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Einleitung

Durch Ionenaustauschchromatographie soll im zweiten Versuch eine hochreine,


bakterielle Plasmid-DNA gewonnen werden, um diese dann durch Restriktionsverdau
und eine Agarosegelektrophorese zu untersuchen.

Die Ionenaustauschchromatographie ist aufgrund der Wechselwirkungen von positiv


und negativ geladenen Teilchen möglich. Sie eignet sich hervorragend für die
Auftrennung und Aufreinigung von Biomolekülen, da Nucleinsäuren und Proteine bei
bestimmten pH-Werten eine Ladung aufweisen.
Bei der Anionenaustauschchromatographie ist die Trägermatrix bei einem großen pH-
Wertebereich protoniert und somit positiv geladen (z.B. DEAE).
Als negatives Gegenion wird meist Chlorid verwendet, welches durch Austausch die
Bindung eines negativ geladenen Moleküls an die Matrix ermöglicht.
Die Kationenaustauschchromatographie funktioniert mit umgekehrten Ladungen,
wobei als positive Gegenionen Natriumionen verwendet werden, welche gegen
positiv geladene Probenmoleküle an der negativen Matrix ausgetauscht werden
können.
Zu Beginn einer Säulenaustauschchromatographie wird die Säule mit den zu
analysierenden Molekülen beladen. Diese ersetzen die an der Matrix befindlichen
Gegenionen. Bei diesem Schritt kommt es zu einer ersten Fraktionierung des
verwendeten Gemisches, da entgegengesetzt oder schwach geladene Moleküle die
Säule ohne große Verzögerung passieren können.
Nur leicht an der Matrix interagierende Moleküle können daraufhin durch Waschung
abgespült werden. Um als letztes die stark gebundenen Moleküle aus der Säule zu
lösen, werden Inertsalze mit dem ursprünglichen Gegenion eingespült, wobei die
Konzentration an Salzen langsam gesteigert wird.
Bei den verschiedenen Trennschritten an der Säule muss ein geeignetes
Fraktionsvolumen gewählt werden.
Statt einem linearen Ionenstärkegradienten kann auch eine Erhöhung der
Pufferionenstärke oder Änderung des pH Wertes zur Elution verwendet werden.
Bei der Proteintrennung ist stets auf den pH-Wert zu achten, da dieser die Ladung der
Moleküle beeinflusst. Liegt er unter dem Isoelektrischen Punkt, so wird das Molekül
bei einem niedrigeren pH in der Lösung positiv geladen sein.

Neben einem Hauptchromosom weisen viele Bakterien einen zusätzlichen,


extrachromosomalen DNA-Ring, mit oftmals Genen für Resistenzen gegen
bestimmte Antibiotika, auf (Plasmid). Die Plasmide liegen in einer hohen
Kopienanzahl vor und werden besonders in der Gen- und Molekularbiologie genutzt.
Dort werden sie als Vektoren bezeichnet und zur Genexpression, Vervielfältigung
oder zum Einbringen von rekombinanten Plasmiden oder gewünschten
Genabschnitten in Bakterien oder Eukaryoten genutzt.
Für einige dieser Verfahren ist das Isolieren und Reinigen der Plasmide nötig.
Die Isolierung erfolgt durch die Lyse der Bakterien mit Natriumdodecylsulfat in
alkalischem Medium und Denaturierung der Proteine und genomischen DNA mit
einer Kaliumacetat-Lösung. Das Reinigen der kleinen Plasmid DNA ist durch die
Ionenaustauschchromatographie möglich.
Hier interagieren die negativ geladenen Phosphatgruppen der DNA-Grundstruktur
unter relativ niedrigen Kaliumchlorid-Konzentrationen mit den positiv geladenen
Diethylaminoethangruppen, welche sich an der Oberfläche der Trägermatrix
befinden. Durch Waschen mit einem Puffer mittlerer KCl-Konzentration werden
übergebliebene Verunreinigungen entfernt.
Schlussendlich wird die gebundene Plasmid-DNA mit einem Puffer (1M KCl) und
durch pH-Wert Erhöhung von der Säule eluiert.

Restriktionsendonucleasen sind bakterielle Enzyme, welche an Doppelstrang-DNA


palindromische Sequenzen schneiden können. Bei Nucleinsäuren bedeutet Palindrom
eine Basensequenz, die in jeweils komplementären Strängen, von 5´nach 3´oder
andersrum gelesen, dieselben Sequenzen ergibt.
Verwendet werden Restriktionsendonucleasen zum Schneiden von definierten DNA-
Fragmentabschnitten oder zur Analyse von DNA Molekülen.
Bei unterschiedlichen Frequenzen von unterschiedlichen DNA-Bereichen ergeben
sich verschiedene Erkennungsstellen für die Restriktionsenzyme.
Somit werden verschiedene DNA-Bereiche in unterschiedlich große Fragmente
geschnitten, was man durch Agarosegelelektrophorese nachweisen kann.
Hierbei wird die in Wasser erhitzte Agarose in eine Elektrophoresekammer gegossen
um dort abzukühlen und ihre netzartige Struktur auszubilden. Auf die mit einem
Kamm gestochenen Taschen im Gel können dann die zu analysierenden Proben
gegeben und eine Spannung angelegt werden. Die Wanderungsstrecke ist abhängig
von der Molekülgröße. Ein farblicher DNA-Nachweis kann mithilfe des
fluoreszierenden Farbstoffes Ethidiumbromid geschehen. Er absorbiert im nicht
sichtbaren UV-Lichtbereich und emittiert aufgrund des Energieverlustes im
langwelligen, orange-roten Lichtbereich.

Materialien
Auswertung

Um die Reinheit der DNA-Präparation zu bestimmen wird eine Extinktionsmessung


bei 260 nm und 280 nm durchgeführt und der entsprechende Quotient gebildet. Eine
Verunreinigung durch die aromatischen Aminosäuren Tyrosin oder Phenylalanin
(diese Absorbieren bei 280 nm) erhöht den Betrag des Quotienten.
Bei 260 nm erhöht eine Proteinverschmutzung die Absorption.
Der Quotient sollte um die 1,8 liegen, ein niedrigerer Wert weißt auf eine unzulässige
Verunreinigung der DNA-Präparation mit Proteinen hin, ein höherer weißt auf
unerwünschte RNA-Abschnitte hin und muss verworfen werden.

Die durchgeführte Extinktionsmessung ergab für E260nm = 0,2336 und für E280nm =
0,1255.
Die Konzentration der DNA-Präparation berechnet sich wie folgt:

µg µg µg
C DNA=E 260nm∗50 ∗100=0,2336∗50∗100=1168 =1,168
ml ml µl

E 260nm
Für den Quotienten der Extinktionen ergibt sich: E 280nm
=1,861

Der erhaltene Wert liegt im akzeptablen Bereich und die DNA-Präparation kann für
weitere Analysen verwendet werden.

Gelphotographie
Durch Vergleichen der Wanderungsstrecken der erhaltenen Fragmente und dem
aufgetragenen Marker lässt sich das Plasmid identifizieren.

Für Xba I ergeben sich die Fragmentgrößen von etwa 5238 bp und 1058bp, sowie für
Hind III 6296 bp.
Es handelt sich folglich um Plasmid 3 (pTM 201).

Masse der 12 Einzelfragmente der DNA des E.coli-Bakteriophagen Lambda

Die DNA dieses Bakteriophagen wird von den beiden Restriktionsenzymen EcoR1
und HindIII in 12 Fragmente zerlegt.
Die gesamte DNA hat eine Länge von 48052 bp. Obwohl die Anzahl der Fragmente
nach dem Restriktionsverdau nahezu gleich sein müsste, haben die einzelnen Banden
natürlich eine unterschiedliche Masse, anteilig nach der Länge der Fragmente. Dies
hat natürlich dann auch einen Einfluss auf die Fluoreszenzaktivität nach dem
Anfärben. Diese nimmt mit steigender Masse der Banden, also der Länge der
Einzelfragmente, zu.
Setzt man nun 1 μg DNA ein kann man die Masse der Fragmente nun nach der Größe
der Einzelfragmente mit Hilfe folgender Formel berechnen:

xbp
m Bande = *1000ng
48052bp

Länge der Einzelfragmente Masse der Banden


21226 bp 442 ng
5148 bp 107 ng
4973 bp 103 ng
4268 bp 89 ng
3530 bp 73 ng
2027 bp 42 ng
1904 bp 40 ng
1584 bp 33 ng
1375 bp 29 ng
947 bp 20 ng
831 bp 17 ng
564 bp 12 ng
Masse der zur Gelelektrophorese eingesetzten Plasmid-DNA

Nun kann man aus dem Vergleich der Fluoreszenz-Intensität der Banden ihre
ungefähre Masse abschätzen. Dazu muss die Breite der Banden noch in die
Abschätzung einbezogen werden. Da die Banden eher schmal sind und schwach
fluoreszieren, fallen die abgeschätzten Werte eher niedrig aus:

Xba 1 Hind III


Bande 1 ~ 30 ng ~ 100 ng
Bande 2 ~ 3 ng -

Daraus ergibt sich eine ermittelte Gesamtmasse an eingesetzter Nukleinsäure in den


beiden Ansätzen:
Xba 1: 33 ng
Hind III: 100 ng

Diskussion
Der Quotient bei der Reinheitsbestimmung lag im akzeptablen Bereich, jedoch fiel
auf, dass er etwas über dem idealen Wert von 1,8 lag. Vermutlich konnte der Puffer
S1 mit seiner RNAse-Aktivität nicht richtig wirken und die bakterielle RNA nicht
vollständig abgebaut werden. Jedoch konnte die Probe für die Gelelektrophorese
herangezogen werden, da genug Plasmide darin vorhanden waren. Dass eine
genügend hohe Konzentration vorliegt, lässt sich auch anhand des Extinktionswertes
bei 260nm sehen, da dort die maximale Extinktion für DNA erreicht wird. Die
errechnete Konzentration an Nucleinsäure von 1,168 µg/µl ist relativ niedrig, sollte
aber für ein sichtbares Ergebnis bei der Elektrophorese ausreichen.
Dennoch sind die DNA-Banden auf dem Gel äußerst klein ausgefallen, was auf einen
Verlust an DNA vor bzw. beim Auftragen auf das Gel schließen lässt.
Daraus resultieren auch die niedrigen Schätzwerte.
Dennoch war die Identifikation des Plasmids anhand der Markerbanden möglich.

Quellenangabe