INSTITUTO POLITECNICO NACIONAL

Escuela Nacional de Ciencias Biológicas

Unidad Santo Tomas

Departamento de Microbiología

Laboratorio de Genética Microbiana

“Aislamiento y caracterización de DNA”

Profesores
QBP. Ilse Citlalli Calvo Villarreal
M.E. Margarita Pineda López
Dra. Martha Elena Esteva García
Dr. José Antonio Ibarra García

Sección: 1 Equipo: 03
Esquivel Rojas Gustavo
Gallardo Sánchez Daniela
Salgado Sandoval Luis Manuel
Objetivos

 Aislar DNA cromosómico de Escherichia coli W3350 a partir de un cultivo bacteriano en caldo
Luria
 Calcular la concentración y pureza de del DNA obtenido
 Elaborar el espectro de absorción del DNA de Escherichia coli W3350
 Elaborar y analizar la curva de desnaturalización de DNA
 Emplear el programa bioinformático DNAMAN para determinar la influencia de diferentes
parámetros sobre la desnaturalización de oligodesoxirribonucleótidos

Introducción

Los ácidos nucleicos son macromoléculas formadas por monómeros llamados nucleótidos. Por tanto
el DNA es un polinucleótido. Un nucleótido se compone de tres unidades: un azúcar de cinco átomos
de carbono (pentosa), desoxirribosa en el DNA, una base nitrogenada y una molécula de fosfato.

Las bases nitrogenadas presentes en el DNA pertenecen a dos clases. Las bases púricas, adenina y
guanina, contienen dos anillos heterocíclicos, mientras que las bases pirimidínicas, timina y citosina,
contienen un único anillo heterocíclico de seis elementos.

Los nucleótidos están formados por una base nitrogenada unida a un azúcar pentosa por enlace
glicosídico entre el átomo de carbono 1 del azúcar y un átomo de nitrógeno de la base, el marcado
como 1 en una base pirimidínica o el 9 en una base púrica. Una base nitrogenada unida al azúcar, sin
el fosfato, se denomina nucleósido. Los nucleótidos son, por tanto, nucleósidos con uno o más fosfatos.

El esqueleto de un ácido nucleico es un polímero en el que alternan moléculas de azúcar y de fosfato.

Los polinucleótidos contienen nucleótidos que están unidos covalentemente por medio de fosfato entre
el carbono conocido como 3´de un azúcar y el carbono 5´de otro azúcar adyacente. Esta unión se
denomina enlace fosfodiéster porque una molécula de fosfato se une por enlace éster a dos azúcares.
La secuencia de nucleótidos en una molécula de DNA se denomina estructura primaria. Como hemos
dicho, la secuencia de bases en un DNA lleva información y codifica la secuencia de aminoácidos en
las proteínas o codifica RNA específicos ribosómicos o de transferencia.

En el genoma de las células el DNA se presenta en forma de doble cadena. Cada cromosoma contiene
dos cadenas y cada una de ellas está formada por miles o millones de nucleótidos unidos por enlace
fosfodiéster. Las cadenas se asocian entre sí mediante puentes de hidrógeno que se establecen entre
os nucleótidos de una y otra cadena. Cuando las bases púricas y pirimidínicas de cada cadena se
sitúan adyacentes se forman dichos puentes de hidrógeno. Los enlaces más estables de este tipo
ocurren cuando la guanina forma enlace con la citosina y cuando la adenina lo forma con la timina. El
apareamiento específico de adenina con timina y de guanina con citosina significa que las dos cadenas
son complementarias en su secuencia de bases; es decir, cuando en una cadena aparece guanina,
en la otra aparece citosina y lo mismo ocurre con timina y adenina.

En el aislamiento de los ácidos nucleicos debe tenerse en cuenta lo siguiente:

1.- Debe romperse eficientemente la pared y membrana celular para facilitar la extracción del ácido
nucleico deseado.

2.- Se debe trabajar en condiciones que inhiban las nucleas (enzimas degradativas) liberadas durante
el proceso de lisis celular.
El método para aislar DNA, involucra el rompimiento de la pared y la membrana celular, inhibición de
las nucleasas, precipitación de DNA impuro, disociación de proteínas del DNA y re precipitación del
DNA ya purificado.

Resultados
Tabla No 1. Concentración y pureza de DNA cromosómico de Escherichia coli W3350
Equipo As230 As260 As280 Concentración Pureza Concentración Pureza
C=As260nm/ P= 1 Unidad de P=
(Aexb) As260nm/As280nm As260nm DNA 2 As260nm/As230nm
[=]µg/mL cadenas =
50µg/mL DNA
2 cadenas

1 28.107 53.026 27.113 2356.7111 1.9557 2651.3 1.8865

2 6.895 15.191 7.347 675.1555 2.0676 759.55 2.2031
3 11.771 25.454 12.183 1131.2888 2.0893 1272.7 2.1624
4 16.025 46.137 23.351 2050.5333 1.5475 2306.85 2.8791
5 14.520 31.624 15.260 1405.5111 2.0723 1581.2 2.1779
6 10.910 22.757 11.327 1011.4222 2.0090 1137.85 2.0858

Los resultados anteriores, se obtuvieron de la siguiente manera

Ejemplo (equipo 3)

C=As260nm/ (Aexb)
C= 25.454/(22500x1)= 1.1312x10-3 g/mL
1g = 1x106 µg
1.1312x10-3 g = X X= 1131.2888 µg/mL

P=As260nm/As280nm
P= 25.454/12.183
P= 2.0893

C= 1 Unidad de As260nm DNA 2 cadenas = 50µg/mL DNA 2 cadenas

C= 25.454 unidades = Y Y= 1272.7 µg/mL

P= As260nm/As230nm
P= 25.454/11.771
P= 2.1624
 Tabla No 2. Absorbancias a diferentes longitudes de onda del DNA cromosómico de
Escherichia coli W3350
Equipo 1 2 3 4 5 6
Longitud de
onda
220 28.107 6.895 12.575 21.951 16.944 10.910
230 28.107 6.895 11.771 16.025 14.520 10.910
240 33.087 9.537 16.025 28.476 19.717 14.949
250 47.566 13.913 23.058 41.342 28.498 20.857
260 53.026 15.191 25.454 46.137 31.624 22.757
270 42.033 11.935 19.859 36.3337 24.726 17.827
280 27.113 7.347 12.183 23.351 15.260 11.327
290 11.618 3.057 4.097 9.889 6.348 4.917
300 2.267 0.587 0.978 1.841 1.173 1.029
310 0.588 0.143 0.228 0.377 0.245 0.239
320 0.359 0.158 0.152 0.270 0.185 0.253

Tabla No. 3 Absorbancias a

28
26 diferentes longitudes de onda para
24 DNA de Escherichia coli.
22
20 Longitud A
18 de onda
Absorbancia

16 220 12.575
14 230 11.771
12
10 240 16.025
8 250 23.058
6 260 25.454
4 270 19.859
2
0 280 12.183
220 240 260 280 300 320 340 290 4.097
Longitud de onda nm 300 0.978
310 0.228
320 0.152
Figura 1. Espectro de absorción del DNA de Escherichia coli W3350 (Equipo 3)

Oligodesoxirribonucleótidos diseñados

1. Influencia del contenido de GC

Oligo No.1:

Secuencia 5'-CGT AGT CAT GAT CGT ACG TAC GTA AAG TCT GAT GCA ACG T-3'
Complemento 3'-GCA TCA GTA CTA GCA TGC ATG CAT TTC AGA CTA CGT TGC A-5'
Longitud 40
%G+C 65.7
TM (°C) 75.9
Oligo No. 2:
Secuencia 5'-ACG TAC TAG CTC GAT CGA TCG ATT ACG ATC GCT ACG ACG A-3 '
Complemento 3´-TGC ATG ATC GAG CTA GCT AGC TAA TGC TAG CGA TGC TGC T -5´
Longitud 40
%G+C 67.9
TM (°C) 79.2

Oligo No. 3:
Secuencia 5'-TAC GGC TAT CGA TAT AGC TAT CGA TAT ATC GCG CTA TCG A -3 '
Complemento 3´-ATG CCG ATA GCT ATA TCG ATA GCT ATA TAG CGC GAT AGC T -5´
Longitud 40
%G+C 66.9
TM (°C) 77.3

2. Influencia de la variación en la secuencia de nucleótidos

Oligo No.1:
Secuencia 5'- CCC CCC CCC CAA AAG GGG TTT TAA AAG GTT TTT TAA GGG G -3 '
Complemento 3'- GGG GGG GGG GTT TTC CCC AAA ATT TTC CAA AAA ATT CCC C -5 '

Longitud 40
%G+C 50 %
TM (°C) 67.5 ºC
Coeficiente de 380700 L / (mol · cm)
extinción molar.

Oligo No. 2:
Secuencia 5'- CCC CCG GGG GAA AAA TTT TTA AAA ATT TTT GGG GGC CCC C -3 '
Complemento 3´-GGG GGC CCC CTT TTT AAA AAT TTT TAA AAA CCC CCG GGG G-5´
Longitud 40
%G+C 50 %
TM (°C) 68.3 ºC
Coeficiente de 376800 L / (mol · cm)
extinción molar.

Oligo No. 3:
Secuencia 5'- AAA AAT TTT TGG GGG CCC CCG GGG GCC CCC AAA AAT TTT T-3 '
Complemento 3´- TTT TTA AAA ACC CCC GGG GGC CCC CGG GGG TTT TTA AAA A -5´
Longitud 40
%G+C 50 %
TM (°C) 70.1 ºC
Coeficiente de 376300 L / (mol · cm)
extinción molar.
 3. Influencia de la longitud de la secuencia de nucleótidos

Oligo No.1:
Secuencia 5'-GC TAG CTA-3'
Complemento 3'- CG ATC GAT-5'
Longitud 8
%G+C 50
TM (°C) 17.9

Oligo No.2:
Secuencia 5'-GCT AGC TAG CTA GCT AGC TAG CTA GCT AGC TAG CTA GCT AGC TAG CTA GCT AGC TA-3'
Complemento 3'-CGA TCG ATC GAT CGA TCG ATC GAT CGA TCG ATC GAT CGA TCG ATC GAT CGA TCG AT-5'
Longitud 54
%G+C 50
TM (°C) 71.5

Oligo No.3:
Secuencia 5'-
GCTAGCTAGCTAGCTAGCTAGCTAGCTAGCTAGCTAGCTAGCTAGCTAGCTAGCTAGCTAGCTAGCTAGCTAGCTAGCTA-
3'
Complemento 3'-
CGATCGATCGATCGATCGATCGATCGATCGATCGATCGATCGATCGATCGATCGATCGATCGATCGATCGATCGATCGAT-
5'
Longitud 79
%G+C 50
TM (°C) 74.2

Discusión

Para esta práctica, los resultados a evaluar son la concentración y la pureza del DNA obtenido a partir
de una cepa de Escherichia coli. Se determinó concentración y pureza por dos métodos, los cuales
teóricamente deberían llevar a un mismo resultado, pero en la práctica esto no se cumple por varios
aspectos que a continuación se describen:
Determinación de concentración para DNA.
Para este cálculo se utilizaron dos métodos
𝐴 (260 𝑛𝑚) 𝐴 (260 𝑛𝑚) Relacion 1 u A(260nm) 50 µg/mL DNA
Formula (𝐶 = (𝑎𝑒)(𝑏) = (22500)(𝑐𝑚))
Ambos métodos derivan de la Ley de Bouger-Beer, pero la más eficiente para el análisis realizado
con las muestras obtenidas por los alumnos es utilizando la formula, ya que toma en cuenta el paso
de luz de la celda donde se incidió el haz de luz, además esta fórmula engloba a cualquier tipo de
DNA, ya sea monocatenario o bicatenario, y con pureza variable; caso contrario con la relación
matemática, que forzosamente necesita DNA de doble cadena y que sea de alta pureza, es decir que
contenga un mínimo de proteína no interferente y de ser posible que no esté presente en la
determinación, además de contemplar un solo paso de haz de luz, que se vuelve despreciable. Por
tanto el valor de concentración utilizando esta relación será más elevado que utilizando la formula si
lo aplicamos a nuestra muestra, ya que asume que el DNA obtenido es puro y no es fragmentado, lo
cual no sabemos. Para saber que nuestro DNA está intacto, es decir con las dos cadenas unidas, este
DNA desnudo debería ser reinsertado en una bacteria y calcular el porcentaje de expresión del DNA,
y así determinar si este material genético es de doble cadena, sin embargo esto no es de nuestro
interés por el momento, solo queremos saber si está presente nuestro DNA y en qué cantidad.
Estadísticamente hablando, una prueba de hipótesis para la diferencia de medias de ambos métodos
arroja una región de rechazo por debajo de -2.3060 o por arriba de +2.3060, el estadístico de prueba
se encuentra entre los valores intermedios de este intervalo (0.4070), por lo tanto no hay diferencia
significativa que indique una diferencia entre ambos métodos, con lo que pudiera decirse que es
indistinto utilizar un método u otro, sin embargo con base en la experiencia realizada y los resultados
obtenidos podemos decidir que el utilizar la fórmula es el mejor método para la muestra obtenida, ya
que no es un estándar de alta pureza y no se sabe si está en su forma nativa, o en su forma
desnaturalizada.

Determinación de pureza para DNA.

Para determinar la pureza del DNA se realizó un cociente:

𝐴 (260𝑛𝑚) 𝐴 (260𝑛𝑚)
𝑃= 𝑃=
𝐴 (280 𝑛𝑚) 𝐴 (230 𝑛𝑚)
Este cociente , uno para cada método para determinar concentración, relaciona dos características
fundamentales de las proteínas, uno es el enlace peptídico, que al estar en resonancia absorben
energía, y por otra parte los aminoácidos con anillos aromáticos activados, los cuales tiene pares de
electrones en resonancia que estabilizan la carga del anillo. Se esperaría que ambos cocientes dieran
una relación de absorbancia ≥1.8, lo cual indicaría que el DNA obtenido es apto para seguir
trabajándolo, sin embargo notamos que en la experimentación estos resultados difieren de lo
esperado, sin embargo tomando en cuenta las características antes mencionadas, la cantidad de
aminoácidos aromáticos presentes en una proteína es menor a la cantidad de enlaces peptídicos que
esta pueda tener, el enlace peptídico es constante, en cambio los anillos aromáticos activados pueden
o no estar presentes, por ello es más confiable la relación A (260nm)/ A(280nm), que A (260nm)/
A(230nm). Estadísticamente, realizando una prueba de hipótesis para la diferencia de medias de
ambos métodos con un nivel de confianza del 95% se encuentra que no existe diferencia significativa
para ambos procedimientos, ya que el estadístico de prueba arroja un resultado de 0.7120, el cual se
encuentra entre los límites de la región de rechazo que son menores a -2.306 y mayores a 2.306, lo
cual indica que ambos procedimientos son aceptables a la hora de determinar pureza.

En cuanto se refiere al método de aislamiento de DNA, se tiene paso críticos donde puede haber
ruptura de la doble cadena, así como la presencia de contaminantes que alteran la concentración y la
pureza del DNA.
La ruptura celular, uno de los pasos más importantes a la hora de la de la purificación de DNA, ya que
los medio habituales como sonicación, molienda y mezcla pueden ocasionar la ruptura de la cadena
de DNA en pequeños fragmentos (Surzycki, 2003).
En el laboratorio se emplearon métodos químicos para el aislamiento y caracterización de DNA; los
principales compuestos empleados para la lisis fueron enzimas como la lisozima, y algunos
detergentes como el SDS. Este último tiene un impacto importante al desestabilizar las membranas
celulares, mientras las enzimas como la lisozima hidroliza la petidoglicana de la pared celular; una
mala resuspencion del paquete celular no permite una buena lisis celular obteniendo cantidades
mínimas de DNA. Otro de los factores que también pueden influir en la calidad del DNA es el lavado
que se le hace a los paquetes celulares ya que estos pudieran tener células lisadas o enzimas que
pudieran degradar el DNA como las DNAsas y RNAsas.
La utilización de compuestos quelantes como lo es el EDTA nos permite “atrapar” iones divalentes
como el magnesio (Mg++), que son cofactores de algunas enzimas que rompen la doble cadena del
DNA. La adición de sales como el cloruro de sodio, también juega un papel importante a la hora de la
extracción del DNA, posiblemente este sea uno de los factores, por lo cual la cantidad de DNA extraído
fue menor en el equipo tres comparado con los equipos uno y cuatro respectivamente, debiéndose a
que una menor cantidad de sales no permite una buena interacción con los grupos fosfatos de las
cadenas, ocasionando que la molécula no se pliegue así misma de forma eficiente y por ende se
tendría una menor cantidad de DNA precipitado. Según Velázquez et al, 2014 la adición de Sodio o
sales de amonio reduce las fuerza repulsivas entre las cadenas y permite que el DNA se pliegue sobre
sí mismo.

La eliminación de proteínas es el segundo paso para este proceso de purificación una vez que las
células han sido lisadas, se emplean en este caso soluciones orgánicas, que pueden desnaturalizar
las proteínas existentes producto de la lisis celular. Estos compuestos son el fenol, cloroformo y
alcoholes (alcohol isoamílico); el fenol al intercalarse en el núcleo hidrofóbico de las proteínas permite
que su configuración cambie, ocasionando la pronta desnaturalización de la proteína (método de Kirby)
y la utilización de solventes orgánicos como el cloroformo-alcohol isoamílico es para disolver
compuestos apolares como lípidos, proteínas, y/ o compuestos orgánicos de la células bacterianas
(Escherichia coli cepa W3350).

La formación de dos fases a la hora de la extracción de DNA es otro de los pasos críticos ya que al no
tomar adecuadamente la fase acuosa donde se encuentra el DNA, se puede extraer de la fase orgánica
proteínas y otros componentes de contaminación. Posiblemente una menor cantidad del DNA en el
equipo 3, 5 y 6 se debe a la mala extracción de la fase acuosa, dejando un pequeño volumen que
posiblemente pudiera tener una cantidad significativa de DNA.

La precipitación del DNA con etanol al 70 % pudiera de una forma influir en la cantidad obtenida de
DNA en los equipos 3, 5 y 6, comparado con el 1 y 4 que tuvieron mayor cantidad; al estar utilizando
etanol al 70% nos permite eliminar la sales presentes en el medio y precipitar la cadena de DNA, pero
en el método se emplea el doble de volumen que se obtiene para poder precipitar el DNA, a lo cual se
empleó alcohol ismo milico para poder precipitarlo. Un mal manejo de la técnica de la extracción de
DNA puede fragmentar la molécula, teniendo alteraciones en la cuantificación de la misma.

Conclusiones

 Se aisló DNA cromosómico de Escherichia coli cepa W3350, de alto peso molecular.
 Se demostró la influencia de los reactivos en la concentración y purificación del DNA
cromosómico.
 La influencia de algunas características del DNA fueron determinadas mediante el programa
DNAMAN.
 El DNA aislado fue leído en un espectro , realizando un espectro de absorción el cual
corresponde con el espectro teórico, donde el pico máximo de absorbancia es a 260 nm.

Bibliografía

 Madigan M., Martinko J., Dunlap P., Clark D., (2009), Brock “Biología de los microorganismos”,
Pearson Addison Wesley, Duodécima Edición, Pp. 63 y 64
 Cox Nelson, (2009), Lehninger “Principios de Bioquimica”, Omega, Quinta Edicon, Pp. 27-30
 Velázquez LPA, Martínez MdCA, Romero AC. Extracción y purificación de ADN.
Herramientas moleculares aplicadas en ecología: aspectos teóricos y prácticos.
2014:1
Surzycki. S. 2003. Human Molecular Biology. Blackwell Science. Main Street, Malden, MA,
5018, EE.UU. Pp. 3-11