facultativos. La temperatura óptima de crecimiento para estos
últimos microorganismos es entre 50 a 60°C. Los termófilos extremos crecen a una
temperatura mayor de 90°C. Es muy importante señalar que una bacteria no
manifiesta las mismas características de cultivo cuando se crece a diferentes
temperaturas, un ejemplo lo observamos en Serratia marcescens, esta bacteria produce un
pigmento rojo solamente a cierta temperatura de cultivo.

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Laboratorio N°01:“Determinación del Crecimiento Microbiano”

I. Objetivos:

Determinar el efecto de la caseína de la leche en el crecimiento de

microorganismos presentes en una muestra de suelo.
Aplicar las técnicas de siembra adecuadas para lograr la adecuada propagación o
crecimiento de los microorganismos.
Determinar el número de microorganismos viables presentes en una muestra de
suelo.

II. Material y Método:

2. Material:
2.1 Material Biológico:
•1 Kg de suelo (cernido) por mesa.
•Hidrolizado de la caseína de leche.
2.2 Material de Laboratorio:
•Placas Petri estéreles (4)/mesa.
•Pipetas (1 de mL).
•Cocina eléctrica.
•Guantes impermeables.
•Frascos con 4.5Ml de diluyente. 8 por mesa.
•4 Frascos conteniendo 200 mL de agua de caño estéril.
•Espátulas.
•Cernidores.
•Bolsas de plástico.
•Mascarillas.
•Balanza.
•Incubadora.
2.3 Medio de Cultivo:
•Medio de cultivo para recuento (PCA).
•Agua de caño estéril (200 mL aprox.).

Método:
En el método de vertido en placa las suspensiones de células microbianas se diluyen
antes de su siembra en placa. Se sigue esta técnica cuando la muestra contiene tantos
microorganismos, que la dilución no se puede realizar en una sola etapa. Por ejemplo,
una suspensión con mil millones de células por mililitro debe ser diluida 107 veces
para obtener una suspensión con un centenar de células por mililitro, Por tanto, se
realizan diluciones seriadas (en varias etapas), normalmente de diez en diez, pero a
veces de cien en cien. Para realizar diluciones de diez en diez, se añade 1 ml de la
suspensión bacteriana a 9 ml (el medio estéril o solución salina, igualmente estéril).
Se agita vigorosamente para diluir las células y el proceso se repite cuantas veces sea
necesario.

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En el método de vertido en placa, las muestras diluidas se mezclan con agar fundido y
se vierten en placa. Algunas colonias quedarán embebidas en el agar y otras crecerán
en la superficie. Las colonias superficiales se extenderán y serán más grandes.
En esta técnica las placas se incuban hasta la aparición de las colonias. Como en el
método de siembra por estría, no existe la seguridad de que las colonias que aparecen
en las placas sembradas sean cultivos axénicos hasta que se repita el proceso. Presenta
la ventaja de que permiten obtener un mayor número de colonias aisladas que el
método de siembra por estría, por tanto se eligen cuando se ha de seleccionar una
cepa a partir de una mezcla con varios tipos de microorganismos.
Es necesario indicar, que esta forma de siembra no es capaz de poner de manifiesto
todos los microorganismos viables presentes en una muestra, debido a la variedad de
necesidades nutritivas y condiciones físicas exigidas por los diferentes tipos de
microorganismos, por lo cual el recuento en placa proporciona sólo una aproximación
de la población total presente en la muestra.

Imagen obtenida de:

http://aulavirtual.usal.es/aulavirtual/demos/microbiologia/unidades/documen/uni_02/5
6/cap309.htm

III. Procedimiento:

1. Recolectar el suelo con espátula y en un recipiente de plástico.

2. Eliminar el rastrojo, piedras y otros materiales no deseados del suelo.
3. Cernir el suelo hasta obtener aproximadamente 1Kg de suelo cernido por mesa.
4. La mesa N°1, 990 g de suelo solo + 10g de hidrolizado de caseína de leche.
5. La mesa N°2, 980 g de suelo solo + 20g de hidrolizado de caseína de leche.
6. La mesa Nº3, 970 g de suelo solo + 30g de hidrolizado de caseína de leche.

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7. A todos los recipientes con suelo, agregarles agua estéril y colocarle a

temperatura ambiente (20 +/- 3°C).
8. Hacer suspensión del suelo solo (sin el hidrolizado de caseína de leche), hacer
diluciones hasta10-6 y 10-7, sembrar en placas Petri de las dos últimas diluciones
por duplicado e incubar a 45º C durante 48 horas.
9. A las 48 horas, hacer el recuento de UFC/ml del suelo sin hidrolizado de caseína
y tomar muestras de suelo de la mesa 1,2 y 3 (previa homogenización) y hacer
diluciones hasta 10-8 y sembrar las dos últimas diluciones (1 mL), por duplicado
en placas Petri.
10. Agregar agar licuado (PCA a 45°C) en las placas conteniendo las alícuotas
diluidas.
11. Incubar las placas Petri a 40°C por 48 horas.
12. Hacer recuentos de UFC/mL.

IV. Resultados:
En el recuento de placas de la muestra (suelo cernido) sin caseína de leche (al 1% de
concentración), se obtuvieron cuatro recuentos para todas las mesas, dos por cada
disolución: 10-6 y 10-7.

Disolución 10-6 Disolución 10-7

Primera Placa (UFC/g de suelo) 33 * 106 24 * 107
Segunda Placa (UFC/g de suelo) 56 * 106 54 * 107
Promedio 4,45 * 107 3,9 * 108

Pero debido a que el número óptimo de colonias que se han formado debe oscilar
entre 30 y 300 microorganismos, se descarta la disolución de 10-7, quedando como
resultado 4,45 * 107 UFC/g de suelo.

En el recuento de placas de la muestra (suelo cernido) con caseína de leche (al 1% de

concentración), se obtuvieron cuatro recuentos para nuestra mesa, dos por cada
disolución: 10-6 y 10-7.

Disolución 10-7 Disolución 10-8

Primera Placa (UFC/g de suelo) 163 * 107 284 * 108
Segunda Placa (UFC/g de suelo) 435 * 107 --------

Pero debido a que el número óptimo de colonias que se han formado debe oscilar
entre 30 y 300 microorganismos, se descarta la disolución de 10-7, quedando como
resultado 1,5015 * 1010 UFC/g de suelo.

V. Discusión:
Se realizaron diversos conteos de placas, con dos muestras diferentes, la primera
sólo con agua y la segunda con hidrolizado de caseína de leche, con lo cual se

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obtuvo 4,45 * 107 UFC/g de suelo y 1,5015 * 1010 UFC/g de suelo

respectivamente.
En los dos casos, en algunos cultivos, el número de colonias sobrepaso o no
alcanzo el número de colonias permitidas para un aceptable grado de
confiabilidad con respecto al experimento, es decir estuvieron fuera del rango de
30 a 300 UFC/g de suelo.
VI. Conclusiones:

Por medio de esta práctica se logró utilizar la técnica de incorporación. Se

logróaprender y asimilar que el crecimiento microbiano se ve afectado por
diversos factores en nuestro caso reconocimos que el sustrato es fundamental en
el crecimiento microbiano como se muestran en los resultados, un aumento de
casi tres unidades logarítmicas.
El método por incorporación es útil para determinar cargas microbianas bajas,
puede ser utilizado para cantidades mayores pero con diluciones apropiadas,
además posee la principal ventaja de su gran sensibilidad (en un medio y
condiciones de incubación adecuadas) así como el bajo costo; en cuanto a su
desventaja es que el recuento es lento y tedioso y sólo sirve si se aplican las
disoluciones correctas.
VII. Bibliografía:

Crecimiento Microbiano. Consultado el 06 de Mayo del 2012, página web de la

Universidad Interamericana de Puerto Rico, Departamento Ciencias Naturales y
Matemáticas:
http://facultad.bayamon.inter.edu/yserrano/Crecimiento%20Microbiano.htm

Crecimiento Microbiano. Consultado el 06 de Mayo del 2012, de:

http://www.slideshare.net/guested7523/crecimiento-microbiano

Métodos de siembra y cultivo. Consultado el 06 de Mayo del 2012, de:

http://es.scribd.com/doc/36152815/Metodos-de-Siembra-y-Cultivo-Maryyy

El crecimiento de los cultivos axénicos.Consultado el 06 de Mayo del 2012, de:

http://aulavirtual.usal.es/aulavirtual/demos/microbiologia/unidades/documen/uni_02/5
6/cap309.htm

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VIII. ANEXO:

Imagen N°1: Materiales de Trabajo: Imagen N°4: Medio de cultivo para

Espátula, Colador, Táper. recuento (PCA).

Imagen N°2: Hidrolizado de la caseína de

la leche. Imagen N°5: Frascos de Penicilina.

Imagen N°3: Pesado del medio: Imagen N°6: Material de Laboratorio:

Hidrolizado de la caseína de la leche. Placas Petri estériles y pipetas.

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Imagen N°7: Suelo (cernido) con el Imagen N°10:Realización de la siembra

hidrolizado de la caseína de la leche. por incorporación, agregado de la
muestra.

Imagen N°8:Suelo (cernido) humedecido Imagen N°11:Realización de la siembra

con agua destilada. por incorporación, agregado del medio.

Imagen N°9:Suelo (cernido) humedecido Imagen N°12:Conteo de las colonias en

con agua destilada. las placas.

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Laboratorio Nº2:

“EFECTOS DE LA TEMPERATURA EN EL CRECIMIENTO MICROBIANO”

I. Objetivo:

Determinar los efectos del cambio de la temperatura en el crecimiento

microbiano.

II. Materiales e instrumentos:

2.1. Material Biológico:

• Bacillus sp (esporulado, GRAM positivo), en un medio líquido.

2.2. Material de Laboratorio:

• Placas Petri estériles (4)/mesa.

• Pipetas (de 1mL, 2mL y 5mL)/mesa.
• Guantes impermeables.
• Mechero
• Frascos con 4,5 mL de diluyente (16 frascos)
• Mascarillas.
• Incubadora.
• Autoclave.
• Máquina de refrigeración.
• Agua destilada
• Base nitrogenada
• Alcohol yodado
• Asa bacteriológica
• Cloruro de bario (solución salina estéril).

2.3. Medio de cultivo:

• Caldo nutritivo (agar agar).

III. Procedimiento:

1. Contar colonias por turbidimetría según el sistema de comparación Mc.

Farland (1mL de muestra en solución alcalina de BaCl2)

2. Suspensión de la bacteria (2ml), en 25 mL del caldo nutritivo.

3. Refrigeración de la muestra a 10°C.

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4. Esperar 12 horas, tomamos 0.5 mL de muestra, previa homogenización y

hacer diluciones hasta 10^-8 (mesa 1), sembrar las dos últimas diluciones
(1mL), por duplicado en placas petri.

5. Agregar 15 mL aproximado del agar agar (licuado) a 45°C, en las placas

conteniendo las alícuotas diluidas. Las placas Petri dejarlas secar
(solidificación) y llevarlas a incubar.

6. Luego de 24 horas, tomamos 0.5 mL de muestra, previa homogenización y

hacer diluciones hasta 10^-9 (mesa 1), sembrar las dos últimas diluciones
(1mL), por duplicado en placas petri. Y luego realizar el paso (5).

7. Hacer recuentos de UFC/mL.

IV Resultados:

 Recuento del inoculo inicial:

5,16 *10^9 UFC/ mL.

TABLA 1.- Recuento de colonias (en UFC/mL) que se encontraron bajo efecto de
refrigeración previa en la Mesa 1.

DILUCIONES
TIEMPO
10 ^-7 10 ^-8 10 ^-9
12 HORAS 1.91*10^9 10^10 --------
24 HORAS --------- 4.1*10^9 5.3*10^10

Nota: Los datos que se presentan dentro del lapso de tiempo de 12 horas, fue
un promedio de recuento de dos placas por dilución hecha. En el lapso de 24
horas, no se calculó promedios.

TABLA 2.- Recuento de colonias (en UFC/mL) que se encontraron bajo efecto del
cambio de temperaturas (datos de las 3 mesas).

T °C \t (horas) 12 horas 24 horas T °C \t (horas)

Refrigeración (10°C) 1,0 *〖10〗^10 4,1*〖10〗^9 Refrigeración (10°C)
Ambiente (27 ± 0.3 C) 6,2 *〖10〗^9 8,6*〖10〗^11 Ambiente (27 ± 0.3 °C)
Incubación (37° C) 3,78*〖10〗^11 1,84*〖10〗^13 Incubación (37° C)

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Gráfica 1: “Efectos del cambio de la temperatura en el crecimiento microbiano”

Lg X 14

12 Refrigeración (10°C)

10 Ambiente (27 ± 0.3 °C)

8
Incubación (37° C)

6
Log. (Refrigeración (10°C))

4
Power (Ambiente (27 ± 0.3
°C))
2
Power (Incubación (37° C))
0
0 5 10 15 20 25 30
T (horas)

V. Discusión:

En la tabla 1: se puede observar que mientras más se diluyó, hubo mayor

crecimiento microbiano, Bacillus sp. Pero también dentro de los dos lapsos de
tiempo (12 y 24 horas), en la dilución 10−8 ocurrió un decaimiento en el
crecimiento microbiano.

En la tabla 2: podemos observar los valores de recuento a diferentes temperaturas,

y en donde cada una de ellas se evidencia el efecto de temperatura.

Como se observa en la gráfica 1:

- En el crecimiento a temperatura ambiente (27ºC), el crecimiento

mantiene un ligero crecimiento.

- En la incubación (37ºC) el crecimiento microbiano del Bacillus sp se

eleva a comparación de otros efectos observados, está en una
temperatura óptima.

- En el otro caso, la refrigeración (10ºC), hubo un decaimiento de

crecimiento.

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Debemos tomar en cuenta que en el momento de llevar a cabo los recuentos

microbianos, algunos datos se descartaron como es en el caso del lapso de 12
horas, en una dilución de 10−7 , se obtuvo un recuento de 13 colonias, se
descartó porque no pertenece al rango ideal (30-300 UFC/mL).

VI. Conclusiones:

Todos los microorganismos tienen una temperatura óptima de crecimiento. Esto

significa que a determinada temperatura la velocidad de duplicación (o la
velocidad de crecimiento poblacional) de los microorganismos es mayor. En el
caso del microbio esporulado evaluado, Bacillus sp, se puede concluir que su
temperatura óptima se encuentra en el proceso de incubación (37ºC).

Otra de las características la bacteria evaluada, es que tiene una temperatura

mínima, por debajo de la cual las bacterias no se dividen (<10ºC).

Con esta experiencia obtenida, se puede reasumir porque el microbio esporulado

(Bacillus sp), es denominado un microorganismo termófilo.

Hay que tener en cuenta que no todos los microorganismos crecen en el mismo
rango de temperaturas.

VII. Referencias bibliográficas:

Efecto de temperatura y tiempo de almacenamiento sobre la calidad

microbiológica de una bebida pasteurizada formulada a base de un
concentrado de proteínas de lactosuero y harina de arroz, Revista Científica,
FCV-LUZ, Reyes Faría, José.
Consultado el día (4/5/2012) desde:
http://www.saber.ula.ve/bitstream/123456789/27530/2/articulo9.pdf

Agentes físicos, Consultado el día (4/5/2012) desde:

http://www.ugr.es/~eianez/Microbiologia/13agfisicos.htm#_Toc59451620

Efecto de la temperatura, Consultado el día (4/5/2012) desde:

http://es.scribd.com/doc/50964082/11/EFECTO-DE-LA-TEMPERATURA

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VIII. Anexo:

Imagen N°1: Materiales de Trabajo. Imagen N°4: Toma de la muestra del

bacillus

Imagen N°2: Frascos de penicilina. Imagen N°5: Primera Dilución

Imagen N°3:”Bacillus sp.” Imagen N°6: Diluciones.

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Imagen N°7: Siembra por incorporación, Imagen N°9: Tubo de ensayo para la
agregado de la muestra. comparación del sistema MacFarland.

Imagen N°8: Siembra por incorporación, Imagen N°10: Conteo de las colonias en
agregado del medio. las placas.

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ÍNDICE

INTRODUCCIÓN…………………………………………………………………….1
1. Laboratorio N°1: “Determinación del Crecimiento Microbiano”……...…2

I. Objetivos……………………………………………………………….….2
II. Material y Método……………………………………………….…..…2-3
III. Procedimiento……………………………………………..…….3-4
IV. Resultados……………………………………………………..…..4
V. Discusión…………………………………………………………….….4-5
VI. Conclusiones………………………………………………..…….5
VII.Bibliografía……………………………………………………..……….5
VIII. Anexos………………………………………………………..…6-7

2. Laboratorio N°2: “Efectos De La Temperatura En El Crecimiento

Microbiano”…………………………………………………………………..8

I. Objetivos………………………………………………………….……….8
II. Material y Método ……………………………………………….………8
III. Procedimiento………………………………………………..…..…....8-9
IV. Resultados……………………………………………………..…..…9-10
V. Discusión…………………………………………………………..….10-11
VI. Conclusiones………………………………………………..………..…11
VII. Bibliografía…………………………………………………………..…11
VIII. Anexos……………………………………………………….…….12-13

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